Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminowych C. elegans do walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona

W Caldwell Lab, znanym również jako Worm Shack, badamy mechanizmy chorób neurologicznych w morskiej elegancji. A po długim dniu owocnych eksperymentów nagradzamy się aktywnością rekreacyjną. Cześć, nazywam się Adam Knight, jestem studentem studiów licencjackich z Calwell Laboratory na Wydziale Nauk Biologicznych Uniwersytetu w Alabamie.

Dzisiaj ja i inni pokażemy, jak przeprowadzić test degeneracji neuronów dopaminowych w C Elegants. Będę krzyżował dopaminowy szczep neurodegeneracyjnych robaków ze szczepami transgenicznymi, które nadmiernie eksprymują geny związane z chorobą i neurony dopaminowe. Cześć, nazywam się Adam Harrington i jestem doktorantem w Caldwell Lab.

Dzisiaj pokażę wam, jak skonfigurować transgeniczne robaki do analizy neuronów dopaminowych. Cześć, nazywam się Shu Amichi i jestem studentem studiów magisterskich. Tutaj pokażę ci, jak oznaczyć wejście do neuronów dopaminowych elegancji C, które nazywane są ceps i aides.

Ogólnie rzecz biorąc, robaki wyrażające tylko GFP w neuronach dopaminowych nie wykazują śmierci komórki. Jednak w obecności CLE zaobserwujesz te i neurodegenerację zależną od wieku Korzystając z tego testu, transgen może ulegać koekspresji w neuronach dopaminowych, aby określić, czy może zwiększać lub tłumić toksyczność wywołaną przez CLE. Więc zacznijmy.

Przed przeprowadzeniem analizy neuronów dopaminowych musimy najpierw skrzyżować odpowiednie szczepy GaN, aby rozpocząć umieszczanie ośmiu młynów wyrażających zarówno jądro alfa, jak i GFP pod kontrolą specyficznego dla neuronu dopaminowego promotora dat jeden na płytce łączącej. Teraz dodaj dwie czteroetapowe transgeniczne afrodyty ca, które wykazują specyficzną dla neuronów dopaminowych ekspresję naszego interesującego nas genu kandydującego, a także ekspresję komórek mięśniowych ściany ciała czerwonego markera fluorescencyjnego DS dw. Ważne jest, aby pamiętać, że dla każdego konstruktu transgenu generujemy trzy stabilne linie transgeniczne.

Tak więc ta krzyżówka genetyczna powinna być wykonywana indywidualnie dla każdej z trzech oddzielnych stabilnych linii. Po dwóch dniach usuń i wyrzuć samce po dodatkowych dwóch do trzech dniach. Sprawdź generację F1.

Jest kilka męskich potomków, a krycie zakończyło się sukcesem. Następnie indywidualnie przenieś na nowe płytki pięć z Aphrodite L, cztery zwierzęta z każdej krzyżówki, które wykazują zarówno marker fluorescencyjny GFP odziedziczony po męskim rodzicu, jak i czerwony czerwony marker mięśni ściany ciała DS odziedziczony po rodzicu hamadi. Przenoszone zwierzęta muszą znajdować się na etapie L cztery, aby upewnić się, że nie osiągnęły jeszcze M.

Gdy samce są obecne na talerzu, pozwól zwierzętom na samozapłodnienie przez trzy do czterech dni, aby uzyskać potomstwo F dwa. Teraz oczyść potomstwo F dwa, aby to zrobić. Przenieś od pięciu do 10 zwierząt, które mają oba znaczniki centów, na ich indywidualne talerze.

Następnie przebadaj pokolenie F trzy pod kątem płytek, w których sto procent zwierząt wyraża GFP w neuronach dopaminowych i w których niektóre zwierzęta wyrażają DS, czerwony marker fluorescencyjny i komórki mięśniowe ściany ciała. Zwierzęta te będą homozygotyczne pod względem genów alfa synukleiny i GFP, a także będą stabilnie przekazywać nowo utworzony transgen. Po zakończeniu badania przesiewowego jesteśmy gotowi do przeprowadzenia analizy neuronów dopaminergicznych.

Aby rozpocząć analizę neuronów, przygotuj świeżą płytkę z trzema zwierzętami F zidentyfikowanymi w poprzednim kroku. Ustaw płytkę dla każdej z trzech linii transgenicznych. Oprócz płytki, sam szczep alfa-synukleiny GFP jako kontrola pozwala robakom rosnąć do dorosłości.

Gdy robaki osiągną dorosłość, przenieś od 30 do 40 transgenicznych zwierząt z każdej linii na świeży talerz. Pozwól im składać jaja przez pięć godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po pięciu godzinach wyjmij i wyrzuć.

Dorosłe osobniki pozwalają zarodkom rozwijać się przez trzy do czterech dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż osiągną stadium L cztery. Następnie wybierz około stu transgenicznych zwierząt L Four na płytkę zawierającą 0,04 miligrama na mililitr pięciu fluoro. Dwa deoksyurydyny.

Ten analog nukleotydu zapobiega rozwojowi następnego pokolenia poprzez hamowanie syntezy DNA. Ponieważ płytki FDUR są wrażliwe na światło, należy je chronić przed światłem, trzymając płytki pod przykryciem i owinięte w całości. Zrób sierpień brutto do analizy robaków.

Są one używane świeże i nie mogą wyschnąć. Ustaw dwa szkiełka mikroskopowe, w poprzek których znajduje się kawałek taśmy. Wzdłuż. Taśma służy jako przekładka dla podkładek o jednakowej grubości.

Połóż trzecią zjeżdżalnię między nimi na ławce. Są ustawione. Trzy obok siebie.

Umieść kroplę stopionego arus na środkowej stronie i szybko połóż kolejne szkiełko na wierzchu agros prostopadło dwa i w poprzek wszystkich trzech szkiełek. Powtórz tę czynność, aby wykonać kilka dodatkowych padów, tyle ile jest potrzebnych do liczby próbek do analizy. Gdy podkładki ślimaka będą gotowe, umieść sześciolitrową kroplę trzech milimolowych, 11-milowej piły i środka znieczulającego na szkle nakrywkowym o wymiarach 22 na 30 milimetrów.

Wybierz 40 dorosłych zwierząt do kropli, a następnie odwróć szkło nakrywkowe na podkładkę agros. Powtórz te czynności dla każdego z pozostałych wierszy. Oceń 30 zwierząt w linii pod kątem obecności każdego i neuronu D.

Używając mikroskopu złożonego z fluorescencją epi w kostce filtra, która umożliwia wizualizację FITC lub GFP, użyjemy kostki filtra endo G-F-P-H-Y-Q rejestrującej dane na arkuszu punktacji. Zwierzęta typu dzikiego zachowują pełną GFP przez lekcje we wszystkich czterech neuronach i dwóch neuronach A DE. Poszczególne zwierzęta wykazujące utratę neuronów D są oceniane jako znane dzikie lub zdegenerowane.

Neurony te są rejestrowane jako LG lub utrata GFP. Podobnie, zakres zwyrodnienia można ocenić, licząc całkowitą liczbę utraconych neuronów u każdego zwierzęcia, a populacja powtarza analizę jeszcze dwa razy. Wykorzystanie 30 dodatkowych zwierząt na linię w próbie.

Całkowita liczba robaków wykazujących neurony dopaminowe typu dzikiego z trzech rund analizy jest uśredniona. Następnie przeprowadza się analizę statystyczną pod kątem neuroprotekcji przy użyciu wartości P testu T studenta mniejszej niż 0,05. Aby porównać robaki kontrolne ze szczepami, które nadmiernie eksprymują geny kandydujące w neuronach dopaminowych, przeprowadź tę analizę różnych dni po linii jajowej, odpowiednie dni analizy określone empirycznie.

Na przykład ustaliliśmy, że 77%87% i 90% zwierząt alfa CLE i GFP wykazuje zdegenerowane neurony dopaminowe odpowiednio w szóstym, siódmym i dziesiątym dniu po rozwoju. Dlatego, jeśli przewidujemy, że interesujący nas transgen może nasilać neurodegenerację, przeanalizujemy to w szóstym dniu. Podobnie, transgen, który może hamować neurodegenerację, zostanie przeanalizowany w siódmym i dziesiątym dniu.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić test neurodegeneracji dopaminy w morskiej elegancji. Przeprowadzając tę procedurę, należy pamiętać o jednym, użyciu odpowiedniego markera do selekcji podczas krzyżówek genetycznych. Po drugie, użyj zdrowych samców i L czterech HEDI do krzyżówek.

I po trzecie, upewnij się, że dokładnie i konsekwentnie oceniasz i neurony DE. Ta procedura pozwoli Ci szybko oznaczyć czynnik genetyczny, który może nasilać lub hamować neurodegenerację wywołaną alfa alfa CLE. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.