Name: Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Poznaj metody izolacji i analizy hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska myszy. Techniki te umożliwiają badanie unikalnych nisz mikrośrodowiskowych wspierających rozwój komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Wyjęcie zarodka i sekcja łożyska
<ol>
<li>Na początek należy wyizolować zarodki z organizmów ciężarnych samic.</li>
<li>Zwierzęta są uśmiercane zgodnie z zatwierdzonymi procedurami – w naszym przypadku zastosujemy dawkę śmiertelną środka znieczulającego, izofluranu.</li>
<li>Najpierw spryskaj brzuch etanolem i wykonaj niewielkie nacięcie nożyczkami.</li>
<li>Rozsuń skórę obiema rękami, aby odsłonić jamę brzuszną, a następnie rozetnij otrzewną.</li>
<li>Za pomocą pęsety chwyć rogi macicy i pobierz je, odcinając nożyczkami na każdym z końców dystalnych. Umieść rogi macicy w szalce Petriego wypełnionej PBS i postaw na lodzie. Pamiętaj również o kilkukrotnym przemyciu PBS przed izolacją łożyska. Teraz możemy przystąpić do izolacji łożyska.</li>
<li>Używając dwóch pęset, zacznij ostrożnie oddzielać tkankę endometrium otaczającą koncepcje zarodkowe. Należy uważać, aby nie przebić i nie uszkodzić strukturalnie zarodków, ponieważ utrudni to kolejne etapy sekcji.</li>
<li>Umieść wyizolowane koncepcje w nowej szalce Petriego z PBS na lodzie i kontynuuj proces, aż wszystkie koncepcje zostaną uwolnione z endometrium.</li>
<li>Przenieś jedną koncepcję do nowej szalki Petriego z PBS, umieść ją pod mikroskopem i za pomocą dwóch pęset oddziel deciduę od łożyska. Usuń jak największą ilość decidui, ponieważ komórki decidui będą zakłócać przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek i analizę cytometryczną. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zaleca się płynny, ciągły ruch oddzielania.</li>
<li>Odetnij worek żółtkowy od łożyska w miejscu połączenia obu organów, a następnie delikatnie odsuń worek żółtkowy i naczynia witelialne od łożyska. Należy uważać, aby nie uszkodzić płytki chorialnej łożyska, szczególnie w przypadku wczesnych zarodków.</li>
<li>Trzymając ostrożnie płytkę chorialną łożyska jedną pęsetą, a pępowinę drugą, pociągnij pępowinę wraz z przymocowanym zarodkiem, oddzielając je od łożyska.</li>
<li>Usuń nadmiar tkanki z komórek olbrzymich na krawędziach łożyska, aby zminimalizować zlepianie się komórek podczas przygotowywania zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
<li>Zabierz łożysko do odpowiedniego pojemnika, np. probówki Falcona o pojemności 15 ml, z PBS+5% FCS i utrzymaj na lodzie. Powtórz tę czynność dla wszystkich wypreparowanych łożysk.</li>
<li>Na tym etapie można przejść do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek do cytometrii przepływowej, testów funkcjonalnych, takich jak hodowla in vitro lub transplantacja, lub przygotować całe łożysko do fiksacji tkanek i mrożenia w blokach do późniejszej immunohistochemii.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki łożyska
<ol>
<li>Poniżej przedstawiamy sposób przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek z łożyska do analizy FACS.</li>
<li>Aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z łożyska, wymagana jest dysocjacja mechaniczna i enzymatyczna. W pierwszej kolejności należy przygotować 0,1% roztwór kolagenazy w PBS z dodatkiem 10% FCS i 1% roztworu penicyliny/streptomycyny.</li>
<li>Do tkanek łożyska należy dodać odpowiednią objętość roztworu kolagenazy, zależnie od liczby próbek. Zaleca się objętość dwukrotnie większą niż objętość łożyska, w zakresie od 2-5 ml.</li>
<li>Aby mechanicznie rozbić tkankę, należy użyć igły 16-G zamocowanej na strzykawce 5-ml i trzykrotnie przepuścić roztwór kolagenazy wraz z łożyskiem przez igłę. Procedurę należy powtórzyć z użyciem igły 18-G.</li>
<li>Próbkę należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 na 45 minut.</li>
<li>Po 45-minutowej inkubacji w kolagenazie, roztwór komórkowy należy przepuścić przez igłę 20-G, a następnie inkubować przez kolejne 45 minut w temperaturze 37°C.</li>
<li>Po łącznym czasie inkubacji w kolagenazie wynoszącym 1,5 h, roztwór komórkowy należy przepuścić trzykrotnie przez igłę 22-G, a następnie trzykrotnie przez igłę 25-G.</li>
<li>Próbkę należy przefiltrować przez filtr 50-µm zamocowany do nowej probówki Falcon 15-ml, przemyć PBS+5% FCS i odwirować w temperaturze 4°C przez 5 minut przy 300 × g.</li>
<li>W tym momencie otrzymano zawiesinę pojedynczych komórek odpowiednią do analizy FACS lub testów funkcjonalnych.</li>
</ol>
 3. Fixacja tkanek do skrawków mrożonych
<ol>
<li>Bezpośrednio po wyizolowaniu łożyska z każdego embrionu, należy umieścić je w zimnym 1X PBS. Zazwyczaj w przypadku młodych łożysk (E8.5-11.5) najlepiej sprawdza się płytka 96-dołkowa, natomiast dla łożysk starszych, od E12.5 wzwyż, wygodniejsza może być płytka 24-dołkowa.</li>
<li>Każde łożysko przenosi się do nowego dołka wypełnionego świeżo rozmrożonym 4% paraformaldehydem lub PFA. W przypadku łożysk E12.5 tkankę przenosi się do nowego dołka ręcznie, natomiast dla E10.5 można ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety i dodać PFA. Ważne jest, aby łożysko było całkowicie zanurzone przez 2-4 godziny w temperaturze 4°C, w zależności od wieku i wielkości tkanki.</li>
<li>Przenieść tkankę do 30% sacharozy, a jeśli tkanki są bardzo małe i delikatne, odessać PFA i dodać sacharozę bezpośrednio. Na tym etapie łożyska będą unosić się w roztworze. Pozostawić tkanki na noc w temperaturze 4°C.</li>
<li>Po nocnym etapie w 30% sacharozie tkanki powinny ostatecznie opaść na dno dołka, co świadczy o prawidłowej kriokonserwacji. Odlać połowę roztworu sacharozy i uzupełnić objętość OCT, a następnie ponownie umieścić tkankę w 4°C na 1-2 godziny. Ułatwia to penetrację OCT.</li>
<li>Przenieść tkankę do 100% OCT na 1 godzinę, po czym można przystąpić do zatapiania w medium.</li>
</ol>
4. Zatapianie utrwalonej tkanki
<ol>
<li>Oznakować plastikowe formy odpowiednią identyfikacją tkanki (pokazać przykładową formę).</li>
<li>Wyjąć tkankę z roztworu OCT i przekroić łożysko na pół, układając łożysko w kształcie dysku stroną pępowiny do dołu i ostrożnie przecinając je czystą żyletką, przesuwając ostrze w przód i w tył przed zwolnieniem nacisku, aby zapewnić równy przekrój. Łożysko przecina się na pół, aby uzyskać najlepszą orientację do późniejszej wizualizacji łożyskowych HSCs.</li>
<li>Umieścić jedną połowę łożyska na dnie formy tak, aby krawędź cięcia stykała się z dolną powierzchnią formy. Powtórzyć czynność w nowej formie dla drugiej połowy. W przypadku łożysk z E10.5 obie połowy można umieścić w jednej formie, stosując tę samą technikę.</li>
<li>Podczas wlewania OCT do formy może być trudno utrzymać łożyska w odpowiedniej orientacji. Unieruchomić łożysko, trzymając połowę tkanki pęsetą. Powoli wlewać roztwór OCT do formy, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. W przypadku łożysk z E10.5 trzymać jedną połowę tkanki pęsetą, a drugą połowę tkanki oprzeć o zewnętrzną stronę pęsety. Powoli wlewać roztwór OCT w sposób opisany dla łożysk z E12.5.</li>
<li>Po napełnieniu formy OCT szybko umieścić ją na suchym lodzie; OCT zmieni kolor na biały, powodując błyskawiczne zamrożenie tkanki.</li>
<li>Umieścić formę w małej plastikowej torebce zawierającej Drierite i niezwłocznie schować do zamrażarki -80°C.</li>
</ol>

<ol><li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li>
<li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li>
</ol>

Procedury eksperymentalne opisane w niniejszym protokole pozwolą na izolację i wizualizację tkanki łożyska oraz hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. W celu uzyskania szczegółowego podsumowania dotyczącego oczekiwanej wydajności komórkowej i liczby HSC w łożysku oraz innych płodowych organach hematopoetycznych w trakcie rozwoju płodu, odsyłamy do pracy Gekas, et al. 2005. W kwestii lokalizacji rozwijających się HSC oraz innych komórek hematopoetycznych w łożysku odsyłamy do pracy Rhodes, et al. 2008.

<table><tbody><tr><td>100 mM glukozy </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM NaN3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki stożkowe 15 ml (BD) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>igły 16-G, 18-G, 20-G, 22-G i 25-G (BD) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% roztwór sacharozy </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki Petri 35 mm (BD) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtry komórkowe 50 μm (Celltrics) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strzykawki 5 ml (BD) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw substratu do fosfatazy alkalicznej I (Vector Red, Vector) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw substratu fosfatazy alkalicznej III (Vector Blue, Vector) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotyku (penicylina/streptomycyna, P/S) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I (Sigma) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe winylowe formy do tkanek Cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm, Tissue-Tek) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało pierwotne przeciwko cytokeratynie (DakoCytomation) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta anatomiczna, stal nierdzewna lub tytan, numer 5 lub 55 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drierite </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy pojemnik do transportu szkiełek mikroskopowych Fisherbrand (Fisher) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa 1000 j/ml </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lewamizol (Wektor) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Media montażowe, wodne medium montażowe (VectamountTM AQ) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica konia (Vector) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw substratu peroksydazy DAB (Vector) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS) z dodatkiem wapnia i magnezu (z Ca2+/Mg2+) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy (PBS) bez jonów wapnia i magnezu (bez $\text{Ca}^{2+}/\text{Mg}^{2+}$) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pudełko na preparaty (mieści 100 szkiełek) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przewód plastikowy (Nalgene 180 PVC nietoksyczny autoklawowalny) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probiówka z polipropylenu o okrągłym dnie, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór proteinazy K 20 mg/ml (Amresco) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Markery do szkiełek Research Products International Corp Super Pap Pen HT* (2,5 mm, Fisher) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96- lub 24-dołkowe z dnem w kształcie litery U (okrągłe), przystosowane do hodowli tkankowej (BD Falcon) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20, SigmaUltra (Sigma) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do amplifikacji tyramidowej (Invitrogen) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardowy zestaw Vectastain ABC do oznaczania fosfatazy alkalicznej (Vector) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSCs) posiadają zdolność do samoodnawiania oraz generowania wszystkich typów komórek linii krwi w ciągu całego życia organizmu. Wszystkie HSCs powstają podczas rozwoju embrionalnego, po czym wielkość ich puli jest utrzymywana dzięki podziałom komórkowym prowadzącym do samoodnawiania. Identyfikacja anatomicznego pochodzenia HSCs oraz kluczowych zdarzeń rozwojowych regulujących proces ich powstawania była utrudniona, ponieważ w fetalnej hematopoezie uczestniczy wiele miejsc anatomicznych. Niedawno zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ hematopoetyczny, w którym HSCs są generowane i powielane w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). W konsekwencji łożysko stanowi istotne źródło HSCs podczas ich powstawania i wstępnej ekspansji.
W niniejszym artykule przedstawiamy techniki sekcji służące do izolacji łożyska mysiego z embrionów w dniach E10.5 i E12.5, co odpowiada odpowiednio etapom rozwojowym inicjacji HSC oraz szczytowej liczebności puli HSC w łożysku. Ponadto prezentujemy zoptymalizowany protokół enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji tkanki łożyskowej do zawiesiny pojedynczych komórek, przeznaczonej do zastosowania w cytometrii przepływowej lub testach funkcjonalnych. Stwierdziliśmy, że zastosowanie kolagenazy do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek łożyska zapewnia wystarczającą wydajność pozyskiwania HSC. Ważnym czynnikiem wpływającym na wydajność HSC z łożyska jest stopień mechanicznej dysocjacji poprzedzającej obróbkę enzymatyczną oraz czas trwania tej ostatniej.
Zapewniamy również protokół przygotowania utrwalonych i zamrożonych skrawków tkanki łożyskowej w celu wizualizacji rozwijających się HSC za pomocą immunohistochemii w ich precyzyjnych niszach komórkowych. Ponieważ antygeny specyficzne dla hematopoezy nie są zachowywane podczas przygotowania skrawków zatopionych w parafinie, rutynowo stosujemy skrawki utrwalone i zamrożone do lokalizacji łożyskowych HSC i progenitorów.

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) posiadają zdolność do samoodnawiania oraz generowania wszystkich typów komórek linii krwi przez cały okres życia osobnika. ...

Witajcie, jestem Mikkola i witam was w moim laboratorium. Głównym celem naszej pracowni jest badanie rozwoju hematopoetycznych komórek macierzystych. Podczas embriogenezy zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy i odkryliśmy, że hematopoetyczne komórki macierzyste są generowane i namnażane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych.W związku z tym łożysko ma ogromną wartość jako źródło hematopoetycznych komórek macierzystych w czasie ich powstawania i początkowej ekspansji. Dzisiaj członkowie mojego laboratorium zaprezentują techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska oraz wizualizacji HCS w ich unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. Cześć, jestem Chriss Geka z laboratorium dr Hannah Mola w Katedrze Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej na UCLA.Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić sekcję łożyska mysiego oraz jak przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z tkanki łożyskowej do analizy FACS w celu wyodrębnienia płodowych hematopoetycznych komórek macierzystych. Nazywam się Katrina Rhodes i zaprezentuję sposób przygotowania tkanki łożyskowej do immunohistochemii. Zacznijmy.W pierwszej kolejności należy wyizolować embriony od samic w ciąży. Zwierzęta są uśmiercane zgodnie z zatwierdzonymi procedurami. W naszym przypadku zastosujemy dawkę letalną środka znieczulającego, izofluranu.Najpierw spryskaj brzuch etanolem i wykonaj niewielkie nacięcie nożyczkami. Obrywaj skórę oburącz, aby odsłonić jamę brzusną, a następnie przetnij otrzewną za pomocą pęsety. Chwyć rogi macicy i odetnij je nożyczkami na każdym z końców dystalnych.Umieść rogi macicy w szalce Petriego wypełnionej PBS i pozostaw na lodzie. Pamiętaj również o kilkukrotnym przemyciu PBS przed wyizolowaniem łożyska za pomocą dwóch pincet. Rozpocznij ostrożne oddzielanie tkanki błony śluzowej macicy otaczającej koncepcje zarodkowe.Zarodki te pochodzą z 12,5 dnia embrionalnego, co jest etapem rozwojowym, w którym liczba macierzystych komórek krwiotwórczych (HSC) w łożysku osiąga swoje maksimum. Należy uważać, aby nie przebić i nie spowodować innych uszkodzeń strukturalnych zarodków, ponieważ utrudni to kolejne etapy sekcji. Umieść wyizolowane koncepcje w nowej płytce Petriego z PBS na lodzie i kontynuuj proces, aż wszystkie koncepcje zostaną uwolnione z endometrium.Przenieś jeden konceptus do nowej szalki Petriego z PBS umieszczonej pod mikroskopem. Za pomocą dwóch pęset oddziel deciduę od łożyska G. Usuń jak największą ilość deciduy, ponieważ komórki deciduy mogą zakłócać przebieg badania.Z wykorzystaniem zawiesiny pojedynczych komórek i cytometrii przepływowej. Aby uzyskać najlepsze wyniki, zaleca się gładki, ciągły ruch odwarstwiania. Należy zauważyć, że w przypadku młodszych zarodków, takich jak przedstawione tutaj zarodki z 10,5 dnia embrionalnego lub E 10.5, błona trofoblastyczna otacza cały conceptus.W przeciwieństwie do zarodków w stadium E 12.5, w stadium E 10.5 komórki HSC dopiero zaczynają pojawiać się w łożysku. Zwróć uwagę na znaczną różnicę w wielkości między zarodkami E 10.5 a E 12.5. Odetnij worek żółtkowy od łożyska w miejscu połączenia obu organów, a następnie delikatnie oddziel worek żółtkowy oraz naczynia pępowinowe od łożyska.Należy uważać, aby nie uszkodzić płytki trofoblastycznej łożyska, szczególnie w przypadku wczesnych embrionów. Należy ostrożnie przytrzymać płytkę trofoblastyczną łożyska jedną parą pęset, a pępowinę drugą. Należy oddalić pępowinę wraz z przytwierdzonym embrionem od łożyska.Usuń nadmiar tkanki komórek olbrzymich z brzegów łożyska. Aby zminimalizować zlepianie się komórek podczas przygotowywania zawiesiny pojedynczych komórek, zbierz łożysko do odpowiedniego pojemnika, takiego jak probówka Falcon 15 ML z PBS i 5% FCS, i umieść go w lodzie. Powtórz tę czynność dla wszystkich wypreparowanych łożysk. Na tym etapie można przejść do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek do funkcjonalnych analiz cytometrii przepływowej, takich jak hodowla in vitro lub transplantacja, lub przygotować całe łożysko do utrwalenia tkanki i zamrożenia w bloku do późniejszej immunohistochemii.W tej części pokażemy, jak przygotować jednokomórkową zawiesinę z łożyska do analizy FACS. Najpierw należy przygotować 0,1% roztwór kolagenazy w PBS z dodatkiem 10% FCS oraz 1% roztworu penicyliny i streptomycyny. Do łożyska należy dodać odpowiednią objętość roztworu kolagenazy, zależnie od wielkości próbki; zaleca się użycie objętości dwukrotnie większej niż objętość łożyska, zazwyczaj od 2 do 5 ml.Używając igły o rozmiarze 16 G założonej na strzykawkę o pojemności 5 ml, należy mechanicznie rozbić tkankę poprzez trzykrotne przepuszczenie roztworu kolagenazy i łożyska przez igłę. Powtórz tę czynność, używając igły o rozmiarze 8 G. Po 45-minutowej inkubacji umieść próbkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 na kolejne 45 minut.W procesie pasażowania z użyciem kolagenazy, przepuść zawiesinę komórkową przez igłę o rozmiarze 20 G i inkubuj przez dodatkowe 45 minut w 37 °C. Po całkowitej, półtoragodzinnej inkubacji w kolagenazie, przepuść zawiesinę komórkową przez igły o rozmiarach 22 G oraz 25 G, powtarzając czynność trzykrotnie dla każdej igły. Następnie przefiltruj próbkę przez filtr 50 µm przymocowany do nowej probówki Falcon 15 ML, przemyj roztworem PBS z dodatkiem 5% FCS i odwiruj w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 300 ×g. W tym momencie otrzymujemy zawiesinę pojedynczych komórek odpowiednią do analizy FACS.Przedstawię sposób przygotowania tkanki łożyska do immunohistochemii. Immunohistochemia tkanki łożyska może być wykorzystana do lokalizacji hematopoietic stem cells w mikrośrodowisku łożyska. Bezpośrednio po wyizolowaniu łożyska z każdego embrionu, są one umieszczane w zimnym 1x PBS; zazwyczaj w przypadku młodych łożysk z dni embrionalnych 8.5 do 11.5 najlepiej sprawdza się płytka 96-dołkowa, natomiast przy starszych łożyskach (E 12.5 i starszych) wygodniejsza może być płytka 24-dołkowa.Każdą łożysko przenosi się do nowej studzienki wypełnionej świeżo rozmrożonym 4% PARALDEHYDE lub PFA w przypadku łożyska z dnia E 12,5. Tkankę przenosi się do nowej studzienki ręcznie. Natomiast w przypadku łożyska z dnia E 10,5 można ostrożnie usunąć PBS za pomocą pipety i dodać PFA.Ważne jest, aby łożysko było całkowicie zanurzone przez dwie do czterech godzin w temperaturze 4°C, w zależności od wieku i wielkości tkanki. Następnie należy przenieść tkankę do 30% sacharozy. Jeśli tkanki są bardzo małe i kruche, należy odessać PFA i dodać sacharozę bezpośrednio.Na tym etapie łożysko będzie pływać w roztworze. Pozostaw tkankę na noc w temperaturze 4 °C. Po nocnym inkubowaniu w 30% sacharozie tkanki powinny ostatecznie opaść na dno dołka, co świadczy o prawidłowej kriokonserwacji. Następnie odlej połowę roztworu sacharozy i uzupełnij objętość OCT.Umieść tkankę ponownie w temperaturze 4 °C na jedną do dwóch godzin. Ułatwia to przenikanie OCT. Na koniec tkankę należy przenieść do 100% OCT na jedną godzinę, po czym można przystąpić do procesu zatapiania.Oznakuj plastikowe formy, podając odpowiednią identyfikację tkanki. Wyjmij tkankę z roztworu OCT i przetnij łożysko na pół, orientując łożysko w kształcie dysku stroną z pępowiną skierowaną w dół i ostrożnie przecinając je czystym ostrzem żyletki, pamiętając o cofaniu ostrza i wykonaniu czterech ruchów przed zwolnieniem nacisku, aby zapewnić równomierne cięcie.Łożkę przecina się na pół, aby uzyskać najlepszą orientację dla późniejszej wizualizacji macierzystych komórek krwiotwórczych łożyska. Następnie jedną połowę łożyska umieszcza się na dnie formy tak, aby krawędź cięcia stykała się z dolną powierzchnią formy. Czynność tę powtarza się z nową formą dla drugiej połowy.W przypadku łożysk z dnia E 10.5 obie połowy można umieścić w tej samej formie, stosując tę samą technikę. Podczas wlewania OCT do formy utrzymanie łożyska w odpowiedniej orientacji może być trudne. W przypadku łożyska z dnia E 10.5 należy unieruchomić tkankę, przytrzymując jej połowę pęsetą.Przytrzymaj jedną połowę tkanki pęsetą, a drugą połowę oprzyj o zewnętrzną stronę pęsety. Następnie powoli wlej roztwór OCT, zgodnie z opisem dla E 12.5. Po wypełnieniu formy OCT szybko umieść ją na suchym lodzie.OCT zmieni kolor na biały podczas błyskawicznego zamrażania tkanki; należy wtedy umieścić formę w małej plastikowej torebce i natychmiast przechowywać w zamrażarce w temperaturze minus 80 °C. Oto reprezentatywny przekrój łożyska z etapu E 10.5. Ważne jest, aby preparaty obejmowały widoczną w dolnej części obrazu płytkę trofoblastyczną oraz labirynt łożyska – obszar łożyska umożliwiający wymianę między płodem a matką, widoczny w części środkowej.Przekrój ten zbarwiono przeciwciałem CD 31, które wybarwiło śródbłonek na czerwono. Trofoblasty widoczne w kolorze brązowym są oznaczone cytokeratyną. Labirynt zawiera zarówno naczynia krwionośne płodu oznaczone na czerwono, jak i macierzyste przestrzenie naczyniowe wyścielone brązowymi trofoblastami.Niebieskie komórki to CD 41-dodatnie, nowo powstałe hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe; należy zauważyć, że lokalizują się one w naczyniach płodowych. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić mikrodysekcję i przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z masy łożyska, a także jak zidentyfikować łożyskowe hematopoetyczne komórki macierzyste za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazaliśmy również, jak przygotować skrawki tkanki łożyska do wizualizacji hematopoetycznych komórek macierzystych metodą immunohistochemii.Podczas wykonywania tych procedur ważne jest zwrócenie uwagi na kilka krytycznych parametrów. Podczas preparowania łożyska istotne jest szybkie działanie oraz utrzymywanie embrionów i roztworów w jak najniższej temperaturze, aby zachować wysoką żywotność komórek niezbędną do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. Stopień dysocjacji mechanicznej przed traktowaniem enzymatycznym oraz czas inkubacji podczas tego procesu są najważniejszymi czynnikami wpływającymi na żywotność i stan zdrowia komórek.I na koniec, przeprowadzając immunohistochemię, należy pamiętać, że nadmierna fiksacja może stwarzać problemy dla niektórych antygenów, natomiast zbyt słaba fiksacja może doprowadzić do zniszczenia tkanki. To wszystko. Dziękuję za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.

isolation-and-analysis-of-hematopoietic-stem-cells-from-the-placenta

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazano, jak przeprowadzić mikrodysekcję pęcherzyka żółtkowego oraz regionu aorta-gonady-metanefrosy z embrionów i wykorzystać cytometrię przepływową do sortowania hematopoetycznych komórek macierzystych.

Izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka żółtkowego i obszaru AGM myszy

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Przedstawiono dwie techniki izolowania kropelek lipidów komórkowych z 1) komórek drożdży i 2) ludzkich łożysk. Centralnym elementem obu procedur jest wirowanie w gradionym gradimencie gęstości, w którym powstałą pływającą warstwę zawierającą kropelki można łatwo zwizualizować za pomocą oka, wyekstrahować i określić ilościowo za pomocą analizy Western Blot w celu uzyskania czystości.

Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Opisany tutaj jest protokół do izolacji i dalszego badania naciekających leukocytów decidua basalis i decidua parietalis - ludzkiego interfejsu matczyno-płodowego. Protokół ten utrzymuje integralność markerów powierzchniowych komórek i daje wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, co udowodniono w analizie cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

Opisany tutaj jest protokół do izolowania i analizy naciekających leukocytów tkanek na styku matki i płodu (macica, decidua i łożysko) myszy. Protokół ten zachowuje integralność większości markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych komórek do dalszych zastosowań, w tym analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Poznaj metody izolacji i analizy hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska myszy. Techniki te umożliwiają badanie unikalnych nisz mikrośrodowiskowych wspierających rozwój komórek macierzystych.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

Przeglądaj więcej filmów