Name: Komórki zamrażające, rozmrażające i pakujące do transportu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Naucz się zamrażać i rozmrażać komórki ssacze w celu długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie. Techniki te zapewniają zachowanie żywotności komórek i są kluczowe dla badań w biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pełny tekst protokołu dla tego podejścia eksperymentalnego jest dostępny w <a class="jove_content" href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract">Current Protocols in Cell Biology.</a>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

mrożenie, rozmrażanie i pakowanie komórek do transportu

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

hodowlane komórki ssaków są szeroko wykorzystywane w badaniach z zakresu biologii komórki. Aby zachować strukturę, funkcję, zachowanie i biologię komórek w kulturze, wymagane jest opanowanie szeregu specjalistycznych umiejętności. W niniejszym filmie opisano podstawowe umiejętności niezbędne do mrożenia i przechowywania komórek oraz sposób regeneracji zamrożonych banków komórek.

Hodowlane komórki ssaków są szeroko wykorzystywane w badaniach z zakresu biologii komórki. Niniejszy film opisuje podstawowe umiejętności niezbędne do zamrażania i przechowywania komórek oraz sposób regeneracji zamrożonych zapasów.

Mrożenie, rozmrażanie i pakowanie komórek do transportu

Hodowlane komórki ssaków są szeroko wykorzystywane w badaniach nad biologią komórki. Wymaga to opanowania szeregu specjalistycznych umiejętności, aby móc zachować...

Hodowle komórkowe są wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań badawczych i diagnostycznych. W celu zachowania komórek, uniknięcia starzenia się, zmniejszenia ryzyka kontaminacji oraz zminimalizowania efektów dryfu genetycznego, pożądane jest czasami przechowywanie linii komórkowych do przyszłych prac. Linie komórkowe mogą być mrożone w celu długoterminowego przechowywania.W tym filmie pokazujemy, jak mrozić komórki hodowane zarówno w monowarstwie, jak i w zawiesinie, oraz jak je rozmrażać w celu ponownego wznowienia wzrostu. Cześć, nazywam się Ricky i znajduję się w laboratorium dr LAN w sieci Molecular Pathology Laboratories wschodniego Tennessee. Dzisiaj pokażę Państwu, jak mrozić komórki do długoterminowego przechowywania oraz jak rozmrażać je z ciekłego azotu.Aby zamrozić ludzkie komórki adherentne, należy rozpocząć od ododerwania ich od płytki w sposób analogiczny do przygotowywania ich do pasażowania. Należy pamiętać, że do kriokonserwacji najlepiej wykorzystać komórki znajdujące się w logarytmicznej fazie wzrostu. Po ododerwaniu komórek i zatrzymaniu reakcji trypsyny poprzez dodanie serum lub medium zawierającego serum, należy przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki do wirowania i dodać dwa mililitry.Kompletne medium z surowicą oraz komórki z trzech lub więcej naczyń z tej samej subkultury tego samego źródła można połączyć w jednej probówce. Wirować komórki przez pięć minut przy 300 do 350 Gs w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu usunąć nadsącz i resuspendować osad w 10 mils w temperaturze czterech stopni Celsiusza.Do pożywki kompletnej dodać taką samą objętość medium do mrożenia w temperaturze czterech stopni, dokładnie wymieszać komórki, a następnie umieścić probówkę na lodzie i policzyć komórki. Używając komory Counting Chamber, rozcieńczyć zawiesinę dodatkowym medium do mrożenia, aby uzyskać końcowe stężenie komórek wynoszące 1 milion lub 10 milionów komórek na mililitr w przypadku mrożenia komórek z niemal w pełni zrosłej kolby o wymiarach 25 cm². Zawiesić ponownie w około 3 ml medium do mrożenia, a następnie nanieść alikwoty zawiesiny komórkowej o objętości 1 ml do oznakowanych krioprobówek o pojemności 2 ml.Należy upewnić się, że nakrętki fiolek są szczelnie dokręcone. Umieścić fiolki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na czas od jednej godziny do całej nocy, a następnie przenieść je do zbiornika z ciekłym azotem. Zamrażanie komórek z hodowli zawiesinowej opiera się na tej samej zasadzie co zamrażanie komórek z hodowli monowarstwy.Główną różnicą jest to, że hodowle w zawiesinie nie wymagają wstępnej trypsynizacji. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i wiruj przez 10 minut przy 300 do 350 Gs w temperaturze pokojowej. Następnie odlej supernatant i resuspenduj osad w medium do mrożenia w temperaturze 4°C, aby uzyskać gęstość od 1 miliona do 10 milionów komórek na ml.Następnie przenieś alikwoty zawiesiny komórkowej o objętości 1 ml do krioprobówek i zamroź. Podobnie jak w przypadku kultur monowarstwowych, co zostało przedstawione w poprzednim rozdziale, rozmroź i odzyskaj zamrożone probówki. Najpierw wyjmij probówkę z komórkami z zamrażarki z ciekłym azotem i natychmiast umieść ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.Ciągle wstrząsaj fiolką, aż pożywka zostanie rozmrożona, co zazwyczaj zajmuje mniej niż 60 sekund. Po rozmrożeniu przetrzyj górną część fiolki 70% etanolem przed otwarciem. Następnie przenieś zawiesinę rozmrożonych komórek do sterylnej probówki do wirowania zawierającej 2 mL ciepłej kompletnej pożywki i 20% płodowej surowicy bydlęcej, a następnie odwiruj.Wirować przez 10 minut przy 150 do 200 Gs w temperaturze pokojowej. Krok ten usunie resztki DMSO. Po wirowaniu odlać supernatant i delikatnie resuspender osad komórkowy w niewielkiej ilości, około 1 ml, kompletnego medium z 20% FBS. Przenieść zawiesinę do odpowiednio oznakowanej płytki hodowlanej zawierającej właściwą ilość medium. Zazwyczaj wymagany jest 1 ml zawiesiny komórkowej na 5 do 20 ml medium.Teraz komórki można umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby rosły przez 24 godziny. Należy upewnić się, że komórki przytwierdziły się do płytki; po pięciu do siedmiu dniach lub w momencie zmiany barwy wskaźnika pH w pożywce należy wymienić medium. Kultury należy utrzymywać w pożywce zawierającej 20% FBS do czasu ponownego ustanowienia linii komórkowej.Jeśli stopień odzysku jest ekstremalnie niski, może to oznaczać, że rozwija się jedynie subpopulacja pierwotnej hodowli. Należy zachować szczególną ostrożność w tym zakresie podczas pracy z liniami komórkowymi znanymi z występowania mozaicyzmu. W przypadku konieczności transportu hodowli, można to łatwo przeprowadzić zarówno dla kultur monowarstwowych, jak i zawiesinowych.W 25-centymetrowych kolbach do hodowli tkankowej komórki są hodowane do niemal pełnej konfluencji w monowarstwie lub do pożądanej gęstości w zawiesinie. W przypadku hodowli monowarstwowych najpierw usuwa się pożywkę, a następnie napełnia kolbę świeżą pożywką. Niezbędne jest całkowite napełnienie kolby pożywką, aby zapobiec wysychaniu komórek w przypadku odwrócenia kolb podczas transportu.W przypadku świeżych kultur w zawiesinie, dodaje się pożywkę, aby wypełnić kolbę. Nakrętkę mocno dokręca się i zabezpiecza za pomocą parafiny. Kolbę zamyka się w szczelnym plastikowym worku lub innym szczelnym pojemniku zaprojektowanym w celu zapobiegania wyciekom.W przypadku uszkodzenia kolby, główny pojemnik umieszcza się w wtórnym pojemniku izolacyjnym, aby chronić go przed ekstremalnymi temperaturami podczas transportu. Na zewnątrz opakowania nakleja się etykietę ostrzegawczą o zagrożeniu biologicznym. Zazwyczaj kultury są transportowane kurierami w trybie przesyłki tego samego dnia lub nocnej.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak zamrażać i rozmrażać hodowle ludzkich komórek, zarówno w przypadku komórek adherentnych, jak i zawiesinowych. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich eksperymentach.

freezing-thawing-and-packaging-cells-for-transport

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Komórki zamrażające, rozmrażające i pakujące do transportu

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium zawiesza barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych.

Zamrażanie komórek ES człowieka

Od czasu opracowania przez Jamesa Thomsona i współpracowników w 1998 roku techniki izolacji i hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hES) in vitro, zamrażanie komórek do późniejszego wykorzystania oraz rozmrażanie i namnażanie komórek z zapasów mrożonych stały się istotnymi procedurami wykonywanymi w rutynowej hodowli komórek hES. Ponieważ komórki hES są bardzo wrażliwe na stresy towarzyszące zamrażaniu i rozmrażaniu, należy zachować szczególną ostrożność. W niniejszym materiale...

Mrożenie i rozmrażanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Liofilizacja jest często łatwym i wygodnym sposobem pozyskiwania suchych produktów zawierających żywe komórki bakteryjne. Kluczowym problemem w tym procesie jest przeżywalność komórek. Opisujemy tutaj procedurę pozwalającą zbadać, w jaki sposób przeżywalność komórek podczas liofilizacji jest kształtowana przez właściwości zastosowanej formulacji.

Składy do liofilizacji bakterii i ich wpływ na przeżywalność komórek

Uzyskanie wysokiej jakości obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku komórek roślinnych, które mają obfite duże wakuole wypełnione wodą i napowietrzone przestrzenie. Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zastępowanie przez zamrażanie znacznie skracają czas przygotowania próbek roślinnych do TEM, jednocześnie wytwarzając próbki o doskonałej konserwacji ultrastrukturalnej.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Linie komórkowe Drosophila są ważnymi odczynnikami zarówno dla badań podstawowych, jak i biomedycznych. Ten artykuł zawiera protokoły rozmrażania, subhodowli i kriokonserwacji powszechnie stosowanych linii komórkowych Drosophila, aby pomóc naukowcom w włączeniu tych odczynników do ich badań.

Rozmrażanie, hodowla i kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Naucz się zamrażać i rozmrażać komórki ssacze w celu długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie. Techniki te zapewniają zachowanie żywotności komórek i są kluczowe dla badań w biologii komórki.

Mrożenie, rozmrażanie i pakowanie komórek do transportu

Przeglądaj więcej filmów