Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia z noworodków gryzoni

Witam, jestem Lauren Frank z laboratorium Emmanuela Pothosa w katedrze farmakologii i terapeutyki eksperymentalnej na School of Medicine Uniwersytetu Tufts. A ja jestem Emmanuel Pothos. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia pierwotnych kultur dopaminergicznych komórek śródmózgowia z noworodków gryzoni.

Niniejsza procedura obejmuje następujące etapy: przygotowanie narzędzi i odczynników, wypreparowanie śródmózgowia z mózgów gryzoni w wieku od P0 do P2, triturację segmentów mózgu oraz wysiew dysocjowanych neuronów. Przejdźmy zatem do realizacji.

W tej procedurze istnieje szereg etapów przygotowawczych, które należy przeprowadzić z dwutygodniowym lub trzytygodniowym wyprzedzeniem przed wygenerowaniem hodowli neuronów dopaminergicznych; komórki glejowe muszą zostać wysiane, aby miały czas na proliferację i pokrycie dna naczyń. Pierwotne neurony dopaminergiczne będą hodowane na monowarstwie komórek glejowych od jednego do siedmiu dni przed hodowlą pierwotnych komórek neuronalnych. Dzień przed hodowlą AC należy usunąć medium z komórek glejowych i zastąpić je 2 mL świeżego medium neuronalnego; wszystkie elementy, z wyjątkiem narzędzi do sekcji, muszą zostać wysterylizowane światłem UV, w tym 12 płytek do sekcji.

Dwie probówki do dysocjacji z mikro magnetycznym mieszadełkiem. Dwa zakretki do probówek z dwoma małymi otworami w górnej części. Rozłożone pierścienie prowadzące.

A pudełko z pierścieniami do szkiełek należy pozostawić otwarte. Wszystkie te narzędzia przed rozpoczęciem pracy w dniu hodowli należy pokryć 70% etanolem. Najpierw należy wyjąć z zamrażarki wszystkie składniki roztworu papainy, który będzie służył do dysocjacji roztworu pierwotnych neuronów, i pozwolić im się rozmrozić.

Ustaw płytkę grzewczą, aby podgrzać zlewkę z wodą do 34 °C na potrzeby trawienia, oraz przygotuj wodę nasyconą karbogenem do natleniania roztworu pepane. Podczas trawienia przygotowuje się 15 sterylnych probówek wypełnionych od 4 do 6 ml sterylnego PBS do przemywania mózgów przed sekcją, które następnie umieszcza się w lodzie. Odmierz od 20 do 30 ml świeżego medium neuronalnego i umieść je w inkubatorze.

Następnie przygotowuje się fiolkę do dysocjacji, wykorzystując sterylną jednostkę do filtracji przez membranę w celu przefiltrowania roztworu pepsyny, który następnie przenosi się do fiolki do dysocjacji za pomocą strzykawki 25 ml. Zakręca się fiolkę korkiem, wkłada sterylną strzykawkę, wykonując otwór w korku, która jest połączona z filtrem 0,2 mikrona. Podłącza się carbogen do filtra i zabezpiecza to miejsce taśmą Parafilm. Fiolkę umieszcza się w styropianowym dysku.

Po umieszczeniu probówki do dysocjacji należy upewnić się, że mieszadło magnetyczne pracuje. Gaz dostaje się do wnętrza probówki, a temperatura została ustabilizowana na poziomie 34 °C. Stereomikroskop do sekcji zostaje wprowadzony do komory dygestorium, a narzędzia sekcyjne rozłożone na folii aluminiowej.

Następnie przygotuj jeden duży kwadrat folii aluminiowej oraz 12 mniejszych kwadratów. Obok folii aluminiowej połóż nożyczki do odcinania głów. Poza okapem ustaw pudełko styropianowe z wodą z lodem.

Następnie należy przygotować środek znieczulający, który stanowi mieszaninę 0,075 mililitra ketaminy i 0,075 mililitra ksylazyny. Następnie należy pobrać co najmniej 12 szczeniąt w wieku od P0 do P2 do płytek 135 milimetrowych z szklanym dołkiem 23 milimetrów. W przypadku myszy należy upewnić się, że cały miot ma zgodny genotyp.

Jeśli genotyp jest nieznany, komórki z każdego zwierzęcia należy wysiać na oddzielne szalki i prowadzić dokładną dokumentację, aby dopasować komórki do późniejszych wyników genotypowania. Aby rozpocząć sekcję, znieczul pierwsze zwierzę poprzez dostrykalną iniekcję ketaminy i ksylazyny. Gdy zwierzę przestanie reagować na test odruchu wycofania ogona, umieść je w lodowatej wodzie na 30 sekund, aż wystąpi hipotermia.

Następnie opłucz mały kwadrat z folii aluminiowej, nożyce do dekapitacji oraz głowę zwierzęcia 70%etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia tkanki mózgowej podczas sekcji, dokonaj dekapitacji za pomocą nożyc, pozwalając głowie opaść na kwadrat z folii aluminiowej, a następnie przenieś go pod wyciąg. Ostrożnie wyjmij mózg, najpierw rozcinając skórę małymi nożyczkami w celu odsłonięcia czaszki. Przetnij tkanki wokół czaszki na całym obwodzie (360 stopni).

Następnie za pomocą pincety odchyl opuszkę czaszki. Wyjmij mózg z czaszki, używając małej szpatułki, i umieść go w probówce 15 ml z zimnym PBS na lodzie. Przed wyjęciem kolejnego mózgu ponownie umieść probówkę na lodzie.

Powtarzać sekcje do momentu uzyskania trzech mózgów w oddzielnych probówkach w lodzie. Przenieść jeden mózg wraz z PBS do pierwszej szalki sekcyjnej. Pod mikroskopem umieścić mózg na podkładce z kleju sill guard, aby chronić ostrze przed szybkim tępieniem.

Za pomocą pipety transferowej przenieś segmenty do nowej probówki z PBS, aby je wypłukać przed przeniesieniem do roztworu papainy. Uruchom stoper w momencie umieszczenia pierwszych segmentów, a następnie kontynuuj sekcję, aż wszystkie mózgi będą poddawane trawieniu papainą.

Pierwsze segmenty mózgu będą trawione przez około jedną godzinę. Po dodaniu ostatnich segmentów należy kontynuować proces trawienia przez kolejną godzinę. Należy upewnić się, że temperatura w kąpieli pepanowej jest ustabilizowana na poziomie 34 °C.

Aby rozpocząć etap tation, należy za pomocą pipety transferowej przenieść segmenty mózgu do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Należy starać się nie przenosić nadmiaru roztworu pepane. Jeśli jednak do tego dojdzie, należy usunąć nadmiar pepane.

Następnie wypłucz segmenty, dodając dwa mililitry ocieplonego medium neuronalnego z inkubatora. Odczekaj, aż segmenty osiądą, a następnie ostrożnie odlej jak najwięcej roztworu, tak aby nie poruszyć segmentów. Przeprowadź łącznie trzy takie płukania.

Należy pamiętać o zmianie pipet między kolejnymi przemyciami, aby uniknąć kontaminacji, używając nowej końcówki do transferu. Rozpocząć iteracje w 2 mL pożywki neuronalnej. Triturować 25 razy, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza.

Następnie pozostawić niepowiązane segmenty do osadzenia się przez trzy minuty. Za pomocą pipety transferowej zebrać jak najwięcej nadsączu, uważając, aby nie poruszyć segmentów znajdujących się na dnie. Przenieść nadsącz do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml.

Powtórz poprzedni krok, używając końcówki do pipety 1000 µL, a następnie końcówki 200 µL, aż segmenty będą wydawały się całkowicie zdysocjowane w badaniu wzrokowym. Nadpływ ze wszystkich etapów zbiera się do tej samej probówki 15 mL. Po przygotowaniu do wysiania komórki są finalnie pipetowane 10 razy za pomocą pipety transferowej, aby uzyskać homogeniczną zawiesinę komórkową do zliczenia.

Używając sterylnej żółtej końcówki do pipety, należy przykryć każdą końcówkę pęsety. Ostrożnie upuścić pierścień na szkiełko, centrując go jak najlepiej względem szkła. Wewnątrz każdej szalki pierścienie te będą służyć do odizolowania obszaru w szalce hodowlanej, w którym zostaną wysiane neurony.

Używając końcówki pipety, nasuń pierścienie na dołek centralny każdej szalki. Następnie ostrożnie dodaj do szalki odpowiednią objętość komórek. Komórki należy nanieść do wnętrza pierścienia, który został wcześniej umieszczony w szalce.

Należy pamiętać o zmianie końcówek dla każdego naczynia. Następnie, aby wspomóc proliferację neuronów, do każdego naczynia dodaje się 100 µL rozcieńczonego roztworu GDNF, aplikując go jak najbliżej zewnętrznej krawędzi pierścienia. Następnie, poza obszarem pierścienia, dodaje się inhibitor mitozy fluorodioksynę (FDU), aby zapobiec nadmiernemu rozrostowi komórek glejowych.

Końcówki pipet często wracają do inkubatora; należy pozwolić komórkom osiaść przez noc. Następnego dnia, używając sterylnych końcówek pipet do osłonięcia końcówek pęsety, należy usunąć pierścienie, zwrócić szalki do inkubatora i nie niepokoić ich tak długo, jak to możliwe, aż do czasu rozpoczęcia eksperymentów. Należy codziennie sprawdzać szalki pod kątem ewentualnego zanieczyszczenia, a w przypadku jego stwierdzenia, niezwłocznie usunąć problematyczne szalki. Hodowle są gotowe do wykorzystania w elektrofizjologii, eksperymentach biologii molekularnej i immunocytochemii w ciągu trzech tygodni.

Po wysianiu komórek przyjrzyjmy się kilku reprezentatywnym przykładom komórek w hodowli. Tutaj widzimy hodowlę pierwotną, która została wysiana 14 dni temu. Jest to przykład prawidłowej hodowli, ponieważ można dostrzec wyraźne ciała komórkowe z odchodzącymi od nich wypustkami.

Dodatkowo należy zwrócić uwagę na brak pleśni lub wzrostu grzybów w szalce, co wskazywałoby na zakażenie. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób generowania pierwotnych kultur dysocjowanych komórek dopaminergicznych śródmózgowia z noworodków gryzoni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu sterylnego środowiska, używaniu wyłącznie noworodków od P0 do P2, wysiewaniu na zdrowe podłoża glialne z medium warunkowanym przez glej oraz utrzymywaniu stałej gęstości wysiewu.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.