Name: Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminowych C. elegans do walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-18T23:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj test degeneracji neuronów dopaminowych w C. elegans do walidacji genów choroby Parkinsona. Ta metoda pozwala identyfikować czynniki neuroprotekcyjne i mechanizmy neurodegeneracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować wszystkim członkom laboratorium Caldwell za ich ducha współpracy. Badania nad zaburzeniami ruchowymi w laboratorium były wspierane przez Bachmann-Strauss Dystonia &amp; Parkinson Foundation, United Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Parkinson's Disease Association of Alabama, the Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research oraz grant na badania studenckie

A. Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego
Wymagane są dwa plazmidy: jeden do tkankowo specyficznej ekspresji badanego genu oraz drugi jako selekcyjny marker transformacji (choć plazmid markerowy jest zazwyczaj dostępny w obrębie społeczności badawczej).
Plazmid eksperymentalny
<ol>
<li>Wybierz promotor, który ulega ekspresji w interesującej tkance lub typie komórek; w tym przypadku zastosowano promotor transportera DA (Pdat-1). Plazmid ekspresyjny ten został stworzony jako wektor docelowy kompatybilny z systemem Invitrogen Gateway (pDEST-DAT-1), aby umożliwić wstawienie dowolnego interesującego genu poniżej promotora za pomocą klonowania rekombinacyjnego 1.</li>
<li>cDNA interesującego genu poddaje się amplifikacji PCR przy użyciu starterów zawierających rekombinacyjną sekwencję Gateway att B. Amplifikowane cDNA jest najpierw rekombinowane do wektora donora pDONR201 w celu utworzenia wektora wejściowego, a następnie transformowane do szczepu E. coli DH5α. Po selekcji udanych rekombinantów i izolacji DNA metodą mini-prep, wektor wejściowy jest rekombinowany do wektora docelowego pDEST-DAT-1 w celu utworzenia plazmidu ekspresyjnego. Szczegółowe informacje na temat klonowania rekombinacyjnego znajdują się w instrukcji Invitrogen Gateway lub w pracy Caldwell i wsp. 5.</li>
</ol>
Plazmid z markerem selekcyjnym
Transgeniczny plazmid markerowy składa się z wektora z promotorem sterującym ekspresją białka fluorescencyjnego w określonej tkance. W tej konkretnej procedurze promotor unc-54 steruje ekspresją białka cherry w mięśniach ściany ciała (Punc-54::cherry).
B. Generowanie transgenicznych C. elegans poprzez mikroiniekcję
Zobacz powiązany artykuł JoVE&nbsp;: <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833">https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833</a>
C. Krzyżówki genetyczne do analizy neurodegeneracji DA
<ol>
<li>Nicienie są hodowane zgodnie ze standardowymi procedurami 6.</li>
<li>Umieść 10 samców Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP 1, 2 na płytce do kojarzenia z 3-4 transgenicznymi hermafrodytami w stadium L4 (wykazującymi ekspresję Pdat-1::gene X oraz Punc-54::cherry). Procedurę tę należy przeprowadzić oddzielnie dla każdej z trzech stworzonych stabilnych linii. Po dwóch dniach usuń samce.</li>
<li>Obejrzyj pokolenie F1; jeśli pojawiło sięy kilka potomnych samców, oznacza to, że kojarzenie przebiegło pomyślnie.</li>
<li>Wyizoluj 5 hermafrodyt w stadium L4 z każdego krzyżowania, które wykazują zarówno fluorescencyczny marker Pdat-1::GFP (odziedziczony po ojcu), jak i fluorescencyczny marker mięśni ściany ciała Punc-54::cherry (odziedziczony po rodzicu hermafrodycie). Wyizolowane zwierzęta muszą znajdować się w stadium L4, aby mieć pewność, że nie kopulowały jeszcze z samcami obecnymi na płytce. Pozostaw je do samozapłodnienia w celu uzyskania potomstwa F2.</li>
<li>Zwierzęta F2 uzyskane w kroku 3 zostają wyizolowane. W szczególności przenieś ~5-10 osobników wykazujących oba markery fluorescencyjne na oddzielne płytki. Przesiewaj pokolenie F3 w poszukiwaniu płytek, na których 100% zwierząt wykazuje ekspresję GFP w neuronach DA, a część zwierząt wykazuje ekspresję cherry w komórkach mięśni ściany ciała. Zwierzęta te będą homozygotyczne pod względem genu Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP, jednocześnie stabilnie przekazując nowo stworzony transgen (gene X).</li>
</ol>
D. Analiza neuronów dopaminergicznych
<ol>
<li>Przygotuj świeżą płytkę dla każdej z trzech linii utworzonych powyżej, a także dla szczepu Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP. Pozostaw je do osiągnięcia wieku dorosłego.</li>
<li>Przenieś 30-40 dorosłych osobników transgenicznych z każdej linii na świeżą płytkę. Pozostaw je do zniesienia embrionów przez 4 godziny w temperaturze 20ºC.</li>
<li>Usuń dorosłe osobniki. Pozostaw embriony do rozwoju przez 3-4 dni w temperaturze 20ºC, aż osiągną stadium L4.</li>
<li>Przenieś ~100 transgenicznych zwierząt w stadium L4 na płytkę zawierającą 0,04 mg/ml 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUDR). Ten analog nukleotydu blokuje rozwój następnego pokolenia poprzez hamowanie syntezy DNA, zapobiegając tym samym zdominowaniu zwierząt doświadczalnych przez potomstwo 7. Chronić płytki z FUDR przed światłem, ponieważ substancja ta jest światłoczuła.</li>
<li>Dorosłe zwierzęta będą analizowane w różne dni po zniesieniu jaj. Odpowiednie dni analizy określa się empirycznie. Na przykład ustaliliśmy, że odpowiednio 77%, 87% i 90% zwierząt Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP wykazuje zdegenerowane neurony DA w 6., 7. i 10. dniu po rozwoju. Dlatego, jeśli przewidujemy, że badany transgen może nasilać neurodegenerację, przeprowadzimy analizę w 6. i/lub 7. dniu. Podobnie, transgeny, które mogą hamować neurodegenerację, będą analizowane w 7. i 10. dniu.</li>
<li>Przygotuj 4 świeże podkładki agarozowe (w przeciwieństwie do podkładek agarowych do mikroiniekcji, te są używane na świeżo i nie mogą wyschnąć). Rozłóż dwa szkiełka przedmiotowe z naklejonym kawałkiem taśmy; taśma służy jako dystans dla zapewnienia równiej grubości podkładek. Połóż trzecie szkiełko pomiędzy nimi na blacie (powinny być ułożone obok siebie w jednej linii). Nałóż kroplę stopionej agarozy na środkowe szkiełko i szybko połóż kolejne szkiełko na wierzchu agarozy, prostopadle i poprzecznie do wszystkich trzech szkiełek. Przygotuj kilka dodatkowych podkładek, pozostawiając dwa szkiełka razem, dopóki podkładka nie będzie gotowa do użycia.</li>
<li>Aby przeanalizować neurony DA u nicieni, nanieś kroplę 6 μl 3 mM lewamisolu (środka anestetycznego) na szkiełko nakrywkę o wymiarach 22 x 30 mm. Przenieś 40 dorosłych zwierząt (10 dodatkowo ponad 30 przeznaczonych do oceny) do kropli, a następnie odwróć szkiełko nakrywkę na podkładce agarozowej. Powtórz czynność dla każdej z pozostałych linii.</li>
<li>Oceń obecność każdego neuronu CEP i ADE u 30 zwierząt na linię, używając mikroskopu złożonego z epifluorescencją i kostką filtrującą umożliwiającą wizualizację FITC lub GFP. Używamy kostki filtrującej Endow GFP HYQ (Chroma Technology). Zapisz dane w załączonej karcie oceny. Zwierzęta typu dzikiego zachowają pełną fluorescencję GFP we wszystkich 4 neuronach CEP i 2 neuronach ADE. Pojedyncze zwierzęta wykazujące utratę neuronów DA ocenia się jako nietypowe dla WT lub „degenerujące”. Podobnie stopień degeneracji można ocenić poprzez zliczenie całkowitej liczby utraconych neuronów w każdym zwierzęciu oraz w całej populacji.</li>
<li>Powtórz analizę jeszcze 2 razy (kolejne 30 zwierząt na linię w każdej próbie). Wyciągnięta zostanie średnia z całkowitej liczby nicieni wykazujących neurony DA typu dzikiego z trzech serii analiz. Analizę statystyczną w celu oceny neuroprotekcji wykonuje się następnie za pomocą testu t-studenta (p &lt; 0,05), aby porównać nicienie kontrolne (Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP) ze szczepami nadekspresyjnymi dla genów kandydackich w neuronach DA.</li>
</ol>

<ol><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis-based+RNAi+screening+identifies+neuroprotective+genes+in+a+Parkinson%E2%80%99s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model.</a> PNAS. 105, 728-733 (2008).</li>
<li>Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-synuclein+blocks+ER-golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> PNAS. 105, 145-150 (2008).</li>
<li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Genomics%3A+A+Discovery-Based+Laboratory+Course%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course.</a> , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).</li>
</ol>

Zależna od wieku utrata neuronów dopaminergicznych jest klinyczną cechą charakterystyczną choroby Parkinsona i wiąże się z akumulacją lub błędnym fałdowaniem białka zwanego alfa-synukleiną. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak za pomocą fluorescencyjnego transgenu znakować neurony dopaminergiczne C. elegans oraz jak naśladować neurodegenerację obserwowaną w chorobie Parkinsona poprzez koekspresję ludzkiej alfa-synukleiny w tych komórkach.
Film ten przedstawia metodologię hodowli, kr...

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Przeszkła mikroskopowe</td><td>Gładkie, 3x1&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do sekcji z fluorescencją</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do sekcji</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>Model E-800</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtrująca, GFP HYQ</td><td>Endow Bandpass</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminergicznych u c. elegans w celu walidacji potencjalnych genów choroby parkinsona

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Udoskonalenie diagnostyki i leczenia choroby Parkinsona (PD) zależy od wiedzy na temat czynników podatności, które narażają określone populacje na ryzyko zachorowania. W procesie prób identyfikacji nowych czynników genetycznych związanych z PD naukowcy opracowali wiele list genów kandydackich, polimorfizmów i białek, które stanowią istotny postęp, jednak mechanizmy działania tych czynników pozostają nieokreślone. Nasza praca jest nakierowana na znaczne zawężenie takich list poprzez wykorzystanie zalet prostego modelu zwierzęcego. Podczas gdy ludzie posiadają miliardy neuronów, mikroskopijny niciel okrągły Caenorhabditis elegans posiada dokładnie 302, z czego tylko osiem produkuje dopaminę (DA) u hermafrodytów. Ekspresja ludzkiego genu kodującego białko związane z PD, alfa-synukleinę, w neuronach DA C. elegans prowadzi do neurodegeneracji zależnej od dawki i wieku.
Nicienie wykazujące ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny w neuronach DA są izogeniczne i wykazują ekspresję zarówno GFP, jak i ludzkiej alfa-synukleiny pod promotorem transportera DA (Pdat-1). Obecność GFP służy jako łatwo wizualizowany marker do śledzenia neurodegeneracji DA u tych zwierząt. Początkowo wykazaliśmy, że neurodegeneracja DA indukowana przez alfa-synukleinę może zostać zahamowana u tych zwierząt przez torsynę A, białko o aktywności chaperonowej 1. Następnie w neuronach DA C. elegans nadekspresowano potencjalne geny związane z PD, zidentyfikowane w naszym laboratorium w ramach szeroko zakrojonych badań RNAi z wykorzystaniem testu błędnego fałdowania alfa-synukleiny. Ustaliliśmy, że pięć z siedmiu przetestowanych genów stanowi istotne potencjalne modulatory PD, ponieważ hamowały one indukowaną alfa-synukleiną neurodegenerację DA 2. Dodatkowo zespół Lindquista (w niniejszym numerze JoVE) przeprowadził badania przesiewowe na drożdżach, w których toksyczność zależna od alfa-synukleiny była wykorzystywana jako odczyt dla genów mogących nasilać lub tłumić cytotoksyczność. Następnie zbadaliśmy te potencjalne geny drożdżowe w naszym teście neurodegeneracji indukowanej alfa-synukleiną u C. elegans i pomyślnie zwalidowaliśmy wiele z tych celów 3, 4.
Nasza metodologia obejmuje generowanie wektora ekspresyjnego specyficznego dla neuronów DA u C. elegans przy użyciu klonowania rekombinacyjnego cDNA genów kandydackich pod kontrolą promotora Pdat-1. Plazmidy te są następnie wstrzykiwane metodą mikroiniekcji do glist typu dzikiego (N2), wraz z markerem selekcyjnym umożliwiającym identyfikację udanej transformacji. Uzyskujemy wiele stabilnych linii transgenicznych produkujących białko kandydackie w neuronach DA, które następnie są niezależnie krzyżowane ze szczepem degeneracyjnym alfa-synukleiny i oceniane pod kątem neurodegeneracji, zarówno na poziomie całego organizmu, jak i pojedynczych neuronów, w procesie starzenia.

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wykorzystania C. elegans do oceny neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych jako modelu choroby Parkinsona. Ponadto zastosowano przesiewy genetyczne w celu zidentyfikowania czynników, które albo nasilają degenerację, albo wykazują działanie neuroprotekcyjne.

Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans w celu walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona

Udoskonalenie diagnostyki i leczenia choroby Parkinsona (PD) zależy od wiedzy na temat czynników podatności, które sprawiają, że populacje...

W laboratorium Caldwella, znanym również jako „Worm Shack”, badamy mechanizmy chorób neurologicznych u *C. elegans*. Po długim dniu owocnych eksperymentów nagradzamy się aktywnością rekreacyjną. Cześć, nazywam się Adam Knight i jestem studentem studiów licencjackich w laboratorium Caldwella na Wydziale Nauk Biologicznych Uniwersytetu Alabamy.Dzisiaj wraz z zespołem pokażemy, jak przeprowadzić test degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans. Skrzyżuję szczep nicieni z neurodegeneracją neuronów dopaminergicznych ze szczepami transgenicznymi, które nadmiernie ekspresyjne potencjalne geny związane z chorobą w neuronach dopaminergicznych. Cześć, nazywam się Adam Harrington i jestem doktorantem w laboratorium Caldwella.Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować transgeniczne nicienie do analizy neuronów dopaminergicznych. Witajcie, nazywam się Shu Amichi i jestem studentem studiów doktoranckich. Przedstawię tutaj sposób badania neuronów dopaminergicznych C. elegans, zwanych CEP i ADE.Zazwyczaj nicienie wykazujące ekspresję wyłącznie GFP w neuronach dopaminergicznych nie przejawiają śmierci komórkowej. Jednak w obecności CLE zaobserwują Państwo zjawisko to oraz zależną od wieku neurodegenerację. Wykorzystując ten test, w neuronach dopaminergicznych można koekspresować transgen, aby określić, czy jest on w stanie nasilać lub hamować toksyczność indukowaną przez CLE. Przejdźmy zatem do części praktycznej.Przed przeprowadzeniem analizy neuronów dopaminergicznych należy najpierw skrzyżować odpowiednie szczepy GaN, aby rozpocząć proces; na płytkę do kopulacji należy nanieść osiem samców wykazujących ekspresję zarówno alphas nucle, jak i GFP pod kontrolą promotora specyficznego dla neuronów dopaminergicznych dat one. Następnie należy dodać dwie transgeniczne osobniki C. elegans w stadium L4, które wykazują specyficzną dla neuronów dopaminergicznych ekspresję badanego genu kandydata, a także ekspresję fluorescencyjnego markera selekcyjnego DS red two w komórkach mięśni ściany ciała. Należy zaznaczyć, że dla każdej konstrukcji transgenu generujemy trzy stabilne linie transgeniczne.W związku z tym to krzyżowanie genetyczne powinno zostać przeprowadzone oddzielnie dla każdej z trzech stworzonych stabilnych linii. Po dwóch dniach usunąć i zutylizować samce po dodatkowych dwóch do trzech dniach. Przebadać pokolenie F1.Uzyskano kilka potomstwo męskie, co oznacza, że kopulacja zakończyła się sukcesem. Następnie przenieś indywidualnie na nowe płytki po pięć zwierząt z linii Aphrodite L4 z każdego krzyżowania, które wykazują zarówno marker fluorescencyjny GFP odziedziczony po rodzicu męskim, jak i fluorescencyjny marker ścian mięśni ciała DS red 2 odziedziczony po rodzicu hamadi. Przeniesione zwierzęta muszą znajdować się w stadium L4, aby upewnić się, że nie doszło jeszcze do kopulacji.Pozostawiając samce na płytce, należy pozwolić zwierzętom na samozapłodnienie przez trzy do czterech dni w celu uzyskania potomstwa F2. Następnie należy wyselekcjonować potomstwo F2; w tym celu przenieś od pięciu do 10 zwierząt wykazujących oba markery centromeryczne na oddzielne, indywidualne płytki.Następnie należy przeprowadzić przesiewową analizę pokolenia F3 w celu wyłonienia szalek, w których sto procent zwierząt wykazuje ekspresję GFP w neuronach dopaminergicznych, a część z nich wykazuje ekspresję fluorescencyjnego markera DS red two w komórkach mięśni ściany ciała. Zwierzęta te będą homozygotami pod względem genów alfa synukleiny i GFP, a także będą stabilnie transmitować nowo stworzony transgen. Po zakończeniu przesiewu można przystąpić do analizy neuronów dopaminergicznych.Aby rozpocząć analizę neuronów, przygotuj świeże płytki z trzema zwierzętami F3 zidentyfikowanymi w poprzednim kroku. Przygotuj płytkę dla każdej z trzech linii transgenicznych. Dodatkowo wysiej szczep z samą α-synukleiną GFP jako kontrolę i pozwól nicieniom urosnąć do stadium dorosłego.Gdy nicienie osiągną wiek dorosły, przenieś od 30 do 40 zwierząt transgenicznych z każdej linii na nową płytkę. Pozostaw je na pięć godzin w temperaturze 20 °C w celu zniesienia jaj. Po pięciu godzinach usuń i zutylizuj zwierzęta.Zarodki rozwijają się w obecności osobników dorosłych przez trzy do czterech dni w temperaturze 20 °C, aż osiągną stadium L4. Następnie przenosi się około stu transgenicznych zwierząt w stadium L4 na płytkę zawierającą 0,04 mg/mL 5-fluorodeoksyurydyny.Ten analog nukleotydu zapobiega rozwojowi następnego pokolenia poprzez hamowanie syntezy DNA. Ponieważ płytki z FDUR są światłoczułe, należy chronić je przed światłem, trzymając je pod przykryciem i całkowicie owinięte. Przygotuj podkład z agarozu do analizy nicieni.Należy używać ich na świeżo i nie dopuszczać do ich wyschnięcia. Przygotuj dwa szkiełka przedmiotowe, na których wzdłuż naklejono kawałek taśmy. Taśma służy jako ogranicznik zapewniający równą grubość warstw.Połóż trzecie szkiełko pomiędzy nimi na blacie. Są ustawione. Trzy obok siebie.Nanieś kroplę roztopionego agaru na środkową część szkiełka i szybko połóż na niej kolejne szkiełko prostopadle do dwóch pierwszych, obejmując wszystkie trzy szkiełka. Powtórz czynność, aby przygotować kilka dodatkowych pól agarowych, zgodnie z liczbą próbek przeznaczonych do analizy. Po przygotowaniu pól agarowych nanieś kroplę 6 µL 3 mM anestetyka na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 × 30 mm.Przenieś 40 dorosłych zwierząt do kropli, a następnie odwróć szkiełko nakrywkowe na podkładkę agarową. Powtórz czynność dla każdej z pozostałych linii. Oceń obecność każdego neuronu CEP oraz neuronu D u 30 zwierząt z każdej linii.Używając mikroskopu złożonego z epifluorescencją i kostką filtrującą umożliwiającą wizualizację FITC lub GFP, wykorzystamy kostkę filtrującą endo G-F-P-H-Y-Q do zapisywania danych w arkuszu oceny. Zwierzęta typu dzikiego zachowują pełną ekspresję GFP w czterech neuronach CEP i dwóch neuronach A DE. Pojedyncze zwierzęta wykazujące utratę neuronów D są klasyfikowane jako typ dziki lub degenerujące.Neurony te zapisuje się jako LG lub utrata GFP. Podobnie stopień degeneracji można ocenić, licząc całkowitą liczbę utraconych neuronów u każdego zwierzęcia, a następnie powtarzając analizę jeszcze dwukrotnie dla danej populacji. W każdym badaniu wykorzystano dodatkowo 30 zwierząt na linię.Obliczana jest średnia całkowita liczba nicieni wykazujących neurony dopaminergiczne typu dzikiego z trzech rund analizy. Analiza statystyczna neuroprotekcji jest następnie przeprowadzana przy użyciu testu t-Studenta z wartością P mniejszą niż 0,05. Aby porównać nicienie kontrolne ze szczepami wykazującymi nadekspresję genów kandydatów w neuronach dopaminergicznych, analizę tę przeprowadza się w różne dni po ułożeniu jaj, przy czym odpowiednie dni analizy są ustalane empirycznie.Na przykład ustaliliśmy, że odpowiednio 77%, 87% i 90% zwierząt alpha CLE plus GFP wykazuje degenerację neuronów dopaminergicznych w szóstym, siódmym i dziesiątym dniu po rozwoju. W związku z tym, jeśli przewidujemy, że badany transgen może nasilać neurodegenerację, przeprowadzimy analizę w szóstym dniu. Analogicznie, transgeny, które mogą hamować neurodegenerację, będą analizowane w siódmym i dziesiątym dniu.Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić test neurodegeneracji dopaminergicznej u C. elegans. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o następujących kwestiach: po pierwsze, należy użyć odpowiedniego markera do selekcji podczas krzyżówek genetycznych; po drugie, do krzyżówek należy wykorzystać zdrowe samce oraz larwy w stadium L4.Po trzecie, należy uważnie i konsekwentnie zliczać neurony CEP oraz DE. Procedura ta pozwoli na szybką analizę czynników genetycznych, które mogą nasilać lub hamować indukowaną przez alpha alpha CLE neurodegenerację. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

application-c-elegans-dopamine-neuron-degeneration-assay-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminowych C. elegans w celu walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona

W chorobie Parkinsona i ogólnie w zaburzeniach ruchowych, czułe i wiarygodne testy behawioralne są niezbędne do testowania nowych potencjalnych terapii. W tym miejscu opisujemy łatwą do opanowania baterię testów sensomotorycznych dla myszy, które są wrażliwe na różne stopnie uszkodzenia układu nigrostriatal i przydatne w badaniach przedklinicznych.

Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Izoenzymy lipooksygenazy (LOX) mogą generować produkty, które mogą zwiększać lub zmniejszać stan zapalny układu nerwowego i neurodegenerację. Badanie interakcji gen-środowisko może zidentyfikować efekty specyficzne dla izoenzymu LOX. Wykorzystanie modelu 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) uszkodzenia nigrostriatalnego w dwóch liniach transgenicznych z niedoborem izoenzymów LOX pozwala na porównanie wpływu izoenzymów LOX na integralność dopaminergiczną i stan zapalny.

Modele interakcji gen-środowisko w celu ujawnienia mechanizmów podatności w chorobie Parkinsona

W chorobie Parkinsona (PD) neurony dopaminergiczne istoty czarnej (SNc) ulegają degeneracji, co prowadzi do dysfunkcji motorycznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wyrażającej eGFP napędzany sekwencją promotora hydroksylazy tyrozyny (TH), zbierania pojedynczych neuronów fluorescencyjnych z kultur i pomiaru ich transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy system RatWalker, zbudowany przez przeprojektowanie aparatu MouseWalker, aby dostosować go do zwiększonych rozmiarów i wagi szczurów. System ten wykorzystuje sfrustrowane całkowite odbicie wewnętrzne (FTIR), szybkie przechwytywanie wideo i oprogramowanie do analizy w otwartym dostępie do śledzenia i ilościowego określania parametrów chodu.

Zastosowanie systemu RatWalker do analizy chodu w genetycznym modelu szczurzym choroby Parkinsona

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje hodowlę komórek ludzkich neuronów dopaminergicznych śródmózgowia, a następnie barwienie immunologiczne i generowanie profili fenotypowych neuronów na podstawie uzyskanych mikroskopowych obrazów o wysokiej zawartości, co pozwala na identyfikację zmian fenotypowych spowodowanych modulacjami genetycznymi lub chemicznymi.

Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Protokół ten opisuje ilościowy test defekacji u młodych mutantów RAC1/CED-10 Caenorhabditis elegans, oferując prosty model do badania stadij choroby Parkinsona prodromalnej. Przezwycięża ograniczenia innych modeli zwierzęcych i ułatwia testowanie strategii terapeutycznych skierowanych do wczesnej patologii Parkinsona.

Ocena ruchliwości przewodu pokarmowego u mutantów Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 jako narzędzie do badania wczesnej choroby Parkinsona

Ole Isacson przedstawia zwięzły przegląd choroby Parkinsona, jej przyczyn, strategii terapeutycznych oraz postępów w badaniach nad tą chorobą.

Ole Isacson: Opracowanie nowych terapii choroby Parkinsona

Poznaj test degeneracji neuronów dopaminowych w C. elegans do walidacji genów choroby Parkinsona. Ta metoda pozwala identyfikować czynniki neuroprotekcyjne i mechanizmy neurodegeneracji.

Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans w celu walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona

Przeglądaj więcej filmów