Name: Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-22T00:31:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj technikę immunoprecypitacji chromatyny w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych. Ta metoda pozwala badać interakcje białko-DNA i zmiany chromatyny podczas różnicowania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przedstawiona praca została sfinansowana z grantu (RS1-00477-1) przyznanego F.S. przez California Institute for Regenerative Medicine (CIRM).

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+complexes+repress+developmental+regulators+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells.</a> Nature. 441, 349-353 (2006).</li>
<li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+regulators+by+Polycomb+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 301-313 (2006).</li>
<li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome.</a> Cell. 98, 285-294 (1999).</li>
<li>Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+Hox-specific+roles+for+the+MLL1+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).</li>
<li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).</li>
<li>Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNAs+of+trithorax+response+elements+recruit+Drosophila+Ash1+to+Ultrabithorax%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax.</a> Science. 311, 1118-1123 (2006).</li>
</ol>

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi cenną technikę analizy procesów opartych na chromatynie podczas różnicowania komórkowego. Warunkami sukcesu tej metody są wysokiej jakości przeciwciała oraz dostępność chromatyny z komórek lub tkanek kontrolnych, które nie posiadają badanego antygenu. Połączenie metody ChIP z technologią mikromacierzy DNA pozwala na uzyskanie ogromnych ilości informacji. Walidacja wyników ChIP zależy od dostępności odpowiednich systemów testowych, które mogą powiązać dynamiczne asocjacje białek, modyfikacje białek i/lub RNA z przebiegiem procesów biologicznych podczas rozwoju komórek.

<table><tbody><tr><td>Proteinaza K</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>#EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Odczynnik</td><td>Fermentas</td><td>#EN0531</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyd 37%</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>FX040-13</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>3150</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Odczynnik</td><td>Goldshield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fenol:chloroform:alkohol izoamylowy</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>SA, frakcja V</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny Dubecco&amp;rsquo;s</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>4050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>9410</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Odczynnik</td><td>JT Baker</td><td>4095-02</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek litu</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>5910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>9230</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Odczynnik</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>Kwas deoksycholowy, sól sodowa</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Odczynnik</td><td>Applichem</td><td>631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>dynalbeads, białko A</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>100.02D</td><td></td></tr><tr><td>dynalbeads, białko G</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki Low Retention 1,5 ml, Xtreme</td><td>Inne</td><td>Phenix Research Products</td><td>MAX-815S</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 2,0 ml</td><td>Odczynnik</td><td>Eppendorf</td><td>955154037</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Funkcjonalna i strukturalna złożoność niezliczonych komórek w organizmach metazoicznych wywodzi się z niewielkiej liczby komórek macierzystych. Komórki macierzyste charakteryzują się dwiema fundamentalnymi właściwościami: zdolnością do samoodnawiania oraz multipotencjalnością, która pozwala komórce macierzystej zróżnicować się w niemal każdy typ komórek 1. Przejście od komórki macierzystej do komórki zróżnicowanej charakteryzuje się utratą multipotencjalności, zmianami strukturalnymi i morfologicznymi oraz hierarchiczną aktywnością czynników transkrypcyjnych i cząsteczek sygnałowych, których działanie ustanawia i utrzymuje specyficzne dla danego typu komórek wzorce ekspresji genów. Na poziomie molekularnym różnicowanie komórek wiąże się z dynamicznymi zmianami struktury i składu chromatyny, a wykrycie tych zmian może dostarczyć cennych informacji na temat cech funkcjonalnych komórek macierzystych oraz procesu różnicowania komórkowego 2,3. Chromatyna to silnie upakowany kompleks DNA-białko, który tworzy się, gdy komórki pakują chromosomalne DNA z białkami, głównie histonami 4. Stan komórki macierzystej oraz różnicowanie komórkowe skorelowano z obecnością specyficznych układów białek regulacyjnych, takich jak czynniki epigenetyczne, warianty histonów i czynniki transkrypcyjne 2,3,5.
 Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi cenną metodę monitorowania obecności RNA, białek oraz modyfikacji białek w chromatynie 6,7. Porównanie chromatyny z różnych typów komórek pozwala wyjaśnić dynamiczne zmiany w oddziaływaniach białko-chromatyna, które zachodzą podczas różnicowania komórek.
Immunoprecypitacja chromatyny polega na oczyszczaniu chromatyny sieciowanej in vivo. Wyizolowana chromatyna jest redukowana do mniejszych fragmentów poprzez trawienie enzymatyczne lub siłę mechaniczną. Fragmenty chromatyny są wytrącane przy użyciu specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko białkom docelowym lub modyfikacjom białek i DNA. Wytrącone DNA lub RNA jest oczyszczane i wykorzystywane jako matryca dla PCR lub testów opartych na mikromacierzach DNA. Warunkami niezbędnymi do pomyślnego przeprowadzenia ChIP są wysokiej jakości przeciwciała przeciwko pożądanemu antygenowi oraz dostępność chromatyny z komórek kontrolnych, które nie wykazują ekspresji cząsteczki docelowej. ChIP pozwala na powiązanie obecności białek, modyfikacji białek i RNA oraz RNA ze specyficznym docelowym DNA i, w zależności od wybranego narzędzia odczytu, wykrywa asocjację cząsteczek docelowych w konkretnych genach docelowych lub w kontekście całego genomu. Porównanie rozkładu białek w chromatynie różnicujących się komórek może wyjaśnić dynamiczne zmiany w składzie chromatyny, które zbiegają się z progresją komórek wzdłuż danej linii komórkowej.

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych.

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Złożoność funkcjonalna i strukturalna niezliczonych komórek w organizmach metazoicznych wywodzi się z niewielkiej liczby komórek macierzystych. Komórki macierzyste to...

Witam, nazywam się Stefan Burani i pracuję w laboratorium dr. Franka Zawy w Katedrze Biochemii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside. Dzisiaj przedstawimy procedurę immunoprecypitacji chromatyny. Zapraszam do oglądania.Procedura ta rozpoczyna się od sieciowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą formaldehydu. Przed sieciowaniem ludzkie embrionalne komórki macierzyste rozmraża się w ciekłym azocie przez pięć minut w temperaturze 37 °C, a następnie przemywa pożywką. Następnie komórki wysiewa się na sześciodołkowe płytki pokryte żelatyną i pozostawia do namnożenia przez dwa do trzech dni.Dla każdej reakcji immunoprecypitacji należy rozpocząć od 50 do 100 milionów komórek. Komórki są najpierw homogenizowane i zbierane w zawiesinie. Do każdej zawiesiny komórkowej dodaje się świeży aldehyd w stężeniu 1% i inkubuje przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie, aby zneutralizować formaldehyd, dodaj 1/10 objętości 1,25 M glicyny i inkubuj przez 10 minut. Przepłucz komórki dwukrotnie 10 ml PBS, a następnie przenieś je do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Wirować probówki w wirówce z prędkością 1000 RPM przez pięć minut w temperaturze 4 °C, aby zebrać komórki w formie osadu.Po wirowaniu odrzuć nadsącz i resuspenduj osad w 1,5 ml buforu do lizy. Na koniec przenieś komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Po przeniesieniu komórek zamroź je gwałtownie trzy razy w ciekłym azocie, a następnie rozbij je za pomocą homogenizatora tkankowego.Po usieciowaniu komórki są gotowe do immunoprecypitacji lub mogą być przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez nieokreślony czas. Po usieciowaniu komórek należy przygotować kulki magnetyczne do przeprowadzenia tej procedury. Do probówek mikrotubowych o niskiej retencji o pojemności 1,5 ml należy odpipetować po 50 µL kulek DI, przygotowując jedną probówkę kulek na każdą immunoprecypitację.Następnie należy dodać 1 mL roztworu blokującego. Teraz należy zebrać kulki dyal za pomocą dyal MPC. Proszki należy umieścić w statywie magnetycznym.Pozostaw koraliki, aby osadziły się na ściance probówki. Powinno to zająć około 15 sekund. Można dwukrotnie odwrócić statyw, aby ułatwić zbieranie koralików.Po zebraniu kulek można usunąć nadsącz za pomocą pipety. Po usunięciu nadsączu należy dodać 1 mL roztworu blokującego i delikatnie resuspender kulki, wyjmując pasek magnetyczny ze statywu i odwracając statyw. Trzymając probówkę w statywie, należy powtórzyć tę czynność od 10 do 20 razy lub do momentu równomiernego rozproszenia kulek.Ponownie zbierz kulki, tak jak robiono to wcześniej. Po ich zebraniu nadmiar nadsączu można usunąć pipetą. Powtórz to płukanie, używając 1,5 milliliters roztworu blokującego.Po drugim przemyciu można ponownie zawiesić kulki w 750 µL roztworu blokującego, a następnie dodać 10 µg przeciwciała. W naszych badaniach stosujemy przeciwciało przeciwko białku MLL i inkubujemy mieszaninę w temperaturze 4 °C przez minimum sześć godzin lub przez noc na rotatorze. Podczas tej inkubacji można przeprowadzić sonikację sieciowanej chromatyny, co zademonstrujemy wkrótce po inkubacji nocnej.Usunąć roztwór przeciwciał, a następnie trzykrotnie wypłukać kuleczki. W każdym etapie użyć 1 mL buforu lizującego, postępując jak poprzednio i wykorzystując statyw magnetyczny do zbierania kuleczek. Po zakończeniu płukania można dodać nasyconą chromatynę.Przed rozpoczęciem sonikacji należy wyjąć zamrożone pellety komórkowe z temperatury -80 °C i pozwolić im się rozmrozić. Przygotuj 15 ml probówkę stożkową do sonikacji. W tym celu należy przeciąć probówkę na dwie części na poziomie 5 ml i wyrzucić górną połowę.Probówki można przykryć parafilmem lub nakrętką. Podczas przygotowania, używając statywu na probówki, ustaw probówkę tak, aby sonda ator znajdowała się około 0,5 do 1 cm nad dnem probówki.Należy upewnić się, że sonda jest wycentrowana i nie dotyka ścianek probówki, aby zapobiec pienieniu się roztworu. Następnie poddaj zawiesinę sonikacji w sześciu cyklach po 20 sekund. Każda próbka powinna być przechowywana w kąpieli wodno-lodowej pomiędzy cyklami sonikacji w celu zmniejszenia pienienia.Początkowo ustawiono moc wyjściową na zero, a następnie ręcznie zwiększono ją do mocy końcowej podczas pierwszego impulsu. Po pewnym czasie materiał przeniesiono do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie wirowano z prędkością 13 000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzić zanieczyszczenia i zebrać nadsącz.Przenieś SINA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Odstaw 50 µl lizatu komórkowego z każdej próbki jako DNA wejściowe. Posłuży on później do sprawdzenia wielkości rozdzielonej chromatyny.Można to przechowywać w temperaturze -20 °C. Należy zachować co najmniej jedną alikwotę DNA wejściowego dla każdej partii lizatu poddanego sonikacji. Teraz możemy przystąpić do immunoprecypitacji chromatyny.W pierwszej kolejności do 50 µL przygotowanej wcześniej mieszaniny kulek magnetycznych z przeciwciałami należy dodać równowartość chromatyny z 50 do 100 milionów komórek pobranych w poprzednim kroku, do uzyskania końcowej objętości 1 mL. W razie potrzeby objętość tę można uzupełnić buforem lizującym; następnie należy odwrócić probówkę, aby resuspendować kuleczki. Mieszaninę tę inkubuje się przez noc w rotatorze w temperaturze 4 °C.Po inkubacji zebrać kuleczki za pomocą magnesu MPC, a następnie umieścić probówki w statywie, pozwalając kuleczkom osadzić się na ściance probówki. Powinno to zająć około 20 sekund. Przesunąć statyw dwukrotnie, aby ułatwić zebranie wszystkich kuleczek.Następnie usunąć osad za pomocą pipety, zmieniając końcówki pomiędzy próbkami. W kolejnym kroku należy wyprać kuleczki. W tym celu do każdej probówki dodać 1 mL buforu liazy i delikatnie resuspendować kuleczki.Można to zrobić, wyjmując pasek magnetyczny ze statywu i odwracając statyw z pozostającymi w nim probówkami około 10 do 20 razy lub do momentu równomiernego resuspensowania kulek. Następnie należy zebrać kulki, ponownie wkładając pasek magnetyczny. Odessać nadsącz za pomocą pipety.Powtórz to płukanie jeszcze od trzech do pięciu razy. Pamiętaj o zmianie końcówek między kolejnymi płukaniami. Następnie wypłucz kuleczki od czterech do sześciu razy w 1 mL buforu IP one w opisany wcześniej sposób.Następnie w podobny sposób przemyj kuleczki od czterech do sześciu razy w 1 mL buforu IP dwa. Na koniec przemyj kuleczki od czterech do sześciu razy w 1 mL buforu TE o pH 8.0, analogicznie do poprzednich etapów płukania. Po ostatnim przemyciu usuń bufor TE.Następnie wiruj z prędkością 3000 RPM przez trzy minuty w temperaturze 4 °C, aby usunąć pozostałości buforu TE. Kulki są teraz gotowe do elucji w celu usunięcia chromatyny. Najpierw dodaj 210 µL buforu do elucji i eluuj materiał z kulek, inkubując probówki w mikserze termicznym w temperaturze 65 °C przy 800 RPM przez 15 minut lub do 30 minut, aby zwiększyć odzysk eluatu.Odwiruj kuleczki z prędkością 13 000 RPM przez jedną minutę. Po wirowaniu odlej 200 µl nadsączu i przenieś go do nowej probówki, a następnie dodaj 200 µL buforu TE 0.0. Próbki są teraz gotowe do odwrócenia sieciowania wytrąconego DNA.Inkubować nadsącz w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C przez minimum sześć godzin, nie dłużej niż 15 godzin. Inkubację można przeprowadzić w kąpieli wodnej, aby zminimalizować kondensację. Następnie dodać 50 µL DNA wejściowego.Po sonikacji odwrócono wiązania krzyżowe tego wejściowego DNA poprzez inkubację w temperaturze 65 °C, analogicznie do procedury zastosowanej dla eluatu. Obecnie możemy przystąpić do oczyszczania DNA. Następnie DNA jest oczyszczane i wytrącane z wykorzystaniem ekstrakcji fenolo-chloroformowej, a następnie technik wytrącania etanolem.Wytrącone osady DNA resuspenduje się w wodzie, a następnie można je przechowywać w temperaturze -20 °C. W celu późniejszego wykorzystania, oczyszczone wejściowe DNA można poddać elektroforezie w żelu agarozowym, aby sprawdzić wielkość pofragmentowanej chromatyny. Idealnie fragmenty chromatyny powinny mieć długość od 250 do 750 zasad.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania immunoprecypitacji chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Podczas wykonywania tego eksperymentu ważne jest zastosowanie przeciwciała o wysokim powinowactwie, chromatyny o odpowiednim zakresie wielkości fragmentów oraz etapów przemywania o wysokiej rygorystyczności. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

chromatin-immunoprecipitation-from-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Precyzyjna regulacja transkrypcji genów leży u podstaw decyzji o losie komórki embrionalnej. W niniejszym artykule opisujemy testy immunoprecypitacji chromatyny stosowane do badania epigenetycznej regulacji zarówno różnicowania komórek macierzystych w sercu, jak i rozwoju serca zarodków myszy.

Epigenetyczna regulacja różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych i tkanek

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Poznaj technikę immunoprecypitacji chromatyny w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych. Ta metoda pozwala badać interakcje białko-DNA i zmiany chromatyny podczas różnicowania komórek.

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów