Rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować skrawki siatkówki salamandry tygrysiej do rejestracji metodą patch clamp. Najpierw przygotuję dwa rodzaje szkiełek przedmiotowych. Używamy szkiełek z przymocowaną studnią adhezyjną, co pozwala na wykorzystanie ich jako komór z cieczą.

Na pierwszym szkiełku przedmiotowym nakładam dwa równoległe pasma smaru próżniowego. Następnie biorę papier filtracyjny i wycinam z niego prostokątne kawałki o szerokości kilku milimetrów. Teraz kładę jeden z tych kawałków na prowadnicach ze smaru i dociskam go, aby dobrze przylegał do szkiełka.

To samo robię z drugim elementem. Drugi rodzaj szkiełka ma przyklejone małe gumowe bloczki. Na razie nakładam tylko niewielką ilość smaru próżniowego pomiędzy bloczki, a w mikrotomie do tkanek umieszczam nowe ostrze żyletki.

Na koniec przygotowuję narzędzia niezbędne podczas sekcji: dwie pęsety, jedną parę nożyczek oraz narzędzie do usunięcia oka z głowy w celu rejestracji prądów wywołanych światłem. Sekcję należy przeprowadzać w świetle IR, jednak w celach demonstracyjnych będę teraz pracować w świetle widzialnym. Najpierw usuwam oko i umieszczam je pod mikroskopem na kawałku papieru do tkanek, który nawilżyłem lodowatym roztworem Ringera.

Następnie usuwam nadmiar tkanki łącznej z gałki ocznej, aby mieć pewność, że nie uszkodzi ona oka. Zawsze nacinam wzdłuż powierzchni. Oto obraz widoczny pod mikroskopem.

Następnie za pomocą żyletki wykonuję niewielkie nacięcie w rogówce. W tym celu przytrzymuję oko pęsetą, jednocześnie naciskając krawędzią żyletki na rogówkę. Następnie stabilizuję rogówkę pęsetą i usuwam ją za pomocą nożyczek, aby wydobyć soczewkę.

Wywieram lekki nacisk na krawędzie oczodołu, aby uzyskać łatwy dostęp do soczewki za pomocą pęsety. Następnie usuwam tęczówkę. Przytrzymuję tęczówkę pęsetą, wykonując nacięcia wzdłuż aura serato, aż pozostanie jedynie oczodół.

Następnie przecinam kubek I na dwa prostokątne kawałki. Najpierw przecinam go na pół, a potem przycinam górną i dolną krawędź. Teraz biorę jedno z wcześniej przygotowanych szkiełek, podnoszę kawałek kubka I i kładę go siatkówką do dołu na papierze filtracyjnym.

Następnie odciągam tę twardówkę tak, aby na szkiełku pozostała tylko siatkówka. Po tym szybko dodaję do komory nasz roztwór pierścieniowy. Powtórzmy tę procedurę dla drugiego fragmentu siatkówki.

Tym razem można jednak obserwować proces przez mikroskop podczas kładzenia siatkówki na papierze filtracyjnym. Używam pęsety w lewej ręce, aby ostrożnie docisnąć twardówkę. Na koniec przecinam siatkówkę na plastry o szerokości od 200 do 300 µm.

Następnie wybieram skrawek do wykorzystania w moich eksperymentach. Aby wybrać odpowiedni skrawek, muszę obrócić go o 90 stopni, tak aby móc zobaczyć warstwy siatkówki. Wybieram skrawek, który wygląda na nieuszkodzony i wykazuje wyraźne poziome pasma wskazujące na poszczególne warstwy.

Aby przenieść skrawki z jednego szkiełka na drugie, tworzę mostek z roztworu Ringera, a następnie ostrożnie przesuwam skrawki przez ten roztwór. Kładąc skrawki, dociskam je do gumowych bloków w taki sposób, aby papier filtracyjny był zorientowany pionowo względem szkła. Teraz jestem gotowy do rejestracji metodą patch-clamp.

Roztwór wewnątrzkomórkowy przechowujemy w zamrażarce w małych porcjach, aby rozmrażać jedynie taką ilość, jaka jest nam potrzebna w ciągu jednego dnia. Przed napełnieniem elektrod filtrujemy roztwór w celu usunięcia drobnych cząstek, które mogłyby zablokować końcówkę elektrody. Elektrody do techniki patch-clamp są wyciągane z borokrzemianowych kapilar szklanych w celu rejestracji z komórek zwojowych.

Wybieram ustawienie ssania, które zapewni rezystancję elektrod w zakresie od dwóch do czterech megaomów. Podczas napełniania elektrod należy upewnić się, że w ich końcówkach nie pozostały pęcherzyki powietrza. Delikatne stuknięcie palcem w szkło pomaga usunąć pęcherzyki.

Jest to uchwyt elektrody przymocowany do wzmacniacza głowicowego. Rolka elektrody zawiera drut z chlorku srebra. Jest to elektroda uziemiająca z mostkiem agarowym.

Oto pipeta perfuzyjna. Jest ona podłączona do ośmiokanałowego systemu mikroperfuzji. Główna perfuzja odbywa się grawitacyjnie, dzięki butelce wypełnionej roztworem Wingera, który spływa przez tę rurkę do komory rejestracyjnej.

Aby móc rejestrować obraz w ciemności, do bocznego portu mikroskopu podłączyłem kamerę IR, która jest połączona z ekranem telewizora. Do portu górnego podłączyłem projektor obrazu, który umożliwia rzutowanie bodźców wizualnych na siatkówkę. I na koniec, wzmacniacz patch-clamp.

Następnie umieszczam przekrój siatkówki pod mikroskopem i dodaję elektrodę uziemiającą do kąpieli, aby przygotować główną perfuzję. W kolejnym kroku dodaję rurkę z grawitacyjnego systemu perfuzyjnego. Szklana rurka po drugiej stronie jest podłączona do ssania próżniowego, co pozwala na utrzymanie stałego poziomu cieczy.

Upewniam się również, że rurka ssąca jest podłączona do elektrody ramiennej. Następnie pozycjonuję pipetę do mikroperfuzji. Opuszczam ją do kąpieli, a następnie czynię to samo z obiektywem mikroskopu.

Gdy zbliżę się do skrawka, nieco go odsuwam, aby roztwór uderzył w skrawka. Po włączeniu perfuzji powinienem zauważyć lekkie poruszenie skrawka, tak jak tutaj. Teraz poszukajmy odpowiedniej komórki do rejestracji.

Szukamy komórek zwojowych, które znajdują się u podstawy skrawka. Przygotowuję elektrodę, a przed wprowadzeniem jej do kąpieli wywieram niewielkie nadciśnienie. Po zlokalizowaniu elektrody pod mikroskopem, opuszczam ją bezpośrednio nad skrawkiem, aby przeprowadzić patch-clamp komórki.

Przełączyłem na obiektyw 40 x. Teraz zeruję prąd bazowy i sprawdzam rezystancję elektrody. Test szczelności polega na podaniu sekwencji impulsów o napięciu 10 mV, co pozwala sprawdzić, czy udało się uzyskać szczelne połączenie między elektrodą a komórką.

Następnie opuszczam elektrodę na komórkę docelową. Gdy zauważę wgłębienie na ciele komórki, zwalniam ciśnienie dodatnie z kapilary, co pozwala na utworzenie szczelnego zamknięcia. Rezystancja staje się wtedy na tyle wysoka, że zapis prądu wygląda na płaski.

Małe skoki to artefakty pojemnościowe pochodzące z elektrody. Można je skompensować w ten sposób, dzięki czemu teraz zniknęły. Teraz spróbuję przebić się do wnętrza komórki.

Aby to osiągnąć, ostrożnie przykładam krótkie impulsy ssania do rurki połączonej z ramieniem elektrody i, jeśli wszystko przebiega pomyślnie, widać zmianę zapisu prądu w ten sposób. Widoczne teraz piki wynikają z pojemności błony, co można obecnie skompensować; jest to preparat, który został przygotowany w ciemności. Sprawdźmy, czy jesteśmy w stanie zarejestrować odpowiedzi wywołane światłem.

Ślad widoczny na oscyloskopie przedstawia odpowiedź prądową komórki zwojowej przy napięciu zaklemowanym na poziomie -60 mV. Stosowane przez nas bodźce świetlne to jasne i ciemne paski prezentowane na jednolitym, stałym tle. Oprogramowanie używane w naszym laboratorium pokazuje pełny zapis jednej próby.

Widać, że jest to komórka typu „off”, reagująca na pojawienie się ciemnego paska oraz zanik paska jasnego. Biała linia u góry wskazuje czas trwania bodźca. Możemy teraz przeprowadzić eksperymenty, w których podamy różne środki farmakologiczne drogą perfuzji.

Na przykład możemy zablokować inhibicję GABAergiczną i glicynergiczną. Zazwyczaj po odczekaniu mniej niż jednej minuty można zacząć obserwować tutaj działanie leku. Odpowiedź stała się silniejsza i bardziej przedłużona.

Przygotowanie przekrojów siatkówki jest szeroko stosowane do rejestracji prądów synaptycznych z różnych komórek siatkówki, a dodanie barwnika fluorescencyjnego do roztworu elektrodowego pozwala na łatwe potwierdzenie typu komórki. Pod względem anatomicznym w niniejszym protokole jako model zwierzęcy wykorzystujemy larwy salamandry TGA. Fakt, że salamandry są zwierzętami zmiennocieplnymi i posiadają duże komórki siatkówki, zapewnia korzystne warunki rejestracji, jednak tę samą technikę można zastosować w przypadku preparatów ssaków.