Name: Pierwotne zdysocjowane kultury komórek dopaminy śródmózgowia od noworodków gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Naucz się przygotowywać pierwotne zdysocjowane kultury komórek dopaminy śródmózgowia od noworodków gryzoni. Ta metoda umożliwia badanie kinetyki uwalniania dopaminy i mechanizmów egzocytozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca była wspierana przez granty DK065872 (ENP), Smith Family Foundation Award of Excellence in Biomedical Research (ENP), F31 DA023760 (BMG, ENP) oraz P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).

<ol><li>Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+defective+mesolimbic+dopamine+exocytosis+in+obesity-prone+rats%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats.</a> FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).</li>
<li>Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dopamine+quantal+size+in+midbrain+and+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons.</a> Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).</li>
<li>Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+transporter+expression+regulates+vesicle+phenotype+and+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).</li>
<li>Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+recording+of+quanta+from+midbrain+dopamine+neurons+and+modulation+of+the+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+mechanisms+that+regulate+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Presynaptic mechanisms that regulate quantal size.</a> Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).</li>
</ol>

Opisane tutaj metody umożliwiają precyzyjną analizę cech morfologicznych i neurochemicznych centralnych neuronów dopaminergicznych, które w przeciwnym razie nie byłyby dostępne przy zastosowaniu podejścia systemowego lub in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiały są zawarte w tekście protokołu.</td></tr></tbody></table>

pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia z noworodków gryzoni

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

Zdolność do tworzenia pierwotnych kultur komórkowych neuronów dopaminergicznych umożliwia badanie charakterystyki presynaptycznej tych neuronów w izolacji od sygnałów systemowych pochodzących z innych obszarów mózgu. W naszym laboratorium wykorzystujemy te neurony do oceny kinetyki uwalniania dopaminy za pomocą amperometrii z wykorzystaniem mikroelektrod z włókna węglowego, a także do badania poziomu ekspresji genów i białek związanych z dopaminą przy użyciu ilościowej PCR oraz immunocytochemii. W tym filmie pokazujemy, w jaki sposób generujemy te kultury z noworodków gryzoni.
Proces ten obejmuje kilka etapów, w tym wysiew astrocytów glejowych kory, kondycjonowanie pożywek do hodowli komórek neuronalnych przez podłoże glejowe, sekcję śródmózgowia noworodków, trawienie, ekstrakcję i wysiew neuronów dopaminergicznych oraz dodanie czynników neurotroficznych w celu zapewnienia przeżywalności komórek.
Zastosowania odpowiednie dla takiego preparatu obejmują elektrofizjologię, immunocytochemię, ilościowy PCR, mikroskopię wideo (tj. obrazowanie fuzji pęcherzyków z błoną plazmatyczną w czasie rzeczywistym), testy żywotności komórek oraz inne badania toksykologiczne.

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia umożliwiają badanie charakterystyki presynaptycznej neuronów dopaminergicznych. Mogą one być wykorzystywane do monitorowania w czasie rzeczywistym kinetyki uwalniania dopaminy oraz poziomów białek/mRNA regulatorów egzocytozy dopaminy. W niniejszym materiale przedstawiamy sposób przygotowania tych hodowli z noworodków gryzoni.

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia z noworodków gryzoni

Możliwość tworzenia pierwotnych kultur komórkowych neuronów dopaminergicznych pozwala na izolowane badanie charakterystyki presynaptycznej tych neuronów ...

Witam, jestem Lauren Frank z laboratorium Emmanuela Pothosa w katedrze farmakologii i terapeutyki eksperymentalnej na School of Medicine Uniwersytetu Tufts. A ja jestem Emmanuel Pothos. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia pierwotnych kultur dopaminergicznych komórek śródmózgowia z noworodków gryzoni.Niniejsza procedura obejmuje następujące etapy: przygotowanie narzędzi i odczynników, wypreparowanie śródmózgowia z mózgów gryzoni w wieku od P0 do P2, triturację segmentów mózgu oraz wysiew dysocjowanych neuronów. Przejdźmy zatem do realizacji.W tej procedurze istnieje szereg etapów przygotowawczych, które należy przeprowadzić z dwutygodniowym lub trzytygodniowym wyprzedzeniem przed wygenerowaniem hodowli neuronów dopaminergicznych; komórki glejowe muszą zostać wysiane, aby miały czas na proliferację i pokrycie dna naczyń. Pierwotne neurony dopaminergiczne będą hodowane na monowarstwie komórek glejowych od jednego do siedmiu dni przed hodowlą pierwotnych komórek neuronalnych. Dzień przed hodowlą AC należy usunąć medium z komórek glejowych i zastąpić je 2 mL świeżego medium neuronalnego; wszystkie elementy, z wyjątkiem narzędzi do sekcji, muszą zostać wysterylizowane światłem UV,

primary-dissociated-midbrain-dopamine-cell-cultures-from-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pierwotne izolowane kultury komórek dopaminowych śródmózgowia z noworodków gryzoni

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Ten film przedstawia metodę hodowli neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy. Proces ten obejmuje leczenie śródmózgowia enzymem proteolitycznym, odłączenie komórek i wyhodowanie ich na pokrytych polimerem szkiełkach nakrywkowych w pożywce bogatej w składniki odżywcze z antybiotykami dla ich wzrostu i długoterminowej żywotności.

Hodowla i utrzymanie neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy

Wideo pokazuje proces izolacji i hodowli neuronów dopaminowych ze śródmózgowia embrionów myszy. Izolowane brzuszne dno śródmózgowia jest dysocjowane za pomocą enzymów. Powstałe neurony dopaminowe są zbierane i przenoszone do mikrowysp wewnątrz płytek wielodołkowych. Komórki są inkubowane z pożywką neuronów dopaminowych, aby utrzymać komórki w dużej gęstości wewnątrz mikrowysp.

Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Ten film pokazuje proces ilościowego określania akumulacji alfa-synukleiny w embrionalnych mysich neuronach dopaminowych wstępnie potraktowanych wstępnie uformowanymi włókienkami alfa-synukleiny. Przedstawia etapy utrwalania, barwienia i ilościowego oznaczania neuronów dopaminowych zawierających agregaty alfa-synukleiny za pomocą immunofluorescencji.

Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Neurony dopaminergiczne odgrywają istotną rolę regulacyjną w mózgu. Ich utrata jest związana z chorobą Parkinsona. W tym filmie pokazujemy, jak wygenerować pierwotne kultury centralnych neuronów dopaminergicznych z embrionalnego śródmózgowia myszy. Takie kultury są przydatne do badania ekstremalnej podatności tych neuronów na różne stresy.

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

W chorobie Parkinsona (PD) neurony dopaminergiczne istoty czarnej (SNc) ulegają degeneracji, co prowadzi do dysfunkcji motorycznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wyrażającej eGFP napędzany sekwencją promotora hydroksylazy tyrozyny (TH), zbierania pojedynczych neuronów fluorescencyjnych z kultur i pomiaru ich transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Ten protokół opisuje hodowlę komórek ludzkich neuronów dopaminergicznych śródmózgowia, a następnie barwienie immunologiczne i generowanie profili fenotypowych neuronów na podstawie uzyskanych mikroskopowych obrazów o wysokiej zawartości, co pozwala na identyfikację zmian fenotypowych spowodowanych modulacjami genetycznymi lub chemicznymi.

Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Naucz się przygotowywać pierwotne zdysocjowane kultury komórek dopaminy śródmózgowia od noworodków gryzoni. Ta metoda umożliwia badanie kinetyki uwalniania dopaminy i mechanizmów egzocytozy.

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia z noworodków gryzoni

Przeglądaj więcej filmów