Trypsyna i subkulturacja komórek ssaków
12 czerwca 2008
Gdy komórki osiągną konfluencję, muszą zostać podkulturowe lub pasażowane. W tym filmie zademonstrujemy procedurę subkulturacji zarówno komórek przylegających, jak i zawiesinowych.
Technologia hodowli tkankowych Znalazła szerokie zastosowanie w dziedzinie biologii komórki. Jednak hodowane komórki wymagają regularnej pielęgnacji, aby zachować zdrowie. Gdy komórki osiągną płynność, muszą być hodowane lub pasażowane.
Niezastosowanie się do tego powoduje zmniejszony wzrost i ostatecznie śmierć komórki. W tym filmie pokazujemy, jak utrzymać komórki hodowli tkankowej zarówno dla linii komórek przylegających, jak i zawiesinowych. Cześć, jestem Ricky w laboratorium dr LAN w Sieci Laboratoriów Patologii Molekularnej we wschodnim Tennessee.
Dzisiaj chcę Wam pokazać dwie techniki pakowania, zawieszania i przylegania komórek. Aby przejść przez płytkę komórek. Będziemy chcieli zacząć od pierwotnej kultury wyhodowanej do jednoczesnej płynności na 60-milimetrowej szalce Petriego lub 25-centymetrowej kwadratowej kolbie do hodowli tkankowej zawierającej pożywkę do hodowli tkankowych o grubości pięciu milimetrów.
Zaczynamy od usunięcia całej pożywki z kultury pierwotnej za pomocą sterylnej pipety. Następnie pierzemy przylegającą monowarstwę komórkową raz lub dwa razy niewielką objętością 37 stopni Celsjusza HBSS bez wapnia i magnezu. Aby usunąć wszelkie pozostałości płodowej surowicy bydlęcej, które mogą hamować działanie enzymu trypsyny, który zostanie dodany w następnym kroku.
Następnie dodaj do kultury tyle ciepłego roztworu trypsyny EDTA, aby pokryć przylegającą warstwę komórkową. Następnie możesz umieścić talerz na tacy do podgrzewania o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną do dwóch minut. Po inkubacji postukaj spodem płytki o płaską powierzchnię, aby usunąć komórki.
Sprawdź kulturę za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że komórki są zaokrąglone do góry, co oznacza, że są oderwane od powierzchni. Jeśli komórki nie są wystarczająco odłączone, włóż płytkę z powrotem do tacki do podgrzewania na dodatkową minutę lub dwie. Po przejrzeniu lunety wypłucz naczynie w kompletnym podłożu i odpipetuj zawiesinę do stożkowej rurki o grubości 15 mililitrów, zawierającej dwie mililitry kompletnego podłoża.
Zakręć komórki w dół, aby je ogarnąć i ponownie zawieś granulkę w kompletnym podłożu. Teraz dodaj równą objętość zawiesiny komórkowej do każdej ze świeżych płytek, które zostały odpowiednio oznakowane. Alternatywnie komórki można policzyć za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć do pożądanej gęstości, aby do każdej płytki można było dodać określoną liczbę komórek.
Pamiętaj, aby oznaczyć każdą tabliczkę datą subkultury i numerem przejścia. Po dodaniu zawiesiny komórkowej umieść jeden mil świeżej pożywki w każdej nowej kulturze. Teraz inkubuj płytki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.
Po inkubacji komórek przez noc dodaj świeżą pożywkę do płytek i umieść je z powrotem w temperaturze 37 stopni. Gdy płytka osiągnie zbieżność, można ją ponownie przechodzić, powtarzając tę procedurę i kontynuować przejście w razie potrzeby. Teraz pokażemy Ci, jak pasować komórki w hodowli zawiesinowej.
Pakowanie komórek w hodowli zawiesinowej jest prostsze niż w przypadku komórek adhezyjnych. Przed zapakowaniem kultur zawiesinowych komórki muszą być utrzymywane przez karmienie co dwa do trzech dni, aż osiągną płynność, co oznacza, że komórki zlepiają się ze sobą w zawiesinie, a podłoże wydaje się twarde. Gdy kolba jest zawirowana.
W tym celu należy wyjąć kolbę z komórkami zawiesinowymi z inkubatora, uważając, aby nie przeszkadzać tym, które osiadły w kolbie. Dno aseptykować, usunąć i wyrzucić około jednej trzeciej pożywki z kolby i zastąpić ją równą objętością wstępnie ogrzanego podłoża o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zmianie podłoża zakręć kolbą i włóż ją z powrotem do inkubatora, który ma temperaturę 37 stopni Celsjusza, 5% CO2.
Jeśli jest mniej niż 15 milsów, pożywka w kolbie inkubuje kolbę w pozycji poziomej, aby zwiększyć kontakt komórki z podłożem. W przeciwnym razie kolba może być inkubowana pionowo w dniach, w których kultury nie są karmione. Sprawdź je, obracając mieszkania, aby ponownie zawiesić komórki.
Pamiętaj, aby obserwować wszelkie zmiany koloru w pożywce, które wskazują na dobry wzrost metaboliczny. Gdy kultury zlewają się, co powinno wynosić około 2,5 miliona komórek na promil, można je przechodzić. Po raz kolejny właśnie pokazaliśmy, jak pasować hodowane komórki zarówno dla kultur adherentnych, jak i zawiesinowych.
Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To wideo demonstruje procedurę podtrzymującą zarówno komórki adherujące jak i w zawiesinie, gdy osiągają one konfluencję. Prawidłowe utrzymanie hodowanych komórek jest niezbędne dla ich wzrostu i żywotności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Techniki hodowli tkankowej
- Utrzymanie komórek
Tło
- Technologia hodowli tkankowej jest szeroko stosowana w biologii komórki.
- Regularne utrzymanie jest kluczowe dla zdrowia hodowanych komórek.
- Komórki muszą być przeszczepianych, aby zapobiec zmniejszeniu wzrostu i śmierci komórek.
- To wideo zapewnia praktyczne wskazówki dotyczące utrzymania linii komórkowych.
Cel badania
- Aby pokazać proces podtrzymujący dla różnych typów komórek.
- Aby edukować badaczy na temat utrzymania żywotności komórek.
- Aby zapewnić wizualny przewodnik dla procedur laboratoryjnych.
Stosowane metody
- Demonstracja technik podtrzymujących.
- Instrukcje dotyczące obsługi adherujących linii komórkowych.
- Instrukcje dotyczące obsługi linii komórek w zawiesinie.
- Pomoce wizualne, aby poprawić zrozumienie procedur.
Główne wyniki
- Sukces w demonstrowaniu metod podtrzymujących.
- Wyraźne instrukcje wizualne dla badaczy.
- Nacisk na znaczenie terminowego przeszczepiania.
- Wskazówki dotyczące utrzymania zdrowych kultur komórek.
Wnioski
- Właściwe podtrzymujące jest niezbędne dla zdrowia komórek.
- Badacze mogą skorzystać z wizualnych zasobów edukacyjnych.
- Utrzymanie hodowanych komórek wymaga regularnej uwagi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable subculturing of mammalian cells is foundational for reproducible discovery biology, enabling consistent cell health and experimental continuity across R&D pipelines. Standardized trypsinization and passaging protocols reduce biological variability, supporting robust assay development and downstream screening. Effective cell maintenance underpins predictive confidence in early-stage target validation and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent propagation of cell lines for hypothesis-driven experiments.
- Reduces biological noise, supporting functional target validation and mechanistic de-risking.
- Facilitates reproducible pathway interrogation and comparative studies across conditions.
Screening & Assay Development
- Provides standardized cell populations for assay setup and compound screening.
- Supports quantitative output generation by maintaining uniform cell density and viability.
- Enables scalability and platform reuse through reproducible subculture techniques.
Translational & Preclinical Research
- Maintains disease-relevant cell models for translational biomarker studies when applicable.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by preserving cell line integrity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable cell-based data.
Pipeline & Workflow Integration
Trypsinization and subculturing are positioned at the foundation of the discovery continuum, supporting workflows from early hypothesis testing through assay development and preclinical research.
- Discovery Biology: Maintains healthy, proliferative cells for robust experimental design and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible cell populations for high-confidence assay deployment and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cell growth, viability, and response to perturbations.
- Translational Research: Preserves model fidelity for studies bridging discovery and preclinical phases.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable workflow for cell line maintenance across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in cell culture workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in sterile technique and cell handling.
- Needs access to tissue culture facilities, incubators, and validated reagents.
- Demands cross-team standardization of subculture intervals and documentation.
- Must adapt protocols for specific cell line growth rates and characteristics.
- Dependent on regular monitoring to prevent over-confluency and maintain cell health.
