Nagrania całokomórkowe światła wywołały pobudzające prądy synaptyczne w warstwie siatkówki

Dzisiaj pokażę Ci, jak przygotować plastry siatkówki salamandry tygrysiej do nagrań z klamrą łatkową. W pierwszej kolejności przygotuję dwa rodzaje preparatów mikroskopowych. Używamy szkiełek, które mają dobrze przymocowany klej, dzięki czemu możemy używać ich jako komór na płyny.

Na pierwszym slajdzie umieszczam dwa równoległe pasma smaru próżniowego. Następnie biorę bibułę filtracyjną i kroję ją na prostokątne kawałki z podniesieniem światła. Teraz kładę jeden z elementów na szynach smarowych i dociskam go w dół, aby był dobrze przymocowany do suwaka.

To samo robię z drugim kawałkiem. Drugi rodzaj zjeżdżalni ma przyklejone małe gumowe klocki. Na razie po prostu dodaję trochę tłuszczu próżniowego Pomiędzy blokami wkładam też nowy kawałek żyletki do krajalnicy do chusteczek.

Na koniec wyłożyłem narzędzia, które będą mi potrzebne podczas sekcji, czyli dwie pary kleszczy, jedną parę nożyczek i narzędzie do zdjęcia oka z głowy w celu zarejestrowania prądów wywołanych światłem. Sekcję należy przeprowadzić w świetle podczerwonym, ale dla celów demonstracyjnych będę teraz pracował w świetle. Najpierw zdejmuję oko i umieszczam je pod mikroskopem na kawałku bibuły, którą zwilżam lodowatym roztworem dzwonka.

Następnie usuwam dodatkową tkankę łączną z gałki ocznej, aby upewnić się, że nie uszkodzi ona oka. Zawsze tnę wzdłuż powierzchni. To jest to, co widzisz przez mikroskop.

Następnie używam żyletki, aby zrobić małe nacięcie w rogówce. Aby to zrobić, przytrzymuję oko kleszczami, jednocześnie dociskając krawędź żyletki do rogówki. Następnie przytrzymuję rogówkę kleszczami, jednocześnie usuwając ją nożyczkami, aby wyjąć soczewkę.

Wywieram pewien nacisk na krawędzie muszli ocznej, aby móc łatwo uzyskać dostęp do soczewki za pomocą kleszczyków. Następnie usuwam tęczówkę. Trzymam się tęczówki kleszczami, przecinając wzdłuż serato aury, aż zostanie tylko muszla oczna.

Następnie pokroiłem kubek I na dwie prostokątne części. Najpierw przeciąłem go na pół, a następnie przyciąłem górną i dolną krawędź. Teraz biorę jeden z przygotowanych wcześniej preparatów, biorę kawałek I kubka i kładę go siatkówką stroną do dołu na bibule filtracyjnej.

Następnie podciągam tę twardówkę tak, aby na szkiełku pozostała tylko siatkówka. Po tym, szybko dodaję, zadzwoń do naszego roztworu do komory. Powtórzmy procedurę dla drugiego fragmentu siatkówki.

Ale tym razem możesz obserwować przez mikroskop, kładąc siatkówkę na bibule filtracyjnej. Używam kleszczy w lewej ręce, aby ostrożnie docisnąć twardówkę. Na koniec pokroiłem siatkówkę na plastry o szerokości od 200 do 300 mikrometrów.

Następnie wybieram wycinek, który ma być używany do moich eksperymentów. Aby wybrać dobry plasterek, muszę obrócić plasterki o 90 stopni, aby zobaczyć warstwy siatkówki. Wybieram plasterek, który wygląda na nieuszkodzony i ma wyraźne poziome paski wskazujące różne warstwy.

Aby przenieść slajdy z jednego slajdu na drugi, tworzę mostek dzwonka, a następnie ostrożnie przesuwam slajdy przez rozwiązanie. Kiedy odkładam plasterek, dociskam go do gumowych klocków, tak aby bibuła filtracyjna była skierowana pionowo do szkła. Teraz jestem gotowy do nagrywania z zaciskiem krosowym.

Roztwór wewnątrzkomórkowy przechowujemy w małych porcjach w zamrażarce, tak aby w ciągu jednego dnia zobaczyliśmy tylko taką ilość, jakiej faktycznie potrzebujemy. Przed napełnieniem elektrod filtrujemy roztwór, aby usunąć małe cząsteczki, które mogłyby taktować końcówkę elektrody. Elektrody krosowe są pobierane ze szkła kapilarnego z krzemianu w celu rejestracji z komórek zwojowych.

Wybieram ustawienie, które wytworzy rezystancję elektrody między dwoma a czterema megaomami. Kiedy napełniam elektrody, chcę się upewnić, że w końcówce elektrody nie ma pęcherzyków powietrza. Przesuwanie szkła palcem pomaga usunąć bąbelki.

Jest to uchwyt elektrody przymocowany do stopnia głowicy. Wałek elektryczny zawiera drut z chlorku srebra. To jest elektroda uziemiająca z mostkiem niga.

Oto pipeta perfuzyjna. Jest podłączony do ośmiokanałowego systemu mikroperfuzji. Główna perfuzja jest napędzana grawitacyjnie, więc jest to po prostu butelka wypełniona skrzydłami, a roztwór spływa przez tę rurkę do komory nagrywającej.

Aby móc nagrywać w ciemności, mam kamerę na podczerwień podłączoną do bocznego portu mikroskopu, który jest podłączony do ekranu telewizora. Na górnym porcie podłączyłem projektor obrazu, który pozwala mi na projekcję bodźców wzrokowych na siatkówkę. I wreszcie wzmacniacz z zaciskiem krosowym.

Teraz umieszczam wycinek siatkówki pod mikroskopem i dodaję elektrodę uziemiającą do kąpieli, aby ustawić główną obfitość. A następnie dodaj rurkę z systemu profuzji grawitacyjnej. Szklana rurka po drugiej stronie jest podłączona do ssania próżniowego, które utrzymuje stały poziom płynu.

Upewniam się również, że rura ssąca jest podłączona do ramienia elektrycznego. Następnie ustawiam pipetę do mikroperfuzji. Opuszczam go w wannie, podążając za obiektywem mikroskopu.

Gdy zbliżę się do plasterka, odciągam go trochę do tyłu, aby roztwór uderzył w plasterek. Kiedy włączam perfuzję, powinienem zobaczyć, jak plasterek porusza się lekko jak tutaj. Poszukajmy teraz dobrej komórki do nagrywania.

Szukamy komórek zwojowych, które znajdują się na dole plasterka. Teraz przygotowuję elektrodę przed wejściem do kąpieli z elektrodą, dodaję trochę nadciśnienia. Kiedy już znalazłem elektrodę pod mikroskopem, opuściłem ją pod prawą stronę nad plasterkiem, aby przykleić ją do komórki.

Przerzuciłem się na obiektyw 40x. Teraz zeruję prąd bazowy i sprawdzam rezystancję elektrody. Test szczelności to sekwencja impulsów o napięciu 10 miliwoltów, która pomaga mi sprawdzić, czy udało mi się uzyskać szczelne uszczelnienie między elektrodą a ogniwem.

Teraz opuszczam elektrodę na ogniwo docelowe. Gdy widzę wgłębienie na ciele komórki, uwalniam nadciśnienie z rurki, co zapewnia szczelne uszczelnienie. Rezystancja jest teraz tak wysoka, że ścieżka prądu wygląda na płaską.

Małe kolce są artefaktami pojemności z elektrody. Można je skompensować w ten sposób, więc teraz już ich nie ma. Więc teraz spróbuję włamać się do komórki.

Aby to zrobić, ostrożnie umieszczam małe impulsy ssące na rurce podłączonej do ramienia elektrody i jeśli wszystko działa dobrze, widzisz, że ścieżka prądu zmienia się w ten sposób. Kolce, które teraz widzisz, są przecinane przez pojemność membrany, a także można je skompensować, teraz jest to preparat, który został przygotowany w ciemności. Zobaczmy, czy uda nam się zarejestrować reakcje wywołane światłem.

Ślad, który można zobaczyć na oscyloskopie, to odpowiedź prądowa napięcia ogniwa zwojowego zaciśniętego na minus 60 miliwoltów. Wykorzystywane przez nas bodźce świetlne to jasne i ciemne paski prezentowane na stałym, jednolitym tle. Nasze oprogramowanie do użytku laboratoryjnego pokazuje pełny zapis jednego badania.

Można zauważyć, że jest to komórka wyłączona jako odpowiedź na pojawienie się ciemnego paska i przesunięcie jasnego paska. Biała linia na górze wskazuje czas trwania bodźca. Możemy teraz przeprowadzać eksperymenty, w których perfuzjonujemy różne środki farmakologiczne.

Na przykład, możemy zablokować synergiczne hamowanie GABA-ergiczne i Gly. Po odczekaniu mniej niż jednej minuty możemy zwykle zacząć widzieć efekty działania leku tutaj. Odzew stawał się coraz silniejszy i bardziej długotrwały.

Preparat do wycinka siatkówki jest szeroko stosowany do rejestrowania prądów synaptycznych z różnych komórek siatkówki, a jeśli doda się barwnik fluorescencyjny do roztworu elektrody, można łatwo potwierdzić typ komórki. Anatomicznie używamy tutaj larwy salamandry TGA jako modelu zwierzęcego. Fakt, że salamandry są zwierzętami zmiennocieplnymi i mają duże komórki siatkówki, zapewnia korzystne warunki rejestrowania, ale tę samą technikę można zastosować do preparatów ssaków.