Name: Nagrania całokomórkowe światła wywołały pobudzające prądy synaptyczne w warstwie siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: Poznaj technikę całokomórkowych nagrań prądów wywołanych światłem w siatkówce salamandry tygrysiej. Ta metoda pozwala badać przetwarzanie wzrokowe na poziomie pojedynczych neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

&nbsp;Roztwory
<ul>
<li>Roztwór wewnątrzkomórkowy dla komórek zwojowych (w mM): 100 K-glukonian, 8 KCl, 1 MgCl2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, .5 GTP, 90 µM sulforodaminy B (do barwienia), pH dostosowane do 7.4 za pomocą KOH </li>
<li>Roztwór wewnątrzkomórkowy dla komórek bipolarnych (w mM): 90 K-glukonian, 8 KCl , 1 MgCl2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, .5 GTP, 90 µM sulforodaminy&nbsp; B (do barwienia), pH dostosowane do 7.4 za pomocą KOH </li>
<li>Pozakomórkowy roztwór Ringera (w mM): 112 NaCl, 5 glukoza, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, pH dostosowane do 7.75 za pomocą NaOH. Natlenianie roztworu nie jest konieczne. </li>
</ul>
Przygotowanie komór rejestracyjnych
Nasza komora rejestracyjna składa się z szkiełka przedmiotowego z przylepnym dołkiem, w którym umieszczone są niewielkie bloki silikonowe wycięte z innego dołka, aby zapewnić stabilność skrawków tkanki.
Przygotowanie skrawków siatkówki
Aby uniknąć blaknięcia fotoreceptorów, sekcję przeprowadza się w świetle IR lub słabym czerwonym świetle. W przypadku chęci rejestracji odpowiedzi z drogi pręcików należy stosować wyłącznie światło IR (mikroskop sekcyjny IR i brak światła pokojowego; do procedur wykonywanych poza mikroskopem należy używać dodatkowych gogli IR). Jeśli głównym celem jest rejestracja odpowiedzi świetlnych czopków, można zastosować słabe czerwone światło pokojowe lub czerwoną latarkę. Mikroskop powinien jednak nadal być wyposażony w okulary IR.
Jeśli sygnały wejściowe z fotoreceptorów są nieistotne dla eksperymentu, procedury można przeprowadzać w normalnym świetle pokojowym, korzystając ze zwykłego mikroskopu.
<ol>
<li>Przygotować dwa szkiełka przedmiotowe z silikonową studzienką adhezyjną: na każdym szkiełku nanieść dwa równoległe pasma smaru silikonowego (w odstępie ok. 0,5 cm), a następnie na jednej stronie szkiełka umieścić prostokątny kawałek papieru filtracyjnego, przecinający oba pasma smaru (docisnąć papier filtracyjny częścią żyletki, aby dobrze przylegał do szkiełka)</li>
<li>Uśmiercić salamandrę zgodnie z ustalonymi protokołami: zwierzę umieszcza się w kąpieli lodowej na 30 minut, następnie dokonuje się dekapitacji i podwójnego zniszczenia rdzenia przedłużonego (double-pithing)</li>
<li>Usunąć gałkę oczną z głowy salamandry i umieścić ją pod mikroskopem stereoskopowym na kawałku ręcznika papierowego zwilżonego lodowatym roztworem Ringera</li>
<li>Usunąć tkankę łączną z oka</li>
<li>Za pomocą żyletki wykonać niewielkie nacięcie w rogówce</li>
<li>Przytrzymać naciętą rogówkę pęsetą, usuwając ją nożyczkami wzdłuż miejsca przyczepu do oka</li>
<li>Usunąć soczewkę za pomocą pęsety</li>
<li>Przytrzymać tęczówkę pęsetą i przeciąć wzdłuż ora serrata, aby usunąć tęczówkę</li>
<li>Przeciąć czaszkę gałki ocznej na dwa prostokątne kawałki</li>
<li>Podnieść jeden z kawałków i położyć go stroną twardówki do góry na papierze filtracyjnym (należy upewnić się, że fragment jest rozprostowany, dociskając go bardzo ostrożnie)</li>
<li>Delikatnie oddzielić twardówkę od siatkówki, która powinna pozostać przyczepiona do papieru filtracyjnego</li>
<li>Szybko dodać lodowaty roztwór Ringera do studzienki</li>
<li>Powtórzyć tę samą procedurę dla drugiego fragmentu</li>
<li>Użyć żyletki umieszczonej w specjalnie wykonanym przyrządzie do krojenia, aby wykonać plastry o szerokości 200-300µm</li>
<li>Za pomocą pęsety podnieść plastry z brzegu papieru filtracyjnego, obrócić je tak, aby widoczne były warstwy siatkówki, i umieścić je na pasmach smaru próżniowego</li>
<li>Wybrać plaster, który wygląda na nieuszkodzony i wykazuje poziome pasma wskazujące na warstwy siatkówki (warstwy te są czasami trudne do zauważenia pod mikroskopem stereoskopowym ze względu na zbyt małe powiększenie, jednak jeśli można rozpoznać pewną warstwowość, plaster jest zazwyczaj wystarczający. Ostateczna decyzja o wykorzystaniu plastra zapada po obejrzeniu go pod mikroskopem prostym). Przenieść go na szkiełko komory rejestracyjnej, tworząc mostek z roztworu Ringera między dwoma szkiełkami</li>
<li>Upewnić się, że papier filtracyjny jest dociśnięty do bloków gumowych w komorze rejestracyjnej, tak aby plaster nie był pochylony (komórki zwojowe i fotoreceptory powinny znajdować się w ostrości jednocześnie)</li>
</ol>
Umieszczenie tkanki w zestawie rejestracyjnym
<ol>
<li>Preparat na szkiełku do rejestracji umieszcza się pod mikroskopem i perfunduje roztworami Ringera za pomocą grawitacyjnego systemu perfuzji.</li>
<li>Preparat wizualizuje się za pomocą mikroskopu pionowego z obiektywami imersyjnymi wodnymi 10x i 40x.</li>
<li>Ponownie, w celu zapobiegania blaknięciu fotoreceptorów, stosuje się wyłącznie światło IR. Do portu bocznego mikroskopu przymocowana jest kamera IR, która jest połączona z ekranem telewizyjnym.</li>
</ol>
Stymulacja wzrokowa
Bodźce wzrokowe są programowane w środowisku Matlab z wykorzystaniem biblioteki Psychtoolbox i rzutowane na siatkówkę przez górny port mikroskopu za pomocą iniektora obrazu mikroskopowego (Mbf bioscience). Procesor wideo Bits++ Digital Video Processor (Cambridge Research Systems) służy do uzyskania 14-bitowej skali luminancji oraz do synchronizacji prezentacji bodźców z akwizycją danych. Bodźce wzrokowe wykorzystane w tym materiale wideo to jasne lub ciemne paski (szerokość = 460µm) o kontraście 100%, które były prezentowane przez dwie sekundy na stałym, jednolitym tle (luminancja = 8 * 104 photons/µm/s, rozmiar: 1.84 x 1.38mm).
Elektrofizjologia
<ul>
<li>Elektrody do patch-clampu są wytwarzane z borokrzemowego szkła (OD: 1.5mm, ID: .84mm) przy użyciu wyciągacza mikropipet. W przypadku komórek zwojowych stosuje się rezystancje od 2 do 4 MOhms. Dla komórek bipolarnych stosowane są wyższe rezystancje, w zakresie od 4 do 8 MOhms.</li>
<li>Rejestracje metodą Voltage Clamp są przeprowadzane przy użyciu wzmacniacza Multiclamp 700A (Molecular Devices) oraz wewnętrznego oprogramowania laboratoryjnego zaprogramowanego w Labview.</li>
<li>Leki są podawane za pomocą 8-kanałowego systemu perfuzji. Elektrodę do mikroperfuzji umieszcza się blisko skrawka (tkanka powinna widocznie poruszać się podczas włączania i wyłączania perfuzji, jednak należy uważać, aby ciśnienie nie było zbyt silne, co mogłoby spowodować oddzielenie skrawka od papieru filtrującego). Podczas eksperymentów mikroperfuzja powinna być stale włączona (podając roztwór kontrolny, jeśli leki nie są wymagane), aby rejestracja nie była zakłócana przez włączanie i wyłączanie perfuzji.</li>
</ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

Korzyści:
<ol>
<li>Wszystkie typy komórek są dostępne </li>
<li>Łatwa identyfikacja typów komórek, w szczególności po dodaniu barwnika fluorescencyjnego do roztworu elektrody </li>
<li>Środki farmakologiczne mogą łatwo dotrzeć do komórek docelowych </li>
<li>Technika patch clamp pozwala na badanie roli różnych kanałów jonowych w obliczeniach siatkówki. Tych samych informacji nie można uzyskać za pomocą pozakomórkowych rejestracji impulsów (spike recordings) ani rejestracji za pomocą ostrych elektro...

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>Wzmacniacz patch-clamp</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Mikroskop do sekcji</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Wyposażony w obiektywy 40x i 10x z imersją w wodzie, filtry fluorescencyjne oraz lampę rtęciową</td></tr><tr><td>P-97</td><td>Wytwornica mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>Iniektor obrazu mikroskopowego</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-channel perfusion system</td><td>Mikroperfuzja</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Cyfrowy procesor wideo</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared Oculars</td><td>Inne</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive silicone wells</td><td>Inne</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>średnica 20mm, głębokość 1,0mm</td></tr><tr><td>Membrane Filters</td><td>Filtr</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>Szkło elektrodowe</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters</td><td>Filtr</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>filtry 4mm, membrana nylonowa .2um, obudowa z polipropylenu</td></tr><tr><td>IR camera</td><td>Kamera montowana na mikroskopie</td><td>Sony Corporation</td><td>SPT-M324</td><td>Extrawave HAD, kamera wideo B7W</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole-4-acetic acid sodium salt</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>Larval tiger salamanders</td><td>Zwierzę</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Wykorzystujemy technikę patch clamp w konfiguracji whole-cell do badania obwodów synaptycznych leżących u podstaw przetwarzania informacji wizualnej w siatkówce. W tym filmie przeprowadzimy Państwa przez proces rejestracji prądów wywoływanych światłem w poszczególnych komórkach w preparacie przekroju siatkówki w konfiguracji whole-cell. Jako model zwierzęcy wykorzystujemy salamandrę tygrysią. Rozpoczynamy od opisu dysekcji oka i pokazujemy sposób montowania przekrojów do rejestracji elektrofizjologicznej. Po umieszczeniu przekroju w komorze pomiarowej demonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację w konfiguracji whole-cell voltage clamp. Następnie rzutujemy bodźce wizualne na fotoreceptory w przekroju, aby wywołać odpowiedzi w postaci prądów indukowanych światłem. Podczas rejestracji perfundujemy przekrój substancjami farmakologicznymi, przy czym 8-kanałowy system perfuzji pozwala nam na szybkie przełączanie się między różnymi odczynnikami. Preparat przekroju siatkówki jest szeroko stosowany do rejestracji metodą patch clamp w siatkówce, w szczególności do badania komórek amakrynowych lub bipolarnych, które nie są dostępne w preparatach całych warstw (whole-mount).

W niniejszym filmie przedstawiono proces rejestracji metodą voltage clamp w całej komórce (whole-cell) w skrawku siatkówki wodnego salamandry tygrysiej. Demonstrujemy przygotowanie skrawka oraz sposób przeprowadzania rejestracji metodą patch clamp podczas stymulacji wizualnej siatkówki.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

Stosujemy technikę patch clamp w konfiguracji whole-cell do badania obwodów synaptycznych leżących u podstaw przetwarzania informacji wizualnych w siatkówce. W tym filmie...

Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować skrawki siatkówki salamandry tygrysiej do rejestracji metodą patch clamp. Najpierw przygotuję dwa rodzaje szkiełek przedmiotowych. Używamy szkiełek z przymocowaną do nich przylepną komorką, dzięki czemu możemy wykorzystać je jako komory z cieczą.Na pierwszym szkiełku przedmiotowym nanoszę dwa równoległe pasma smaru próżniowego. Następnie biorę papier filtrujący i wycinam z niego prostokątne kawałki o szerokości kilku milimetrów. Teraz kładę jeden z kawałków na szynach ze smaru i dociskam go, aby dobrze przylegał do szkiełka.Postępuję analogicznie z pozostałą częścią. Drugi rodzaj szkiełka ma przyklejone małe gumowe bloczki. Na ten moment nakładam odrobinę smaru próżniowego pomiędzy bloczki, a w mikrotomie do tkanek umieszczam nowe ostrze żyletki.Na koniec przygotowuję narzędzia niezbędne do sekcji: dwie pary pęset, jedną parę nożyczek oraz narzędzie do usunięcia oka z głowy w celu rejestracji prądów wywołanych światłem. Sekcję należy przeprowadzać w świetle IR, jednak w celach demonstracyjnych będę teraz pracować w świetle widzialnym. Najpierw usuwam oko i umieszczam je pod mikroskopem na kawałku ręcznika papierowego, który nawilżyłem lodowat

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rejestrowanie całego piksela światła wywołanych komórkowo pobudzających prądów synaptycznych na przekroju siatkówki

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Film opisuje elektrofizjologiczny zapis synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych w wycinkach mózgu myszy. Plastry zawierające grzbietowe jądro kolankowate boczne (dLGN) umieszcza się w komorze rejestracyjnej. Pipetę stymulującą umieszcza się na przewodzie wzrokowym w celu stymulacji komórek zwojowych siatkówki (RGC) i zbadania synaps retinogenikulacyjnych lub jądra reticularis thalami w celu stymulacji neuronów korowych i zbadania synaps kortogenicznych. Po stymulacji RGC i neurony...

Badanie elektrofizjologiczne synaps retinogenikulacyjnych i kortykopochodnych w wycinkach mózgu myszy

Ten film demonstruje rejestrację wywołanych światłem reakcji postsynaptycznych w dostosowanym do ciemności preparacie tkanki siatkówki myszy. Wycinek siatkówki umieszcza się w komorze rejestrującej, a pipeta rejestrująca służy do ustalenia ciągłości elektrycznej z komórką zwojową siatkówki. Impulsy świetlne są stosowane do generowania pobudzających potencjałów postsynaptycznych w komórkach zwojowych, które są rejestrowane przez pipetę.

Wywołane światłem reakcje postsynaptyczne w neuronach wycinków siatkówki myszy

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu zawierających jądro kolankowate boczne oraz badania elektrofizjologicznego funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych. Protokół ten zapewnia skuteczny sposób badania synaps z wysokim i niskim prawdopodobieństwem uwalniania w tych samych ostrych wycinkach mózgu.

Badania elektrofizjologiczne funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Poznaj technikę całokomórkowych nagrań prądów wywołanych światłem w siatkówce salamandry tygrysiej. Ta metoda pozwala badać przetwarzanie wzrokowe na poziomie pojedynczych neuronów.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

Przeglądaj więcej filmów