Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Witam, nazywam się Stefan Burani i pracuję w laboratorium dr. Franka Zawy w Katedrze Biochemii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside. Dzisiaj przedstawimy procedurę immunoprecypitacji chromatyny. Zapraszam do oglądania.

Procedura ta rozpoczyna się od sieciowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą formaldehydu. Przed sieciowaniem ludzkie embrionalne komórki macierzyste rozmraża się w ciekłym azocie przez pięć minut w temperaturze 37 °C, a następnie przemywa pożywką. Następnie komórki wysiewa się na sześciodołkowe płytki pokryte żelatyną i pozostawia do namnożenia przez dwa do trzech dni.

Dla każdej reakcji immunoprecypitacji należy rozpocząć od 50 do 100 milionów komórek. Komórki są najpierw homogenizowane i zbierane w zawiesinie. Do każdej zawiesiny komórkowej dodaje się świeży aldehyd w stężeniu 1% i inkubuje przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie, aby zneutralizować formaldehyd, dodaj 1/10 objętości 1,25 M glicyny i inkubuj przez 10 minut. Przepłucz komórki dwukrotnie 10 ml PBS, a następnie przenieś je do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Wirować probówki w wirówce z prędkością 1000 RPM przez pięć minut w temperaturze 4 °C, aby zebrać komórki w formie osadu.

Po wirowaniu odrzuć nadsącz i resuspenduj osad w 1,5 ml buforu do lizy. Na koniec przenieś komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Po przeniesieniu komórek zamroź je gwałtownie trzy razy w ciekłym azocie, a następnie rozbij je za pomocą homogenizatora tkankowego.

Po usieciowaniu komórki są gotowe do immunoprecypitacji lub mogą być przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez nieokreślony czas. Po usieciowaniu komórek należy przygotować kulki magnetyczne do przeprowadzenia tej procedury. Do probówek mikrotubowych o niskiej retencji o pojemności 1,5 ml należy odpipetować po 50 µL kulek DI, przygotowując jedną probówkę kulek na każdą immunoprecypitację.

Następnie należy dodać 1 mL roztworu blokującego. Teraz należy zebrać kulki dyal za pomocą dyal MPC. Proszki należy umieścić w statywie magnetycznym.

Pozostaw koraliki, aby osadziły się na ściance probówki. Powinno to zająć około 15 sekund. Można dwukrotnie odwrócić statyw, aby ułatwić zbieranie koralików.

Po zebraniu kulek można usunąć nadsącz za pomocą pipety. Po usunięciu nadsączu należy dodać 1 mL roztworu blokującego i delikatnie resuspender kulki, wyjmując pasek magnetyczny ze statywu i odwracając statyw. Trzymając probówkę w statywie, należy powtórzyć tę czynność od 10 do 20 razy lub do momentu równomiernego rozproszenia kulek.

Ponownie zbierz kulki, tak jak robiono to wcześniej. Po ich zebraniu nadmiar nadsączu można usunąć pipetą. Powtórz to płukanie, używając 1,5 milliliters roztworu blokującego.

Po drugim przemyciu można ponownie zawiesić kulki w 750 µL roztworu blokującego, a następnie dodać 10 µg przeciwciała. W naszych badaniach stosujemy przeciwciało przeciwko białku MLL i inkubujemy mieszaninę w temperaturze 4 °C przez minimum sześć godzin lub przez noc na rotatorze. Podczas tej inkubacji można przeprowadzić sonikację sieciowanej chromatyny, co zademonstrujemy wkrótce po inkubacji nocnej.

Usunąć roztwór przeciwciał, a następnie trzykrotnie wypłukać kuleczki. W każdym etapie użyć 1 mL buforu lizującego, postępując jak poprzednio i wykorzystując statyw magnetyczny do zbierania kuleczek. Po zakończeniu płukania można dodać nasyconą chromatynę.

Przed rozpoczęciem sonikacji należy wyjąć zamrożone pellety komórkowe z temperatury -80 °C i pozwolić im się rozmrozić. Przygotuj 15 ml probówkę stożkową do sonikacji. W tym celu należy przeciąć probówkę na dwie części na poziomie 5 ml i wyrzucić górną połowę.

Probówki można przykryć parafilmem lub nakrętką. Podczas przygotowania, używając statywu na probówki, ustaw probówkę tak, aby sonda ator znajdowała się około 0,5 do 1 cm nad dnem probówki.

Należy upewnić się, że sonda jest wycentrowana i nie dotyka ścianek probówki, aby zapobiec pienieniu się roztworu. Następnie poddaj zawiesinę sonikacji w sześciu cyklach po 20 sekund. Każda próbka powinna być przechowywana w kąpieli wodno-lodowej pomiędzy cyklami sonikacji w celu zmniejszenia pienienia.

Początkowo ustawiono moc wyjściową na zero, a następnie ręcznie zwiększono ją do mocy końcowej podczas pierwszego impulsu. Po pewnym czasie materiał przeniesiono do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie wirowano z prędkością 13 000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzić zanieczyszczenia i zebrać nadsącz.

Przenieś SINA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Odstaw 50 µl lizatu komórkowego z każdej próbki jako DNA wejściowe. Posłuży on później do sprawdzenia wielkości rozdzielonej chromatyny.

Można to przechowywać w temperaturze -20 °C. Należy zachować co najmniej jedną alikwotę DNA wejściowego dla każdej partii lizatu poddanego sonikacji. Teraz możemy przystąpić do immunoprecypitacji chromatyny.

W pierwszej kolejności do 50 µL przygotowanej wcześniej mieszaniny kulek magnetycznych z przeciwciałami należy dodać równowartość chromatyny z 50 do 100 milionów komórek pobranych w poprzednim kroku, do uzyskania końcowej objętości 1 mL. W razie potrzeby objętość tę można uzupełnić buforem lizującym; następnie należy odwrócić probówkę, aby resuspendować kuleczki. Mieszaninę tę inkubuje się przez noc w rotatorze w temperaturze 4 °C.

Po inkubacji zebrać kuleczki za pomocą magnesu MPC, a następnie umieścić probówki w statywie, pozwalając kuleczkom osadzić się na ściance probówki. Powinno to zająć około 20 sekund. Przesunąć statyw dwukrotnie, aby ułatwić zebranie wszystkich kuleczek.

Następnie usunąć osad za pomocą pipety, zmieniając końcówki pomiędzy próbkami. W kolejnym kroku należy wyprać kuleczki. W tym celu do każdej probówki dodać 1 mL buforu liazy i delikatnie resuspendować kuleczki.

Można to zrobić, wyjmując pasek magnetyczny ze statywu i odwracając statyw z pozostającymi w nim probówkami około 10 do 20 razy lub do momentu równomiernego resuspensowania kulek. Następnie należy zebrać kulki, ponownie wkładając pasek magnetyczny. Odessać nadsącz za pomocą pipety.

Powtórz to płukanie jeszcze od trzech do pięciu razy. Pamiętaj o zmianie końcówek między kolejnymi płukaniami. Następnie wypłucz kuleczki od czterech do sześciu razy w 1 mL buforu IP one w opisany wcześniej sposób.

Następnie w podobny sposób przemyj kuleczki od czterech do sześciu razy w 1 mL buforu IP dwa. Na koniec przemyj kuleczki od czterech do sześciu razy w 1 mL buforu TE o pH 8.0, analogicznie do poprzednich etapów płukania. Po ostatnim przemyciu usuń bufor TE.

Następnie wiruj z prędkością 3000 RPM przez trzy minuty w temperaturze 4 °C, aby usunąć pozostałości buforu TE. Kulki są teraz gotowe do elucji w celu usunięcia chromatyny. Najpierw dodaj 210 µL buforu do elucji i eluuj materiał z kulek, inkubując probówki w mikserze termicznym w temperaturze 65 °C przy 800 RPM przez 15 minut lub do 30 minut, aby zwiększyć odzysk eluatu.

Odwiruj kuleczki z prędkością 13 000 RPM przez jedną minutę. Po wirowaniu odlej 200 µl nadsączu i przenieś go do nowej probówki, a następnie dodaj 200 µL buforu TE 0.0. Próbki są teraz gotowe do odwrócenia sieciowania wytrąconego DNA.

Inkubować nadsącz w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C przez minimum sześć godzin, nie dłużej niż 15 godzin. Inkubację można przeprowadzić w kąpieli wodnej, aby zminimalizować kondensację. Następnie dodać 50 µL DNA wejściowego.

Po sonikacji odwrócono wiązania krzyżowe tego wejściowego DNA poprzez inkubację w temperaturze 65 °C, analogicznie do procedury zastosowanej dla eluatu. Obecnie możemy przystąpić do oczyszczania DNA. Następnie DNA jest oczyszczane i wytrącane z wykorzystaniem ekstrakcji fenolo-chloroformowej, a następnie technik wytrącania etanolem.

Wytrącone osady DNA resuspenduje się w wodzie, a następnie można je przechowywać w temperaturze -20 °C. W celu późniejszego wykorzystania, oczyszczone wejściowe DNA można poddać elektroforezie w żelu agarozowym, aby sprawdzić wielkość pofragmentowanej chromatyny. Idealnie fragmenty chromatyny powinny mieć długość od 250 do 750 zasad.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania immunoprecypitacji chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Podczas wykonywania tego eksperymentu ważne jest zastosowanie przeciwciała o wysokim powinowactwie, chromatyny o odpowiednim zakresie wielkości fragmentów oraz etapów przemywania o wysokiej rygorystyczności. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.