Name: Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-18T17:08:00.000+00:00
Duration: 18 min 1 s
Description: Poznaj metody farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej C. elegans przy użyciu aldicarbu i PTZ. Technika ta pozwala badać mechanizmy synchronizacji neuronowej z zastosowaniem w epilepsji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować wszystkim członkom laboratorium Caldwell za ducha współpracy. Badania nad pobudliwością neuronalną i epilepsją w laboratorium Caldwell były finansowane z nagrody Basil O’Connor Scholar Award przyznanej przez March of Dimes, grantu CAREER z National Science Foundation dla GAC, a także grantu z programu Undergraduate Research Science Program z Howard Hughes Medical Institute dla The University of Alabama.

Paradygmat ekspozycji na aldikarb
<ol>
<li>Pierwszego dnia należy zapewnić dostępność co najmniej trzydziestu nicieni w stadium młodych osobników dorosłych dla każdego genotypu i każdej powtórki, które będą wykorzystane do testów z aldikarbem drugiego dnia. Zaleca się, aby badacz przeniósł pięćdziesiąt lub więcej nicieni w stadium L4 na świeże płytki NGM (najlepiej bez nystatyny), zawierające E. coli (preferencyjnie szczep OP50) jako źródło pożywienia, i hodował je przez 12-24 godziny w stałej, dopuszczalnej temperaturze (najlepiej od 20°C do 22°C, choć 25°C jest również dopuszczalne). </li>
<li>Drugiego dnia należy przygotować 100 mM roztwór zapasowy aldikarbu w 70% etanolu (EtOH) i 30% ddH2O. Odpowiednią ilość aldikarbu należy rozprowadzić na płytkach NGM bez nystatyny, stosując określone objętości w celu uzyskania pożądanych stężeń aldikarbu. My konsekwentnie stosujemy 0.5 mM aldikarbu, nanosząc 37.5 μL 100 mM aldikarbu na płytki NGM o objętości 7.5 mL. Płytki z aldikarbem należy pozostawić do wyschnięcia przez około 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Nie ma potrzeby uchylania pokrywek. Alternatywnie aldikarb można dodać do NGM i przechowywać w temperaturze 4°C przez jeden tydzień. &nbsp;</li>
<li>Po wyschnięciu należy nanieść stałe objętości E. coli (preferencyjnie OP50) na środek każdej płytki z aldikarbem i pozostawić do wyschnięcia przez kolejne 30-60 minut w temperaturze pokojowej. My konsekwentnie nanosimy 25 μL OP50, co tworzy lawn pożywkowy o wystarczającej wielkości, aby utrzymać nicienie w małym obszarze, unikając jednocześnie ich nadmiernego zagęszczenia. &nbsp;</li>
<li>Gdy lawn pożywkowy wyschnie, można przystąpić do testów z aldikarbem. Ze względu na subiektywny charakter testów z aldikarbem, zdecydowanie zaleca się przeprowadzanie eksperymentów metodą „ślepej próby”. Kolega głównego badacza może ponownie oznakować oryginalne płytki z nicieniami przeznaczonymi do analizy. Podobnie, kolega ten może przenieść nicienie z oryginalnych płytek na zakodowane płytki z aldikarbem bezpośrednio przed uruchomieniem stoperem czasu. Jeśli badacz przewiduje analizę konkretnego szczepu nicieni o charakterystycznym fenotypie, takim jak brak koordynacji, należy również zastosować kontrolę o podobnym fenotypie, aby zredukować błąd systematyczny. Ponadto najlepiej jest, aby badacz równolegle analizował szczep typu dzikiego, szczep oporny oraz szczep nadwrażliwy, co pomaga w standaryzacji eksperymentów. Badacz powinien dążyć do analizy stałej liczby nicieni dla każdej powtórki. My konsekwentnie analizujemy trzydzieści nicieni jednego genotypu dla każdej powtórki. Wykonujemy również co najmniej trzy powtórki dla każdego eksperymentu. Doświadczony badacz powinien być w stanie analizować co najmniej sześć szczepów jednocześnie. &nbsp;</li>
<li>Liczbę sparaliżowanych nicieni należy określić poprzez systematyczne dotykanie każdego osobnika drutem platynowym. My konsekwentnie dotykamy naszych nicieni dwukrotnie w obrębie głowy i dwukrotnie w obrębie ogona co 30 minut przez łącznie trzy godziny. Do zdefiniowania paraliżu można również wykorzystać ustanie pompowania gardłowego, jednak tylko wtedy, gdy badacz stosuje spójną definicję paraliżu we wszystkich testach. Warto również zauważyć, że niektóre nicienie, zwłaszcza te oporne na aldikarb, mogą próbować pełznąć poza płytkę. W takim przypadku badacz może nanieść stałą ilość kwasu palmitynowego, który stanowi fizyczną barierę dla lokomocji nicieni, wokół płytek z aldikarbem. My nanosimy 25 μL roztworu 10 mg kwasu palmitynowego/mL EtOH.</li>
</ol>
Paradygmat ekspozycji na PTZ
<ol>
<li>Pierwszego dnia należy zapewnić dostępność co najmniej trzydziestu młodych dorosłych nicieni każdego genotypu i każdej repliki do testów PTZ, które odbędą się drugiego dnia. Zaleca się, aby badacz przeniósł pięćdziesiąt lub więcej nicieni w stadium L4 na świeże płytki NGM (najlepiej bez nystatyny), zawierające E. coli (preferencyjnie szczep OP50) jako źródło pożywienia, i hodował je przez 12-24 godziny w stałej, dopuszczalnej temperaturze (najlepiej od 20°C do 22°C, choć 25°C jest dopuszczalne). </li>
<li>Drugiego dnia należy przygotować roztwór zapasowy PTZ o stężeniu 0,5 g PTZ/mL ddH2O. Odpowiednią ilość PTZ rozprowadza się na płytkach NGM bez nystatyny w określonych objętościach, aby uzyskać pożądane stężenia PTZ. Ponieważ w przypadku PTZ preferujemy testy zależności dawka-odpowiedź, nakładamy różne ilości PTZ na płytki NGM o objętości 7,5 mL. Na przykład można nanieść 37,5 μL roztworu zapasowego PTZ na płytkę NGM 7,5 mL, aby uzyskać roztwór o stężeniu 5 mg PTZ/mL. Płytki z PTZ należy pozostawić do wyschnięcia przez około 60-120 minut w temperaturze pokojowej. Nie jest konieczne uchylanie pokrywek. Alternatywnie PTZ można dodać bezpośrednio do NGM, ale należy go użyć do testów niezwłocznie po zestaleniu. Stabilność PTZ jest znacznie niższa niż w przypadku aldikarbu. W związku z tym testy z wykorzystaniem starszych płytek PTZ są mniej wiarygodne. Przed użyciem PTZ należy przechowywać w temperaturze -20°C w eksykatorku z absorbentem wilgoci. W celu zapewnienia stabilności zalecamy utylizację PTZ około dwóch miesięcy po otwarciu. </li>
<li>Po wyschnięciu należy nanieść stałe objętości E. coli (preferencyjnie OP50) na środek każdej płytki PTZ i suszyć przez kolejne 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Stosujemy stałą objętość 25 μL OP50, co tworzy lawn bakteryjny o wystarczającym rozmiarze, aby utrzymać nicienie w małym obszarze bez ich nadmiernego zagęszczenia. &nbsp;</li>
<li>Gdy lawn bakteryjny wyschnie, można przystąpić do testów PTZ. Chociaż testy PTZ są mniej subiektywne niż testy z aldikarbem, nadal wysoce zaleca się przeprowadzanie eksperymentów metodą „ślepej próby”. Kolega głównego badacza może ponownie oznakować oryginalne płytki z nicieniami przeznaczonymi do badania. Podobnie kolega może przenieść nicienie z płytek oryginalnych na zakodowane płytki PTZ bezpośrednio przed uruchomieniem stopera. Jeśli badacz przewiduje analizę konkretnego szczepu nicieni o charakterystycznym fenotypie, np. braku koordynacji, należy zastosować kontrolę o podobnym fenotypie w celu zmniejszenia błędu systematycznego. Ponadto najlepiej jest, aby badacz równolegle analizował szczep typu dzikiego oraz szczepy z konwulsjami przednimi lub całego ciała, co pomaga w standaryzacji eksperymentów. Badacz powinien dążyć do analizy stałej liczby nicieni dla każdej repliki. My konsekwentnie analizujemy trzydzieści nicieni jednego genotypu dla każdej repliki. Wykonujemy również co najmniej trzy powtórzenia dla każdego eksperymentu. Doświadczony badacz powinien być w stanie analizować co najmniej trzy szczepy jednocześnie. Należy jednak pamiętać, że częstotliwość i intensywność konwulsji indukowanych przez PTZ zwykle osiągają szczyt między 15 a 30 minutą ekspozycji, a następnie słabną w miarę jak nicienie ulegają paraliżowi lub w niektórych przypadkach aklimatyzują się do leku. </li>
<li>Należy liczyć liczbę nicieni z konwulsjami „typu epileptycznego” co 30 minut przez łącznie jedną godzinę. Najlepiej jest oddzielnie oceniać liczbę nicieni z konwulsjami przednimi, które nazywamy „head-bobs”, od liczby nicieni z konwulsjami całego ciała, paraliżem całego ciała, który nazywamy „tonic”, lub kombinacją konwulsji przednich z paraliżem BWM, co nazywamy „tonic-clonic”. Większość nicieni jednego genotypu wykazuje tylko jeden rodzaj konwulsji. Jednak nicienie tonic-clonic często stają się całkowicie tonic, dlatego należy kontynuować badanie powyżej 30 minut, nawet jeśli wszystkie nicienie wykazały już konwulsje. Warto również zauważyć, że niektóre nicienie mogą próbować pełznąć poza płytkę. W takim przypadku badacz może rozprowadzić stałą ilość kwasu palmitynowego wokół płytek PTZ. My rozprowadzamy 25 μL roztworu 10 mg kwasu palmitynowego/mL EtOH.</li>
</ol>
&nbsp;
Reakcje behawioralne wybranych mutantów transmisji synaptycznej C. elegans na aldikarb i PTZ
<table style="height: 157px;" border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Nazwa mutanta</td><td>Rola synaptyczna</td><td>Zachowanie bez leku</td><td>Reakcja behawioralna na aldikarb (w porównaniu do typu dzikiego N2)</td><td>Reakcja behawioralna na PTZ</td>
</tr>
<tr>
<td>tom-1(ok188)</td>
<td>hamuje przekaźnictwo synaptyczne</td>
<td>nieskoordynowany</td>
<td>zwiększona szybkość paraliżu</td>
<td>nieodróżnialny od typu dzikiego</td>
</tr>
<tr>
<td>unc-43(n498n1186)</td>
<td>złożona</td>
<td>nieskoordynowany</td>
<td>zwiększona szybkość paraliżu</td>
<td>konwulsje całego ciała</td>
</tr>
<tr>
<td>unc-25(e156)</td>
<td>promuje przekaźnictwo GABA</td>
<td>nieskoordynowany</td>
<td>zwiększona szybkość paraliżu</td>
<td>konwulsje przedniej części ciała, paraliż całego ciała</td>
</tr>
<tr>
<td>snb-1(md247)</td>
<td>promuje przekaźnictwo synaptyczne</td>
<td>nieskoordynowany</td>
<td>zmniejszona szybkość paraliżu</td>
<td>konwulsje przedniej części ciała</td>
</tr>
<tr>
<td>unc-4(e120)</td>
<td>promuje przekaźnictwo ACh</td>
<td>nieskoordynowany</td>
<td>zmniejszona szybkość paraliżu</td>
<td>nieodróżnialny od typu dzikiego</td>
</tr>
</tbody>
</table>
Dwa stymulanty neuronalne: inhibitor acetylocholinoesterazy, zwany aldikarbem, oraz antagonista receptorów GABA, zwany pentylenotetrazolem (PTZ), mogą być stosowane w sposób komplementarny do charakterystyki mutantów przekaźnictwa synaptycznego u C. elegans. Nadmiar pobudzającej acetylocholiny (ACh) gromadzi się w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs) ściany ciała nicieni w wyniku szkodliwych mutacji w negatywnych regulatorach przekaźnictwa ACh (np. tom-1 i unc-43) lub pozytywnych regulatorach hamującego przekaźnictwa GABA (np. unc-25). I odwrotnie, poziomy pobudzającej ACh w NMJs nicieni są obniżone w wyniku szkodliwych mutacji w pozytywnych regulatorach ogólnego przekaźnictwa synaptycznego (np. snb-1) lub w genach specyficznych dla przekaźnictwa ACh (np. unc-4). W porównaniu z nicieniami typu dzikiego N2, nicienie mutanty o zwiększonym pobudzającym przekaźnictwie ACh w NMJs wykazują przyspieszone tempo paraliżu indukowanego aldikarbem, natomiast nicienie mutanty o obniżonym pobudzającym przekaźnictwie ACh wykazują zmniejszone tempo paraliżu indukowanego aldikarbem. Chociaż PTZ zaburza synchronizację neuronalną w mięśniach ściany ciała C. elegans, podobnie jak aldikarb, PTZ znosi również działanie hamującego GABA w mięśniach głowy C. elegans. W rezultacie wrażliwość na aldikarb nie może precyzyjnie przewidzieć wrażliwości na PTZ. Nicienie mutanty ze specyficznymi defektami w negatywnej lub pozytywnej regulacji przekaźnictwa ACh są nieodróżnialne od nicieni typu dzikiego N2 w obecności PTZ, natomiast nicienie mutanty z defektami w pozytywnej regulacji ogólnego przekaźnictwa synaptycznego lub specyficznymi defektami w hamującym przekaźnictwie GABA wykazują silne konwulsje przedniej części ciała indukowane przez PTZ. Ponadto mutanty unc-43 z utratą funkcji wykazują konwulsje całego ciała w obecności PTZ i prawdopodobnie posiadają dodatkowe nieprawidłowości w przekaźnictwie synaptycznym, które przyczyniają się do ich unikalnych reakcji na leki.

<ol><li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li>
<li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet.%22%5BJournal%5D)">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li>
</ol>

Obecne protokoły ekspozycji na aldikarb z użyciem C. elegans nie pozwalają badaczom na odróżnienie mutantów ze specyficznymi deficytami w przekazywaniu ACh od mutantów z uogólnionymi deficytami w przekazywaniu synaptycznym, ponieważ obie klasy mutantów wykazują oporność na aldikarb. Podobnie, aldikarb nie może być wykorzystany do ustalenia, czy mutanty mają specyficzne deficyty w przekazywaniu GABA, czy uogólnione niepowodzenia w negatywnej regulacji przekazywania ACh, gdyż obie klasy mutantów wykazują nadwrażli...

<table><tbody><tr><td>Aldikarb</td><td>Odczynnik</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>PS734</td><td>Dostępny w sprzedaży w Sigma</td></tr><tr><td>Pentylenotetrazol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr></tbody></table>

paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej u c. elegans

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Nicień, Caenorhabditis elegans, stał się dogodnym modelem do badania neurotransmisji. C. elegans jest wyjątkowy wśród modeli zwierzęcych, ponieważ anatomia i połączenia jego układu nerwowego zostały określone na podstawie mikrografii elektronowych i doprecyzowane za pomocą testów farmakologicznych. W tym filmie opisujemy, w jaki sposób dwa komplementarne stymulanty neuronalne – inhibitor acetylocholinoesterazy o nazwie aldikarb oraz antagonista receptora kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) o nazwie pentylenotetrazol (PTZ) – mogą być wykorzystane do specyficznej charakterystyki sygnalizacji w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs) u C. elegans oraz do ułatwienia zrozumienia antagonistycznych obwodów neuronalnych.
Z 302 neuronów C. elegans, dziewiętnaście GABAergicznych motoneuronów typu D unerwia mięśnie ściany ciała (BWMs), natomiast cztery neurony GABAergiczne, nazywane RME, unerwiają mięśnie głowy. Z kolei trzydzieści dziewięć motoneuronów wykazuje ekspresję pobudzającego neuroprzekaźnika, acetylocholiny (ACh), i znosi działanie przekaźnictwa GABA w BWMs w celu koordynacji lokomocji. Antagonistyczny charakter motoneuronów GABAergicznych i cholinergicznych w NMJs ściany ciała został początkowo ustalony za pomocą ablacji laserowej, a później potwierdzony poprzez ekspozycję na aldikarb. Ostra ekspozycja na aldikarb prowadzi do paraliżu zależnego od czasu lub dawki u nicieni typu dzikiego. Jednak utrata pobudzającego przekaźnictwa ACh nadaje odporność na aldikarb, ponieważ w NMJs nicieni gromadzi się mniej ACh, co prowadzi do mniejszej stymulacji BWMs. Odporność na aldikarb może być obserwowana u mutantów specyficznych dla ACh lub z ogólnymi zaburzeniami funkcji synaptycznych. Zgodnie z antagonistycznym działaniem przekaźnictwa GABA i ACh, utrata przekaźnictwa GABA lub brak negatywnej regulacji uwalniania ACh nadaje nadwrażliwość na aldikarb. Choć ekspozycja na aldikarb doprowadziła do wyizolowania licznych homologów genów neuroprzekaźnictwa u nicieni, sama ekspozycja na aldikarb nie pozwala efektywnie określić dominujących ról genów i szlaków w konkretnych motoneuronach C. elegans. W tym celu wprowadziliśmy uzupełniające podejście eksperymentalne, które wykorzystuje PTZ.
Mutanty neurotransmiteryjne wykazują wyraźne fenotypy w odpowiedzi na PTZ, które różnią się od paraliżu indukowanego aldikarbem. Nicienie typu dzikiego, jak również mutanty z konkretnymi zaburzeniami uwalniania lub odbierania ACh, nie wykazują widocznej wrażliwości na PTZ. Jednak mutanty GABA, a także mutanty z ogólnymi zaburzeniami funkcji synaptycznych, wykazują drgawki przedniej części ciała w sposób zależny od czasu lub dawki. Mutanty, które nie potrafią negatywnie regulować ogólnego uwalniania neuroprzekaźników i w związku z tym wydzielają nadmierne ilości ACh do BWMs, ulegają paraliżowi pod wpływem PTZ. Fenotypy indukowane przez PTZ w poszczególnych klasach mutantów wskazują, że podejście komplementarne, łączące paradygmaty ekspozycji na aldikarb i PTZ u C. elegans, może przyspieszyć nasze zrozumienie neurotransmisji. Ponadto filmy demonstrujące sposób przeprowadzania testów farmakologicznych powinny pomóc w ustanowieniu spójnych metod badawczych dla C. elegans.

Niniejszy film demonstruje, w jaki sposób wykorzystać dwa stymulanty neuronalne, aldikarb i pentylenotetrazol (PTZ), w sposób komplementarny do badania funkcji synaptycznych u nicienia C. elegans. To komplementarne podejście może być również wykorzystane do wyjaśnienia ewolucyjnie konserwatywnych mechanizmów modulujących synchronizację neuronalną i ma znaczenie w badaniach nad epilepsją oraz napadami drgawkowymi.

Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej u C. elegans

Nicień Caenorhabditis elegans stał się wygodnym modelem do badania neurotransmisji. C. elegans jest wyjątkowy wśród modeli zwierzęcych, ponieważ...

Witajcie, jestem Cody Locke z Laboratorium Caldwell w Katedrze Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Alabama. Jestem Kyle Lee i pokażę wam, jak przygotować nicienie do testów ekspozycji na out-carb i PTZ. Jestem Bernard Tu i zaprezentuję wam sposób przeprowadzania testów out-carb.Nazywam się Kaylin Berry i odpowiadam za filmy dotyczące C. elegans. W tej prezentacji będę pełniła rolę narratora oraz zademonstruję test ekspozycji na PTZ. Dziś wraz z moimi współpracownikami pokażemy, jak charakteryzować mutanty transmisji synaptycznej w modelu epilepsji C. elegans po ekspozycji na PTZ i aldekarb, wykorzystując serię reprezentatywnych szczepów mutantów.Zacznijmy zatem. Kyle Lee rozpocznie dzisiejszą prezentację, pokazując przygotowanie testów ALD carb w pierwszym dniu procedury. Należy upewnić się, że na drugi dzień testów ALD carb dostępnych będzie co najmniej 30 nicieni w stadium młodych osobników dla każdego genotypu i każdej powtórki.Zaleca się, aby badacz przeniósł 50 lub więcej nicieni w czwartym stadium larwalnym (L4) na świeże płyty NGM wolne od fungicydów, wysiane bakteriami e coli OP 50 jako źródłem pożywienia. Nicienie należy hodować przez 12 do 24 godzin w stałej, dopuszczalnej temperaturze. Optymalny zakres to od 20°C do 22°C, choć temperatura 25°C jest również dopuszczalna.Drugiego dnia należy przygotować 100 mM roztwór zapasu Al Decarb oraz 70% etanol, a następnie rozprowadzić odpowiednią ilość Al Decarb na płytkach NGM. Stosujemy stale stężenie 0,5 mM Al Decarb, nakładając 37,5 µL roztworu 100 mM Al Decarb na 60 mm nieprzepuszczalne płytki Petri zawierające 7,5 mL podłoża NGM. Płytki z Al Decarb należy pozostawić do wyschnięcia na około 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej.Po wyschnięciu płytek nie ma potrzeby uchylania ich pokrywek. Nanieść jednakowe objętości e coli na środek każdej płytki alde carb i suszyć przez kolejne 30 do 60 minut. W temperaturze pokojowej zazwyczaj nanosimy 25 µL e coli OP 50.Taka objętość OP 50 tworzy odpowiednio rozległy trawnik pokarmowy, który utrzymuje nicienie w niewielkim obszarze w centrum płytki, zapobiegając ich nadmiernemu zagęszczeniu. Po wyschnięciu trawnika pokarmowego należy przystąpić do analiz albakarbowych. Ze względu na subiektywny charakter analiz ALD carb, wysoce zaleca się przeprowadzanie eksperymentów metodą ślepej próby.Aby to osiągnąć, współpracownik głównego eksperymentatora ponownie etykietuje oryginalne płytki zawierające nicienie przeznaczone do analizy lub przenosi nicienie z płytek oryginalnych na płytki z cyferaldekarbem bezpośrednio przed uruchomieniem stopera. Po wysianiu nicieni na płytki, ABO przystępuje do analizy; aby rozpocząć analizę, należy zliczyć liczbę sparaliżowanych nicieni.Istnieją dwa główne podejścia do definiowania paraliżu wywołanego gwałtowną dekarboksylacją al. Pierwsze z nich definiuje paraliż jako zaprzestanie pompowania gardzielowego. W niniejszej notatce wideo widoczna jest ciemna struktura, która znajduje się w świetle gardzieli nicienia po prawej stronie ekranu.Struktura ta jest nazywana młynkiem i kurczy się rytmicznie poprzez mechanizm cholinergiczny. Lokomocja nicienia w tym filmie została znacznie spowolniona w wyniku ekspozycji na Al Decarb. Mimo to młynka gardłowego tego nicienia wciąż wyraźnie się porusza.Zatem ten nicień nie jest sparaliżowany zgodnie z definicją ustania pompowania. W tym filmie powinno być widać, że żarnia gardzielowa znajdująca się po prawej stronie ekranu nie kurczy się, przyjmując ustanie pompowania jako roboczą definicję paraliżu wywołanego przez al Decarb. Ten nicień powinien zostać oceniony jako sparaliżowany.Jednakże, podobnie jak nicień w poprzednim filmie, ten osobnik wykazuje lekkie ruchy poszukiwawcze z boku na bok. Mimo że jego lokomocja została upośledzona przez Al Decarb, ruchy te uniemożliwiłyby eksperymentatorowi uznanie tego nicienia za sparaliżowanego zgodnie z drugą metodą definiowania paraliżu indukowanego przez Al Decarb, czyli całkowitego unieruchomienia ciała i braku reakcji na dotyk. Druga metoda definiowania paraliżu indukowanego przez Al Decarb polega na systematycznym dotykaniu każdego nicienia platynowym drutem i sprawdzaniu reakcji.Jeśli ruchy ciała nie są wykrywalne gołym okiem, naszą preferowaną metodą jest dotykanie nicieni dwa razy w głowę i dwa razy w ogon co 30 minut przez łącznie trzy godziny. Jak widać, nicień w tym filmie nie wykazuje wyraźnych ruchów ciała. Niemniej jednak, ponieważ nicień ten reaguje na dotykanie wyraźnym poruszaniem ogonem, nie uznajemy go za sparaliżowanego.Zgodnie z drugą definicją paraliżu wywołanego przez al decarb. Podobnie jak nicień w poprzednim filmie, ten osobnik nie porusza ciałem w sposób oczywisty i tym samym wymaga testu dotykowego. Jednak w przeciwieństwie do nicienia z poprzedniego filmu, ten osobnik nie reaguje wyraźnie na dotyk.W związku z tym robak ten jest sparaliżowany zgodnie z drugą definicją paraliżu wywołanego przez Al Decarb. Chociaż różnica między stanem sparaliżowanym a niesparaliżowanym przez Al Decarb może być subtelna, eksperymentatorzy powinni być w stanie zidentyfikować istotne zmiany w przekaźnictwie synaptycznym, obserwując po prostu dużą liczbę reprezentatywnych robaków wystawionych na działanie Al Decarb bezpośrednio po przeniesieniu na płytki z Al Decarb. Robaki typu dzikiego pozostają mobilne.W tym filmie można zobaczyć te same nicienie typu dzikiego z poprzedniego filmu po jednej godzinie ekspozycji na Al Decarb. Należy zauważyć, że ruchy nicieni uległy w pewnym stopniu spowolnieniu, jednak wciąż wyraźnie się poruszają.W przeciwieństwie do nicieni typu dzikiego, mutanty tomasin one w tym filmie są całkowicie unieruchomione lub ledwo się poruszają po godzinie ekspozycji. Wynik ten jest spójny z faktem, że mutanty tomasin one wykazują nadmierną sekrecję acetylocholiny z powodu niezdolności do negatywnej regulacji uwalniania neuroprzekaźnika w złączach nerwowo-mięśniowych; nadmiar acetylocholiny w szczelinach synaptycznych złącz nerwowo-mięśniowych w połączeniu z inhibicją degradacji acetylocholiny przez Bial Decarb sprawia, że mutanty tomasin one stają się nadwrażliwe. Choć nie pokazano tego tutaj, postulatedowano, że podobne wyniki występują w testach alde carb z allelami utraty funkcji genu on 43, który koduje ortolog C. elegans kinazy białkowej dwa zależnej od kalcyneuryny/kalmoduliny. Ten film przedstawia mutanty on 25, u których występuje deficyt hamującego przekaźnictwa GABAergicznego.Po jednej godzinie ekspozycji na al Decarb, podobnie jak mutanty tomasin one i M 43, mutanty te wykazują znaczne zaburzenia lokomocyjne wywołane przez al Decarb i wydają się być bardziej dotknięte niż robaki typu dzikiego przy ekspozycji na al Decarb przez taki sam czas. Wynik ten jest zgodny z hipotezą, że mutanty M 25 mają nadmiernie pobudzone mięśnie ściany ciała w wyniku połączenia ekspozycji na al Decarb i zredukowanej transmisji GABAergicznej, co prowadzi do zwiększenia stosunku transmisji pobudzającej do hamującej w złączach nerwowo-mięśniowych CL ELs i w konsekwencji do paraliżu. Niemniej jednak mutanty tomasin one on 43 oraz on 25 wykazują podobną wrażliwość na al Decarb w tym punkcie czasowym.Mimo różnych przyczyn nadmiernej stymulacji mięśni ściany ciała, badacz nie mógłby poznać mechanizmu leżącego u podstaw nadwrażliwości bez uprzedniej identyfikacji mutacji sprawczych. W tym filmie powróciliśmy do tych samych robaków typu dzikiego z poprzedniego materiału wideo po trzech godzinach ekspozycji na aldecarb; w tym końcowym punkcie naszego testu z aldecarb powinno być wyraźnie widać, że robaki te, mimo bycia typem dzikim, są albo całkowicie unieruchomione, albo poruszają się ledwie zauważalnie. Robaki te są obecnie fenotypowo podobne do mutantów TOM one i M 25 pokazanych w pierwszej godzinie po ekspozycji na aldecarb, prawdopodobnie dlatego, że pobudzające przekaźnictwo cholinergiczne osiągnęło porównywalne poziomy; w przeciwieństwie do nich, mutanty Synap Bren one pozostają znacznie bardziej mobilne po trzech godzinach ekspozycji na aldecarb.Wynik ten jest zgodny z obserwacją, że mutanty Synaptive Bren one, u których brakuje prawidłowego poziomu sekrecji neuroprzekaźników, wykazują słabszą stymulację cholinergicową mięśni ściany ciała niż nicienie typu dzikiego po narażeniu na identyczne stężenia alde carb w tym czasie. Mutanty Point on four, które charakteryzują się specyficznym deficytem przekaźnictwa cholinergicznego, powinny wykazywać podobną wrażliwość na Al Decarb jak mutanty Synaptive Bren one. Odwrotnie, mutanty nadwrażliwe Tomasin one i O 25 pozostają sparaliżowane, podobnie jak nicienie typu dzikiego.Warto zauważyć, że niektóre nicienie, zwłaszcza te oporne na Al Decarb, mogą próbować pełznąć poza płytkę. W takim przypadku badacz może nanieść odpowiednią ilość kwasu palmitynowego, który stanowi fizyczną barierę dla ruchu nicieni. Wokół płytek Al Decarb naniesiono 25 µL kwasu palmitynowego w stężeniu 10 mg/mL w etanolu.To kończy schemat narażenia na Al Decarb. Teraz zaprezentuję schemat narażenia na Penta Lean Terazol. Kaylin Berry pomoże nam w przeprowadzaniu testów PTZ.Przygotowanie nicieni do testów PTZ jest w zasadzie takie samo, jak przygotowanie nicieni do testów alde carb. Jedynymi istotnymi różnicami między tymi dwoma testami są następujące kwestie: jako rozpuszczalnik PTZ stosujemy DDH₂O zamiast 70% etanolu.Ponadto, ponieważ często nakładamy na płytki większe objętości PTZ niż aldehyd karbamianu, pozostawiamy płytki do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę przed dodaniem OP 50. Do PTZ można również stosować kwas palmitynowy. Należy także zauważyć, że PTZ jest znacznie mniej stabilny niż aldehyd karbamianu i musi być przechowywany w temperaturze -20 °C.Aby rozpocząć analizę, należy liczyć liczbę robaków wykazujących drgawki świetlne co 30 minut przez łącznie jedną godzinę. Zaleca się klasyfikowanie liczby robaków z różnymi typami drgawek w oddzielnych kategoriach, takich jak drgawki całego ciała, drgawki przedniej części ciała, które nazywamy „head bobs”, połączenie drgawek przednich z paraliżem mięśni ściany ciała, które nazywamy drgawkami toniczno-klonicznymi, lub całkowitym paraliżem ciała, który nazywamy stanem tonicznym. Aktywność przypominająca napady, widoczna u robaka po prawej stronie, często następuje po drgawkach toniczno-klonicznych, widocznych u robaka po lewej stronie.Aktywność przypominająca napady drgawkowe może wynikać po prostu ze zmęczenia mięśni po powtarzających się konwulsjach toniczno-klonicznych. Jednak nasze niepublikowane dane wskazują, że niektóre nicienie mogą przejść w stan toniczny pod wpływem PTZ w sposób podobny do paraliżu wywołanego przez al decarb, bez uprzedniego wystąpienia drgawek toniczno-klonicznych. Przedstawiamy tutaj reprezentatywnego nicienia z mutacją transmisji synaptycznej, który pełza w obecności PTZ – antagonisty receptorów GABA i powszechnego induktora napadów w różnych modelach zwierzęcych napadów drgawkowych i epilepsji.Należy zauważyć, że podczas żerowania koniec lub przód ciała nicienia porusza się na boki. W tym filmie przedstawiamy innego nicienia z tej samej szczepu mutantów transmisji synaptycznej, który był wykorzystany w poprzednim materiale. Zwróćmy uwagę, że ten nicień, znajdujący się w obecności 2,5 mg PTZ na ml wody, w większości nadal porusza głową na boki podczas żerowania.Niemniej jednak nicień ten sporadycznie przerywa żerowanie z boku na bok i zamiast tego wielokrotnie wypycha przedni koniec ciała do przodu. Na koniec należy zaobserwować nicienia posiadającego tę samą mutację co nicienie w dwóch poprzednich filmach, w obecności 10 mg PTZ na ml wody. Zauważmy, że nicień ten wykazuje zmniejszone żerowanie z boku na bok i wypycha przedni koniec ciała do przodu z większą częstotliwością i intensywnością niż przy niższym stężeniu PTZ.Wyniki te wykazują zależność dawka-odpowiedź w przypadku PTZ, co obserwujemy u wszystkich mutantów przekaźnictwa synaptycznego wrażliwych na PTZ. Co istotne, ekspozycja na PTZ nie jest wystarczająca do wywołania napadów przypominających epilepsję u nicieni typu dzikiego. Analogicznie, próbowano wywołać napady przypominające epilepsję za pomocą PTZ u nicieni z konkretnymi deficytami przekaźnictwa cholergicznego, takimi jak on four, lub u nicieni z nadmiernym przekaźnictwem cholergicznym, takich jak tomasin one, lecz nie zaobserwowano takiego efektu.Zatem możliwe powinno być dalsze różnicowanie mutantów transmisji synaptycznej z opornością na aldekarb, oddzielając ogólne deficyty funkcji synaptycznej od specyficznych deficytów transmisji cholinergicznej na podstawie ich względłej wrażliwości na PTZ. Być może zaskakujące jest to, że mutant ONC 25 o silnie zredukowanej funkcji, u którego nie stwierdzono ekspresji GABA w hamujących neuronach ruchowych C. elegans, nie wykazuje spontanicznych epileptycznych drgawek, co widać na tym filmie.Mutant ONC 25 w 10 mg PTZ na ml wody wykazuje silne drgawki toniczno-kloniczne, choć nie pokazano tutaj, że drgawkom toniczno-klonicznym związanym z ONC 25 poprzedzały jedynie drgawki z pewnym ruchem, które naśladowały drgawki mutantów synap Bren one. Zatem eksperymentator nie powinien zakładać, że wszystkie mutanty hamującego układu GABA będą wykazywać drgawki toniczno-kloniczne lub ściśle powiązaną aktywność przypominającą napady toniczne w obecności PTZ, szczególnie biorąc pod uwagę prawdopodobieństwo uzyskania hipomorficznych alleli mutantów.Po wykazaniu nadwrażliwości na aldecarb i PTZ u mutantów z zaburzoną inhibicją GABA, a jedynie nadwrażliwości na aldecarb i normalnej wrażliwości na PTZ u mutantów pozbawionych negatywnej regulacji przekaźnictwa cholergicznego, można by się zastanowić, jak reagują na PTZ mutanty z utratą funkcji UNC-43, skoro są one również nadwrażliwe na aldecarb, podobnie jak nasze pozostałe mutanty przekaźnictwa synaptycznego. Mutanty UNC-43 nie wykazują oczywistych konwulsji o charakterze epileptycznym w przypadku braku PTZ, choć u tych mutantów występują rzadkie, nierepetytywne, lecz wciąż spontaniczne skurcze całego ciała. Jednak po ekspozycji na 10 mg PTZ na ml wody, mutanty z utratą funkcji UNC-43 wykazują silne, repetytywne i zależne od dawki konwulsje całego ciała. Na tym etapie wyniki te są niejednoznaczne, lecz wydają się wskazywać, że UNC-43 nie musi pełnić specyficznej roli w inhibicyjnym przekaźnictwie GABAergicznym ani roli wyłącznie w negatywnej regulacji uwalniania neurotransmitera.W układzie nerwowym C. elegans zaprezentowaliśmy właśnie sposób charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej C. elegans przy użyciu komplementarnych stymulantów neuronalnych: aldekarbu, inhibitora cholinesterazy, oraz PTZ, antagonisty receptorów GABA. Stosując komplementarny paradygmat farmakologiczny, należy pamiętać, że stopień wrażliwości na jeden stymulant neuronalny nie pozwala przewidzieć stopnia wrażliwości na drugi stymulant neuronalny. Wykorzystanie testów z aldekarbem powinno pomóc w odróżnieniu mutantów inhibitornych GABA, które wykazują ruchy głową (head bobbing) pod wpływem PTZ, ale są nadwrażliwe na aldekarb, od mutantów z ogólnym deficytem funkcji synaptycznych, które również wykazują ruchy głową pod wpływem PTZ, lecz są oporne na aldekarb. Ponadto należy mieć na uwadze, że mutanty inhibitorne GABA wykazują ruchy głową pod wpływem PTZ, podczas gdy nicienie pozbawione ujemnej regulacji transmisji cholinergicznej pod wpływem PTZ wykazują fenotyp typu dzikiego.Zatem test z użyciem PTZ może zostać również wykorzystany do rozróżnienia tych klas mutantów transmisji synaptycznej, z których oba wykazują nadwrażliwość na Alde carb. Podsumowując, uzupełniające podejście z wykorzystaniem testów PTZ i Alde carb powinno pozwolić badaczowi na charakterystykę mutantów transmisji synaptycznej C. elegans w sposób, który jest niemożliwy do osiągnięcia przy użyciu każdego z tych leków z osobna. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w badaniach.

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej C. elegans

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Neureksyny i neuroliginy są białkami adhezyjnymi błony neuronów, które pełnią kluczowe role w różnicowaniu i transmisji synaptycznej. Mutanty C. elegans z niedoborem neuroliginy wykazują defekt w wykrywaniu siły osmotycznej, jednak gdy posiadają one również mutację w genie kodującym neureksynę, odzyskują fenotyp typu dzikiego.

Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Podczas gdy karmienie dsRNA u C. elegans jest potężnym narzędziem do oceny funkcji genów, obecne protokoły dla dużych ekranów żywieniowych skutkują zmienną skutecznością eliminacji. Opisujemy ulepszony protokół wykonywania badań przesiewowych karmienia RNAi na dużą skalę, który skutkuje wysoce skutecznym i powtarzalnym obniżeniem ekspresji genów.

Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

Przedstawiono podejścia do testowania działania leków przeciwpsychotycznych (APD) w Caenorhabditis elegans. Opisano testy do testowania wpływu leku na rozwój i żywotność oraz na szybkość pompowania gardła. Metody te mają również zastosowanie w eksperymentach farmakogenetycznych z klasami leków innymi niż APD.

Metody badania mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych w Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Ten artykuł przedstawia metodę testowania połączeń monosynaptycznych między neuronami za pomocą tetrodotoksyny i kanału sodowego opornego na tetrodotoksynę, NaChBac.

Badanie połączeń monosynaptycznych u Drosophila przy użyciu kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę

Paraliż wywołany pływaniem (SWIP) jest dobrze znanym testem behawioralnym używanym do badania mechanizmów leżących u podstaw sygnalizacji dopaminowej u Caenorhabditis elegans (C. elegans). Brakuje jednak szczegółowej metody przeprowadzenia testu. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół SWIP.

Paraliż wywołany pływaniem w celu oceny sygnalizacji dopaminy w Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje test określający odpowiedź na lewamizol, farmakologicznego agonistę jednej klasy receptorów acetylocholiny Caenorhabditis elegans. W tym płynnym teście pływania z lewamizolem naukowcy wizualnie obserwują i określają ilościowo zależny od czasu paraliż zwierząt hodowanych na 24-dołkowych płytkach.

Pomiar wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny

Poznaj metody farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej C. elegans przy użyciu aldicarbu i PTZ. Technika ta pozwala badać mechanizmy synchronizacji neuronowej z zastosowaniem w epilepsji.

Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów