Name: Trypsyna i subkulturacja komórek ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-12T13:28:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Naucz się subkulturowania komórek ssaków przy użyciu trypsyny i technik hodowli tkankowej. Film pokazuje procedury dla komórek przyklejonych i zawiesinowych, pomagając utrzymać ich zdrowie i żywotność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pełny protokół tekstowy dla tego podejścia eksperymentalnego jest dostępny w <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">Current Protocols in Cell Biology</a>.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

trypsynizacja i pasażowanie komórek ssaczych

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Gdy komórki osiągną pełną konfluencję, należy przeprowadzić ich subkulturę lub pasażowanie. Brak subkultury konfluencyjnych komórek prowadzi do obniżenia indeksu mitotycznego, a w konsekwencji do śmierci komórek. Pierwszym krokiem w procesie subkulturowania jest oddzielenie komórek od powierzchni naczynia kultury pierwotnej poprzez trypsynizację lub metodami mechanicznymi. Otrzymaną w ten sposób zawiesinę komórkową następnie dzieli się i wysiewa do świeżych kultur. Kultury wtórne są monitorowane pod kątem wzrostu i okresowo zasilane pożywką, a następnie mogą zostać poddane kolejnej subkulturze w celu uzyskania kultur trzeciorzędowych. Czas między pasażami komórek różni się w zależności od linii komórkowej i zależy od szybkości wzrostu.

W momencie gdy komórki osiągają konfluencję, należy je poddać subkulturze lub pasażowaniu. Niniejszy film zaprezentuje procedurę subkultury komórek adherentnych oraz zawiesinowych.

Trypsynizacja i pasażowanie komórek ssaczych

W miarę osiągania przez komórki konfluencji, należy poddać je subkulturze lub pasażowaniu. Brak subkultury konfluencyjnych komórek prowadzi do obniżenia indeksu mitotycznego, a w konsekwencji do ...

Technologia hodowli tkankowej znalazła szerokie zastosowanie w dziedzinie biologii komórki. Jednakże hodowane komórki wymagają regularnej pielęgnacji, aby zachować żywotność. Gdy komórki osiągną pełną konfluencję, muszą zostać poddane subkulturze lub pasażowaniu.Zaniechanie tych czynności prowadzi do ograniczenia wzrostu, a w konsekwencji do śmierci komórek. W tym filmie demonstrujemy, jak utrzymywać hodowle komórkowe zarówno w przypadku linii komórkowych adherentnych, jak i zawiesinowych. Cześć, jestem Ricky z laboratorium dr. LAN w sieci Molecular Pathology Laboratories w East Tennessee.Dzisiaj chcę przedstawić dwie techniki pasażowania komórek zawiesinowych oraz komórek przylegających. Aby przeprowadzić pasaż komórek z płytki, zaczniemy od hodowli pierwotnej, która osiągnęła pełną konfluencję w 60 mm szalce Petriego lub 25 cm² flasku do hodowli tkanek zawierającym 5 ml medium do hodowli tkanek.Zaczynamy od usunięcia całej pożywki z hodowli pierwotnej za pomocą sterylnej pipety. Następnie przemywamy przylegającą monowarstwę komórek raz lub dwa razy niewielką objętością HBSS bez wapnia i magnezu o temperaturze 37 °C. Ma to na celu usunięcie pozostałości płodowej surowicy bydlęcej, która mogłaby hamować działanie enzymu trypsyny dodawanego w kolejnym kroku.Następnie dodaj do hodowli odpowiednią ilość ciepłego roztworu trypsyny z EDTA, aby pokryć przyrastającą warstwę komórek. Następnie płytkę można umieścić na podgrzewaczu o temperaturze 37 °C na jedną do dwóch minut. Po inkubacji ostukać dno płytki o płaską powierzchnię, aby odczepić komórki.Sprawdź hodowlę pod mikroskopem odwróconym, aby upewnić się, że komórki stały się okrągłe, co wskazuje na ich odklejenie się od powierzchni. Jeśli komórki nie odkleiły się w wystarczającym stopniu, wprowadź płytkę z powrotem do ogrzewacza na dodatkową minutę lub dwie. Po oględzinach pod mikroskopem wypłucz naczynie w pełnej pożywce i przelej zawiesinę pipetą do 15 ml probówki stożkowej zawierającej 2 ml pełnej pożywki.Odwiruj komórki, aby otrzymać osad, a następnie resuspenduj go w pożywce kompletnej. Następnie dodaj równą objętość zawiesiny komórkowej do każdej z nowych, odpowiednio oznakowanych płytek. Alternatywnie komórki można policzyć za pomocą komory udowania i rozcieńczyć do pożądanej gęstości, aby do każdej płytki dodać określoną liczbę komórek.Należy pamiętać, aby opisać każdą płytkę datą subkultury oraz numerem pasażu. Po dodaniu zawiesiny komórek, dodaj 1 ml świeżej pożywki do każdej nowej kultury. Następnie inkubuj płytki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5% CO2.Po inkubacji komórek przez noc, należy dodać do płytek świeżą pożywkę i ponownie umieścić je w temperaturze 37 stopni. Gdy komórki na płytce osiągną pełną konfluencję, można przeprowadzić ponowne pasażowanie, powtarzając tę procedurę i kontynuując pasażowanie w razie potrzeby. Teraz pokażemy, jak pasażować komórki w hodowli zawiesinowej.Pakowanie komórek w hodowli zawiesinowej jest prostsze niż w przypadku komórek adherentnych. Przed pakowaniem hodowli zawiesinowych komórki muszą być utrzymywane poprzez dokarmianie co dwa do trzech dni, aż osiągną konfluencję, czyli moment, w którym komórki skupiają się w zawiesinie, a medium staje się mętne podczas zakręcania kolby.Aby to zrobić, wyjmij kolbę z zawiesiną komórek z inkubatora, uważając, aby nie zakłócić tych, które osiadły na dnie kolby. Aseptycznie usuń i odrzuć około jednej trzeciej pożywki z kolby, a następnie zastąp ją równą objętością uprzednio ogrzanej pożywki w temperaturze 37 °C. Po wymianie pożywki delikatnie zakręć kolbą i przenieś ją z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.Jeśli w kolbie znajduje się mniej niż 15 ml pożywki, należy inkubować ją w pozycji poziomej, aby zwiększyć kontakt komórek z pożywką. W przeciwnym razie kolbę można inkubować pionowo w dniach, w których nie przeprowadza się dokarmiania kultur. Należy sprawdzać je, delikatnie obracając kolby w celu resuspensji komórek.Należy zwrócić uwagę na wszelkie zmiany koloru pożywki, które świadczą o prawidłowym wzroście metabolicznym. Po osiągnięciu konfluencji kultur, co powinno nastąpić przy około 2,5 miliona komórek na ml, można przeprowadzić pasaż. W ten sposób zaprezentowaliśmy metodę pasażowania hodowlach komórek zarówno w formie przylegającej, jak i zawiesiny.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich eksperymentach.

trypsinizing-and-subculturing-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Trypsyna i subkulturacja komórek ssaków

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

W niniejszym raporcie prezentujemy system izolacji i hodowli komórek donora z gruczołu mlekowego myszy oraz ich ortotopowego przeszczepienia do myszy biorców w celu analizy interakcji zrąb-nabłonek podczas rozwoju guza piersi.

Przeszczepienie komórek zrębowych i komórek raka do gruczołu mlekowego u myszy C57BL/6J

Ten film demonstruje technikę badania in vivo lokalizacji przeciwciał specyficznych dla nowotworu w modelu ksenoprzeszczepu guza myszy. Po podskórnym wstrzyknięciu komórek rakowych myszom w celu powstania guza, wstrzykuje się fluorescencyjnie znakowane przeciwciała, które wiążą się z receptorami specyficznymi dla guza, umożliwiając ocenę in vivo lokalizacji przeciwciał za pomocą obrazowania.

Technika oceny lokalizacji in vivo przeciwciał specyficznych dla nowotworu

Film demonstruje test do oceny masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. Wykorzystuje elektroporację do uwalniania białek cytozolowych, w tym dehydrogenazy mleczanowej (LDH). Sekwestrowane LDH i całkowite komórkowe frakcje LDH są oznaczane w celu oceny sekwestracji LDH, dostarczając wglądu w ogólną aktywność sekwestracji masowej.

Kwantyfikacja masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

Ten film demonstruje protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek kory mózgowej z grzbietowo-bocznego kresomózgowia embrionów myszy.

Izolacja i hodowla komórek z zarodka myszy Grzbietowo-boczne kresomózgowie

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Naucz się subkulturowania komórek ssaków przy użyciu trypsyny i technik hodowli tkankowej. Film pokazuje procedury dla komórek przyklejonych i zawiesinowych, pomagając utrzymać ich zdrowie i żywotność.

Trypsynizacja i pasażowanie komórek ssaczych

Przeglądaj więcej filmów