Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej u C. elegans

Witajcie, jestem Cody Locke z Laboratorium Caldwell w Katedrze Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Alabama. Jestem Kyle Lee i pokażę wam, jak przygotować nicienie do testów ekspozycji na out-carb i PTZ. Jestem Bernard Tu i zaprezentuję wam sposób przeprowadzania testów out-carb.

Nazywam się Kaylin Berry i odpowiadam za filmy dotyczące C. elegans. W tej prezentacji będę pełniła rolę narratora oraz zademonstruję test ekspozycji na PTZ. Dziś wraz z moimi współpracownikami pokażemy, jak charakteryzować mutanty transmisji synaptycznej w modelu epilepsji C. elegans po ekspozycji na PTZ i aldekarb, wykorzystując serię reprezentatywnych szczepów mutantów.

Zacznijmy zatem. Kyle Lee rozpocznie dzisiejszą prezentację, pokazując przygotowanie testów ALD carb w pierwszym dniu procedury. Należy upewnić się, że na drugi dzień testów ALD carb dostępnych będzie co najmniej 30 nicieni w stadium młodych osobników dla każdego genotypu i każdej powtórki.

Zaleca się, aby badacz przeniósł 50 lub więcej nicieni w czwartym stadium larwalnym (L4) na świeże płyty NGM wolne od fungicydów, wysiane bakteriami e coli OP 50 jako źródłem pożywienia. Nicienie należy hodować przez 12 do 24 godzin w stałej, dopuszczalnej temperaturze. Optymalny zakres to od 20°C do 22°C, choć temperatura 25°C jest również dopuszczalna.

Drugiego dnia należy przygotować 100 mM roztwór zapasu Al Decarb oraz 70% etanol, a następnie rozprowadzić odpowiednią ilość Al Decarb na płytkach NGM. Stosujemy stale stężenie 0,5 mM Al Decarb, nakładając 37,5 µL roztworu 100 mM Al Decarb na 60 mm nieprzepuszczalne płytki Petri zawierające 7,5 mL podłoża NGM. Płytki z Al Decarb należy pozostawić do wyschnięcia na około 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej.

Po wyschnięciu płytek nie ma potrzeby uchylania ich pokrywek. Nanieść jednakowe objętości e coli na środek każdej płytki alde carb i suszyć przez kolejne 30 do 60 minut. W temperaturze pokojowej zazwyczaj nanosimy 25 µL e coli OP 50.

Taka objętość OP 50 tworzy odpowiednio rozległy trawnik pokarmowy, który utrzymuje nicienie w niewielkim obszarze w centrum płytki, zapobiegając ich nadmiernemu zagęszczeniu. Po wyschnięciu trawnika pokarmowego należy przystąpić do analiz albakarbowych. Ze względu na subiektywny charakter analiz ALD carb, wysoce zaleca się przeprowadzanie eksperymentów metodą ślepej próby.

Aby to osiągnąć, współpracownik głównego eksperymentatora ponownie etykietuje oryginalne płytki zawierające nicienie przeznaczone do analizy lub przenosi nicienie z płytek oryginalnych na płytki z cyferaldekarbem bezpośrednio przed uruchomieniem stopera. Po wysianiu nicieni na płytki, ABO przystępuje do analizy; aby rozpocząć analizę, należy zliczyć liczbę sparaliżowanych nicieni.

Istnieją dwa główne podejścia do definiowania paraliżu wywołanego gwałtowną dekarboksylacją al. Pierwsze z nich definiuje paraliż jako zaprzestanie pompowania gardzielowego. W niniejszej notatce wideo widoczna jest ciemna struktura, która znajduje się w świetle gardzieli nicienia po prawej stronie ekranu.

Struktura ta jest nazywana młynkiem i kurczy się rytmicznie poprzez mechanizm cholinergiczny. Lokomocja nicienia w tym filmie została znacznie spowolniona w wyniku ekspozycji na Al Decarb. Mimo to młynka gardłowego tego nicienia wciąż wyraźnie się porusza.

Zatem ten nicień nie jest sparaliżowany zgodnie z definicją ustania pompowania. W tym filmie powinno być widać, że żarnia gardzielowa znajdująca się po prawej stronie ekranu nie kurczy się, przyjmując ustanie pompowania jako roboczą definicję paraliżu wywołanego przez al Decarb. Ten nicień powinien zostać oceniony jako sparaliżowany.

Jednakże, podobnie jak nicień w poprzednim filmie, ten osobnik wykazuje lekkie ruchy poszukiwawcze z boku na bok. Mimo że jego lokomocja została upośledzona przez Al Decarb, ruchy te uniemożliwiłyby eksperymentatorowi uznanie tego nicienia za sparaliżowanego zgodnie z drugą metodą definiowania paraliżu indukowanego przez Al Decarb, czyli całkowitego unieruchomienia ciała i braku reakcji na dotyk. Druga metoda definiowania paraliżu indukowanego przez Al Decarb polega na systematycznym dotykaniu każdego nicienia platynowym drutem i sprawdzaniu reakcji.

Jeśli ruchy ciała nie są wykrywalne gołym okiem, naszą preferowaną metodą jest dotykanie nicieni dwa razy w głowę i dwa razy w ogon co 30 minut przez łącznie trzy godziny. Jak widać, nicień w tym filmie nie wykazuje wyraźnych ruchów ciała. Niemniej jednak, ponieważ nicień ten reaguje na dotykanie wyraźnym poruszaniem ogonem, nie uznajemy go za sparaliżowanego.

Zgodnie z drugą definicją paraliżu wywołanego przez al decarb. Podobnie jak nicień w poprzednim filmie, ten osobnik nie porusza ciałem w sposób oczywisty i tym samym wymaga testu dotykowego. Jednak w przeciwieństwie do nicienia z poprzedniego filmu, ten osobnik nie reaguje wyraźnie na dotyk.

W związku z tym robak ten jest sparaliżowany zgodnie z drugą definicją paraliżu wywołanego przez Al Decarb. Chociaż różnica między stanem sparaliżowanym a niesparaliżowanym przez Al Decarb może być subtelna, eksperymentatorzy powinni być w stanie zidentyfikować istotne zmiany w przekaźnictwie synaptycznym, obserwując po prostu dużą liczbę reprezentatywnych robaków wystawionych na działanie Al Decarb bezpośrednio po przeniesieniu na płytki z Al Decarb. Robaki typu dzikiego pozostają mobilne.

W tym filmie można zobaczyć te same nicienie typu dzikiego z poprzedniego filmu po jednej godzinie ekspozycji na Al Decarb. Należy zauważyć, że ruchy nicieni uległy w pewnym stopniu spowolnieniu, jednak wciąż wyraźnie się poruszają.

W przeciwieństwie do nicieni typu dzikiego, mutanty tomasin one w tym filmie są całkowicie unieruchomione lub ledwo się poruszają po godzinie ekspozycji. Wynik ten jest spójny z faktem, że mutanty tomasin one wykazują nadmierną sekrecję acetylocholiny z powodu niezdolności do negatywnej regulacji uwalniania neuroprzekaźnika w złączach nerwowo-mięśniowych; nadmiar acetylocholiny w szczelinach synaptycznych złącz nerwowo-mięśniowych w połączeniu z inhibicją degradacji acetylocholiny przez Bial Decarb sprawia, że mutanty tomasin one stają się nadwrażliwe. Choć nie pokazano tego tutaj, postulatedowano, że podobne wyniki występują w testach alde carb z allelami utraty funkcji genu on 43, który koduje ortolog C. elegans kinazy białkowej dwa zależnej od kalcyneuryny/kalmoduliny. Ten film przedstawia mutanty on 25, u których występuje deficyt hamującego przekaźnictwa GABAergicznego.

Po jednej godzinie ekspozycji na al Decarb, podobnie jak mutanty tomasin one i M 43, mutanty te wykazują znaczne zaburzenia lokomocyjne wywołane przez al Decarb i wydają się być bardziej dotknięte niż robaki typu dzikiego przy ekspozycji na al Decarb przez taki sam czas. Wynik ten jest zgodny z hipotezą, że mutanty M 25 mają nadmiernie pobudzone mięśnie ściany ciała w wyniku połączenia ekspozycji na al Decarb i zredukowanej transmisji GABAergicznej, co prowadzi do zwiększenia stosunku transmisji pobudzającej do hamującej w złączach nerwowo-mięśniowych CL ELs i w konsekwencji do paraliżu. Niemniej jednak mutanty tomasin one on 43 oraz on 25 wykazują podobną wrażliwość na al Decarb w tym punkcie czasowym.

Mimo różnych przyczyn nadmiernej stymulacji mięśni ściany ciała, badacz nie mógłby poznać mechanizmu leżącego u podstaw nadwrażliwości bez uprzedniej identyfikacji mutacji sprawczych. W tym filmie powróciliśmy do tych samych robaków typu dzikiego z poprzedniego materiału wideo po trzech godzinach ekspozycji na aldecarb; w tym końcowym punkcie naszego testu z aldecarb powinno być wyraźnie widać, że robaki te, mimo bycia typem dzikim, są albo całkowicie unieruchomione, albo poruszają się ledwie zauważalnie. Robaki te są obecnie fenotypowo podobne do mutantów TOM one i M 25 pokazanych w pierwszej godzinie po ekspozycji na aldecarb, prawdopodobnie dlatego, że pobudzające przekaźnictwo cholinergiczne osiągnęło porównywalne poziomy; w przeciwieństwie do nich, mutanty Synap Bren one pozostają znacznie bardziej mobilne po trzech godzinach ekspozycji na aldecarb.

Wynik ten jest zgodny z obserwacją, że mutanty Synaptive Bren one, u których brakuje prawidłowego poziomu sekrecji neuroprzekaźników, wykazują słabszą stymulację cholinergicową mięśni ściany ciała niż nicienie typu dzikiego po narażeniu na identyczne stężenia alde carb w tym czasie. Mutanty Point on four, które charakteryzują się specyficznym deficytem przekaźnictwa cholinergicznego, powinny wykazywać podobną wrażliwość na Al Decarb jak mutanty Synaptive Bren one. Odwrotnie, mutanty nadwrażliwe Tomasin one i O 25 pozostają sparaliżowane, podobnie jak nicienie typu dzikiego.

Warto zauważyć, że niektóre nicienie, zwłaszcza te oporne na Al Decarb, mogą próbować pełznąć poza płytkę. W takim przypadku badacz może nanieść odpowiednią ilość kwasu palmitynowego, który stanowi fizyczną barierę dla ruchu nicieni. Wokół płytek Al Decarb naniesiono 25 µL kwasu palmitynowego w stężeniu 10 mg/mL w etanolu.

To kończy schemat narażenia na Al Decarb. Teraz zaprezentuję schemat narażenia na Penta Lean Terazol. Kaylin Berry pomoże nam w przeprowadzaniu testów PTZ.

Przygotowanie nicieni do testów PTZ jest w zasadzie takie samo, jak przygotowanie nicieni do testów alde carb. Jedynymi istotnymi różnicami między tymi dwoma testami są następujące kwestie: jako rozpuszczalnik PTZ stosujemy DDH₂O zamiast 70% etanolu.

Ponadto, ponieważ często nakładamy na płytki większe objętości PTZ niż aldehyd karbamianu, pozostawiamy płytki do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę przed dodaniem OP 50. Do PTZ można również stosować kwas palmitynowy. Należy także zauważyć, że PTZ jest znacznie mniej stabilny niż aldehyd karbamianu i musi być przechowywany w temperaturze -20 °C.

Aby rozpocząć analizę, należy liczyć liczbę robaków wykazujących drgawki świetlne co 30 minut przez łącznie jedną godzinę. Zaleca się klasyfikowanie liczby robaków z różnymi typami drgawek w oddzielnych kategoriach, takich jak drgawki całego ciała, drgawki przedniej części ciała, które nazywamy „head bobs”, połączenie drgawek przednich z paraliżem mięśni ściany ciała, które nazywamy drgawkami toniczno-klonicznymi, lub całkowitym paraliżem ciała, który nazywamy stanem tonicznym. Aktywność przypominająca napady, widoczna u robaka po prawej stronie, często następuje po drgawkach toniczno-klonicznych, widocznych u robaka po lewej stronie.

Aktywność przypominająca napady drgawkowe może wynikać po prostu ze zmęczenia mięśni po powtarzających się konwulsjach toniczno-klonicznych. Jednak nasze niepublikowane dane wskazują, że niektóre nicienie mogą przejść w stan toniczny pod wpływem PTZ w sposób podobny do paraliżu wywołanego przez al decarb, bez uprzedniego wystąpienia drgawek toniczno-klonicznych. Przedstawiamy tutaj reprezentatywnego nicienia z mutacją transmisji synaptycznej, który pełza w obecności PTZ – antagonisty receptorów GABA i powszechnego induktora napadów w różnych modelach zwierzęcych napadów drgawkowych i epilepsji.

Należy zauważyć, że podczas żerowania koniec lub przód ciała nicienia porusza się na boki. W tym filmie przedstawiamy innego nicienia z tej samej szczepu mutantów transmisji synaptycznej, który był wykorzystany w poprzednim materiale. Zwróćmy uwagę, że ten nicień, znajdujący się w obecności 2,5 mg PTZ na ml wody, w większości nadal porusza głową na boki podczas żerowania.

Niemniej jednak nicień ten sporadycznie przerywa żerowanie z boku na bok i zamiast tego wielokrotnie wypycha przedni koniec ciała do przodu. Na koniec należy zaobserwować nicienia posiadającego tę samą mutację co nicienie w dwóch poprzednich filmach, w obecności 10 mg PTZ na ml wody. Zauważmy, że nicień ten wykazuje zmniejszone żerowanie z boku na bok i wypycha przedni koniec ciała do przodu z większą częstotliwością i intensywnością niż przy niższym stężeniu PTZ.

Wyniki te wykazują zależność dawka-odpowiedź w przypadku PTZ, co obserwujemy u wszystkich mutantów przekaźnictwa synaptycznego wrażliwych na PTZ. Co istotne, ekspozycja na PTZ nie jest wystarczająca do wywołania napadów przypominających epilepsję u nicieni typu dzikiego. Analogicznie, próbowano wywołać napady przypominające epilepsję za pomocą PTZ u nicieni z konkretnymi deficytami przekaźnictwa cholergicznego, takimi jak on four, lub u nicieni z nadmiernym przekaźnictwem cholergicznym, takich jak tomasin one, lecz nie zaobserwowano takiego efektu.

Zatem możliwe powinno być dalsze różnicowanie mutantów transmisji synaptycznej z opornością na aldekarb, oddzielając ogólne deficyty funkcji synaptycznej od specyficznych deficytów transmisji cholinergicznej na podstawie ich względłej wrażliwości na PTZ. Być może zaskakujące jest to, że mutant ONC 25 o silnie zredukowanej funkcji, u którego nie stwierdzono ekspresji GABA w hamujących neuronach ruchowych C. elegans, nie wykazuje spontanicznych epileptycznych drgawek, co widać na tym filmie.

Mutant ONC 25 w 10 mg PTZ na ml wody wykazuje silne drgawki toniczno-kloniczne, choć nie pokazano tutaj, że drgawkom toniczno-klonicznym związanym z ONC 25 poprzedzały jedynie drgawki z pewnym ruchem, które naśladowały drgawki mutantów synap Bren one. Zatem eksperymentator nie powinien zakładać, że wszystkie mutanty hamującego układu GABA będą wykazywać drgawki toniczno-kloniczne lub ściśle powiązaną aktywność przypominającą napady toniczne w obecności PTZ, szczególnie biorąc pod uwagę prawdopodobieństwo uzyskania hipomorficznych alleli mutantów.

Po wykazaniu nadwrażliwości na aldecarb i PTZ u mutantów z zaburzoną inhibicją GABA, a jedynie nadwrażliwości na aldecarb i normalnej wrażliwości na PTZ u mutantów pozbawionych negatywnej regulacji przekaźnictwa cholergicznego, można by się zastanowić, jak reagują na PTZ mutanty z utratą funkcji UNC-43, skoro są one również nadwrażliwe na aldecarb, podobnie jak nasze pozostałe mutanty przekaźnictwa synaptycznego. Mutanty UNC-43 nie wykazują oczywistych konwulsji o charakterze epileptycznym w przypadku braku PTZ, choć u tych mutantów występują rzadkie, nierepetytywne, lecz wciąż spontaniczne skurcze całego ciała. Jednak po ekspozycji na 10 mg PTZ na ml wody, mutanty z utratą funkcji UNC-43 wykazują silne, repetytywne i zależne od dawki konwulsje całego ciała. Na tym etapie wyniki te są niejednoznaczne, lecz wydają się wskazywać, że UNC-43 nie musi pełnić specyficznej roli w inhibicyjnym przekaźnictwie GABAergicznym ani roli wyłącznie w negatywnej regulacji uwalniania neurotransmitera.

W układzie nerwowym C. elegans zaprezentowaliśmy właśnie sposób charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej C. elegans przy użyciu komplementarnych stymulantów neuronalnych: aldekarbu, inhibitora cholinesterazy, oraz PTZ, antagonisty receptorów GABA. Stosując komplementarny paradygmat farmakologiczny, należy pamiętać, że stopień wrażliwości na jeden stymulant neuronalny nie pozwala przewidzieć stopnia wrażliwości na drugi stymulant neuronalny. Wykorzystanie testów z aldekarbem powinno pomóc w odróżnieniu mutantów inhibitornych GABA, które wykazują ruchy głową (head bobbing) pod wpływem PTZ, ale są nadwrażliwe na aldekarb, od mutantów z ogólnym deficytem funkcji synaptycznych, które również wykazują ruchy głową pod wpływem PTZ, lecz są oporne na aldekarb. Ponadto należy mieć na uwadze, że mutanty inhibitorne GABA wykazują ruchy głową pod wpływem PTZ, podczas gdy nicienie pozbawione ujemnej regulacji transmisji cholinergicznej pod wpływem PTZ wykazują fenotyp typu dzikiego.

Zatem test z użyciem PTZ może zostać również wykorzystany do rozróżnienia tych klas mutantów transmisji synaptycznej, z których oba wykazują nadwrażliwość na Alde carb. Podsumowując, uzupełniające podejście z wykorzystaniem testów PTZ i Alde carb powinno pozwolić badaczowi na charakterystykę mutantów transmisji synaptycznej C. elegans w sposób, który jest niemożliwy do osiągnięcia przy użyciu każdego z tych leków z osobna. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w badaniach.