Rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować skrawki siatkówki salamandry tygrysiej do rejestracji metodą patch clamp. Najpierw przygotuję dwa rodzaje szkiełek przedmiotowych. Używamy szkiełek z przymocowaną do nich przylepną komorką, dzięki czemu możemy wykorzystać je jako komory z cieczą.

Na pierwszym szkiełku przedmiotowym nanoszę dwa równoległe pasma smaru próżniowego. Następnie biorę papier filtrujący i wycinam z niego prostokątne kawałki o szerokości kilku milimetrów. Teraz kładę jeden z kawałków na szynach ze smaru i dociskam go, aby dobrze przylegał do szkiełka.

Postępuję analogicznie z pozostałą częścią. Drugi rodzaj szkiełka ma przyklejone małe gumowe bloczki. Na ten moment nakładam odrobinę smaru próżniowego pomiędzy bloczki, a w mikrotomie do tkanek umieszczam nowe ostrze żyletki.

Na koniec przygotowuję narzędzia niezbędne do sekcji: dwie pary pęset, jedną parę nożyczek oraz narzędzie do usunięcia oka z głowy w celu rejestracji prądów wywołanych światłem. Sekcję należy przeprowadzać w świetle IR, jednak w celach demonstracyjnych będę teraz pracować w świetle widzialnym. Najpierw usuwam oko i umieszczam je pod mikroskopem na kawałku ręcznika papierowego, który nawilżyłem lodowatym roztworem Ringera.

Następnie usuwam nadmiar tkanki łącznej z gałki ocznej, aby upewnić się, że nie uszkodzi ona oka. Zawsze wykonuję cięcie wzdłuż powierzchni. To jest obraz widoczny przez mikroskop.

Następnie za pomocą żyletki wykonuję niewielkie nacięcie w rogówce. W tym celu przytrzymuję oko pęsetą, jednocześnie dociskając krawędź żyletki do rogówki. Następnie chwytam rogówkę pęsetą i usuwam ją za pomocą nożyczek, aby wyciągnąć soczewkę.

Wywieram lekki nacisk na krawędzie oczodołu, aby uzyskać łatwy dostęp do soczewki za pomocą pęsety. Następnie usuwam tęczówkę. Przytrzymuję tęczówkę pęsetą, przecinając tkankę wzdłuż aura serato, aż pozostanie tylko sam oczodół.

Następnie przecinam kubek I na dwa prostokątne kawałki. Najpierw przecinam go na pół, a potem przycinam górną i dolną krawędź. Teraz biorę jedno z wcześniej przygotowanych szkiełek, podnoszę kawałek kubka I i kładę go stroną siatkówki do dołu na papierze filtrującym.

Następnie odciągam twardówkę tak, aby na szkiełku pozostała tylko siatkówka. Po tym szybko dodaję roztwór płuczący do komory. Powtórzmy tę procedurę dla drugiego fragmentu siatkówki.

Tym razem można jednak obserwować proces przez mikroskop podczas kładzenia siatkówki na papierze filtracyjnym. Używam pęsety w lewej ręce, aby ostrożnie docisnąć twardówkę. Na koniec tnę siatkówkę na plastry o szerokości od 200 do 300 µm.

Następnie wybieram skrawek do wykorzystania w moich eksperymentach. Aby wybrać odpowiedni skrawek, muszę obrócić go o 90 stopni, tak aby móc zobaczyć warstwy siatkówki. Wybieram skrawek, który wygląda na nieuszkodzony i wykazuje wyraźne poziome pasma wskazujące na poszczególne warstwy.

Aby przenieść skrawki z jednego szkiełka na drugie, tworzę mostek z roztworu Ringera, a następnie ostrożnie przesuwam skrawki wewnątrz roztworu. Po ułożeniu skrawka dociskam go do gumowych bloków w taki sposób, aby papier filtrujący był ustawiony pionowo względem szkła. Teraz jestem gotowy do rejestracji metodą patch clamp.

Roztwór wewnątrzkomórkowy przechowujemy w zamrażarce w małych porcjach, aby rozmrażać tylko taką ilość, jaka jest nam potrzebna w ciągu jednego dnia. Przed napełnieniem elektrod filtrujemy roztwór, aby usunąć drobne cząsteczki, które mogłyby zablokować końcówkę elektrody. Elektrody do patch-clampu są wyciągane z borokrzemianowych kapilar szklanych w celu rejestracji sygnałów z komórek zwojowych.

Wybieram ustawienie ssania, które pozwoli uzyskać oporność elektrod w zakresie od 2 do 4 MΩ. Podczas napełniania elektrod należy upewnić się, że w ich końcówkach nie ma pęcherzyków powietrza. Delikatne stuknięcie w szkło palcem pomaga usunąć pęcherzyki.

Jest to uchwyt elektrody przymocowany do stopnia głowicowego. Rolka elektrody zawiera drucik z chlorku srebra. Jest to elektroda uziemiająca z mostkiem agarowym.

Oto pipeta perfuzyjna. Jest ona podłączona do ośmiokanałowego systemu mikroperfuzji. Główna perfuzja odbywa się grawitacyjnie, zatem jest to po prostu butelka wypełniona roztworami Wingera, a roztwór spływa przez tę rurkę do komory rejestracyjnej.

Aby móc rejestrować obraz w ciemności, do bocznego portu mikroskopu podłączyłam kamerę IR, która jest połączona z ekranem telewizora. Do portu górnego podłączyłam projektor obrazu, który umożliwia mi rzutowanie bodźców wizualnych na siatkówkę. I na koniec, wzmacniacz patch-clamp.

Teraz umieszczam skrawek siatkówki pod mikroskopem i dodaję elektrodę uziemiającą do kąpieli, aby przygotować główną perfuzję. Następnie dodaję rurkę z grawitacyjnego systemu perfuzji. Szklana rurka po przeciwnej stronie jest podłączona do ssania próżniowego, co pozwala utrzymać stały poziom cieczy.

Upewniam się również, że rurka ssąca jest podłączona do elektrody ramiennej. Następnie ustawiam pipetę do mikroperfuzji. Opuszczam ją do kąpieli, a następnie robię to samo z obiektywem mikroskopu.

Gdy zbliżę się do skrawka, nieco go odsuwam, aby roztwór uderzył w skrawek. Po włączeniu perfuzji skrawek powinien lekko się poruszyć, tak jak tutaj. Poszukajmy teraz odpowiedniej komórki do rejestracji.

Szukamy komórek zwojowych, które znajdują się w dolnej części skrawka. Przed wprowadzeniem elektrody do kąpieli przygotowuję ją, przykładając niewielkie nadciśnienie. Po zlokalizowaniu elektrody pod mikroskopem, opuszczam ją bezpośrednio nad skrawkiem, aby przeprowadzić patch-clamp komórki.

Przełączyłem na obiektyw 40 x. Teraz zeruję prąd bazowy i sprawdzam rezystancję elektrody. Test szczelności polega na podaniu serii impulsów o wartości 10 mV, co pozwala mi sprawdzić, czy udało się uzyskać szczelne połączenie między elektrodą a komórką.

Następnie opuszczam elektrodę na komórkę docelową. Gdy zauważę wgłębienie w ciele komórki, zwalniam ciśnienie dodatnie z rurki, co pozwala na utworzenie szczelnego uszczelnienia. Rezystancja staje się wówczas na tyle wysoka, że zapis prądu wygląda na płaski.

Małe piki to artefakty pojemnościowe elektrody. Można je skompensować w następujący sposób, dzięki czemu teraz zniknęły. Teraz spróbuję przebić się do wnętrza komórki.

Aby to osiągnąć, delikatnie przykładam krótkie impulsy ssące do rurki połączonej z ramieniem elektrody i jeśli wszystko przebiegnie pomyślnie, można zaobserwować zmianę zapisu prądu w ten sposób. Widoczne teraz piki wynikają z pojemności błony, którą można teraz skompensować; obecna preparatyka została przygotowana w ciemności. Sprawdźmy, czy jesteśmy w stanie zarejestrować odpowiedzi wywołane światłem.

Ślad widoczny na oscyloskopie to odpowiedź prądowa komórki zwojowej przy napięciu zaciskanym na poziomie -60 mV. Jako bodźce świetlne stosujemy jasne i ciemne paski prezentowane na jednolitym, stałym tle. Oprogramowanie używane w naszym laboratorium wyświetla pełny zapis jednego powtórzenia.

Widać, że jest to komórka typu „off”, reagująca na pojawienie się ciemnego paska i zanik paska jasnego. Biała linia u góry wskazuje czas trwania bodźca. Możemy teraz przeprowadzić eksperymenty, w których perfuzujemy różne środki farmakologiczne.

Na przykład możemy zablokować inhibicję GABAergiczną i glikinergiczną. Zazwyczaj po odczekaniu mniej niż jednej minuty zaczynamy obserwować tutaj efekty działania leku. Odpowiedź stała się silniejsza i bardziej przedłużona.

Przygotowanie skrawków siatkówki jest szeroko stosowane do rejestracji prądów synaptycznych z różnych komórek siatkówki, a dodanie barwnika fluorescencyjnego do roztworu w elektrodzie pozwala na łatwe potwierdzenie typu komórki. Pod względem anatomicznym w niniejszej pracy jako model zwierzęcy wykorzystujemy larwy salamandry TGA. Fakt, że salamandry są zwierzętami zmiennocieplnymi i posiadają duże komórki siatkówki, zapewnia korzystne warunki rejestracji, jednak tę samą technikę można zastosować w preparatach ssaków.