Mrożenie, rozmrażanie i pakowanie komórek do transportu

Hodowle komórkowe są wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań badawczych i diagnostycznych. W celu zachowania komórek, uniknięcia starzenia się, zmniejszenia ryzyka kontaminacji oraz zminimalizowania efektów dryfu genetycznego, pożądane jest czasami przechowywanie linii komórkowych do przyszłych prac. Linie komórkowe mogą być mrożone w celu długoterminowego przechowywania.

W tym filmie pokazujemy, jak mrozić komórki hodowane zarówno w monowarstwie, jak i w zawiesinie, oraz jak je rozmrażać w celu ponownego wznowienia wzrostu. Cześć, nazywam się Ricky i znajduję się w laboratorium dr LAN w sieci Molecular Pathology Laboratories wschodniego Tennessee. Dzisiaj pokażę Państwu, jak mrozić komórki do długoterminowego przechowywania oraz jak rozmrażać je z ciekłego azotu.

Aby zamrozić ludzkie komórki adherentne, należy rozpocząć od ododerwania ich od płytki w sposób analogiczny do przygotowywania ich do pasażowania. Należy pamiętać, że do kriokonserwacji najlepiej wykorzystać komórki znajdujące się w logarytmicznej fazie wzrostu. Po ododerwaniu komórek i zatrzymaniu reakcji trypsyny poprzez dodanie serum lub medium zawierającego serum, należy przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki do wirowania i dodać dwa mililitry.

Kompletne medium z surowicą oraz komórki z trzech lub więcej naczyń z tej samej subkultury tego samego źródła można połączyć w jednej probówce. Wirować komórki przez pięć minut przy 300 do 350 Gs w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu usunąć nadsącz i resuspendować osad w 10 mils w temperaturze czterech stopni Celsiusza.

Do pożywki kompletnej dodać taką samą objętość medium do mrożenia w temperaturze czterech stopni, dokładnie wymieszać komórki, a następnie umieścić probówkę na lodzie i policzyć komórki. Używając komory Counting Chamber, rozcieńczyć zawiesinę dodatkowym medium do mrożenia, aby uzyskać końcowe stężenie komórek wynoszące 1 milion lub 10 milionów komórek na mililitr w przypadku mrożenia komórek z niemal w pełni zrosłej kolby o wymiarach 25 cm². Zawiesić ponownie w około 3 ml medium do mrożenia, a następnie nanieść alikwoty zawiesiny komórkowej o objętości 1 ml do oznakowanych krioprobówek o pojemności 2 ml.

Należy upewnić się, że nakrętki fiolek są szczelnie dokręcone. Umieścić fiolki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na czas od jednej godziny do całej nocy, a następnie przenieść je do zbiornika z ciekłym azotem. Zamrażanie komórek z hodowli zawiesinowej opiera się na tej samej zasadzie co zamrażanie komórek z hodowli monowarstwy.

Główną różnicą jest to, że hodowle w zawiesinie nie wymagają wstępnej trypsynizacji. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i wiruj przez 10 minut przy 300 do 350 Gs w temperaturze pokojowej. Następnie odlej supernatant i resuspenduj osad w medium do mrożenia w temperaturze 4°C, aby uzyskać gęstość od 1 miliona do 10 milionów komórek na ml.

Następnie przenieś alikwoty zawiesiny komórkowej o objętości 1 ml do krioprobówek i zamroź. Podobnie jak w przypadku kultur monowarstwowych, co zostało przedstawione w poprzednim rozdziale, rozmroź i odzyskaj zamrożone probówki. Najpierw wyjmij probówkę z komórkami z zamrażarki z ciekłym azotem i natychmiast umieść ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.

Ciągle wstrząsaj fiolką, aż pożywka zostanie rozmrożona, co zazwyczaj zajmuje mniej niż 60 sekund. Po rozmrożeniu przetrzyj górną część fiolki 70% etanolem przed otwarciem. Następnie przenieś zawiesinę rozmrożonych komórek do sterylnej probówki do wirowania zawierającej 2 mL ciepłej kompletnej pożywki i 20% płodowej surowicy bydlęcej, a następnie odwiruj.

Wirować przez 10 minut przy 150 do 200 Gs w temperaturze pokojowej. Krok ten usunie resztki DMSO. Po wirowaniu odlać supernatant i delikatnie resuspender osad komórkowy w niewielkiej ilości, około 1 ml, kompletnego medium z 20% FBS. Przenieść zawiesinę do odpowiednio oznakowanej płytki hodowlanej zawierającej właściwą ilość medium. Zazwyczaj wymagany jest 1 ml zawiesiny komórkowej na 5 do 20 ml medium.

Teraz komórki można umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby rosły przez 24 godziny. Należy upewnić się, że komórki przytwierdziły się do płytki; po pięciu do siedmiu dniach lub w momencie zmiany barwy wskaźnika pH w pożywce należy wymienić medium. Kultury należy utrzymywać w pożywce zawierającej 20% FBS do czasu ponownego ustanowienia linii komórkowej.

Jeśli stopień odzysku jest ekstremalnie niski, może to oznaczać, że rozwija się jedynie subpopulacja pierwotnej hodowli. Należy zachować szczególną ostrożność w tym zakresie podczas pracy z liniami komórkowymi znanymi z występowania mozaicyzmu. W przypadku konieczności transportu hodowli, można to łatwo przeprowadzić zarówno dla kultur monowarstwowych, jak i zawiesinowych.

W 25-centymetrowych kolbach do hodowli tkankowej komórki są hodowane do niemal pełnej konfluencji w monowarstwie lub do pożądanej gęstości w zawiesinie. W przypadku hodowli monowarstwowych najpierw usuwa się pożywkę, a następnie napełnia kolbę świeżą pożywką. Niezbędne jest całkowite napełnienie kolby pożywką, aby zapobiec wysychaniu komórek w przypadku odwrócenia kolb podczas transportu.

W przypadku świeżych kultur w zawiesinie, dodaje się pożywkę, aby wypełnić kolbę. Nakrętkę mocno dokręca się i zabezpiecza za pomocą parafiny. Kolbę zamyka się w szczelnym plastikowym worku lub innym szczelnym pojemniku zaprojektowanym w celu zapobiegania wyciekom.

W przypadku uszkodzenia kolby, główny pojemnik umieszcza się w wtórnym pojemniku izolacyjnym, aby chronić go przed ekstremalnymi temperaturami podczas transportu. Na zewnątrz opakowania nakleja się etykietę ostrzegawczą o zagrożeniu biologicznym. Zazwyczaj kultury są transportowane kurierami w trybie przesyłki tego samego dnia lub nocnej.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak zamrażać i rozmrażać hodowle ludzkich komórek, zarówno w przypadku komórek adherentnych, jak i zawiesinowych. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich eksperymentach.