Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej C. elegans

Cześć, nazywam się Cody Locke i pracuję w Laboratorium Caldwella na Wydziale Nauk Biologicznych Uniwersytetu w Alabamie. Nazywam się Kyle Lee i pokażę ci, jak przygotować robaki do testów ekspozycji na węglowodany i PTZ. Nazywam się Bernard Tu i pokażę ci, jak wykonywać testy węglowodanów.

Nazywam się Kaylin Berry i jestem odpowiedzialna za filmy o morskiej elegancji. W tej prezentacji będę narratorem tej prezentacji i zademonstruję test ekspozycji na PTZ. Dzisiaj ja i moi koledzy pokażemy, jak scharakteryzować mutanty transmisji synaptycznej za pomocą modelu epilepsji morskiej elegancji po ekspozycji na PTZ i Alde carb z serią reprezentatywnych zmutowanych szczepów.

Więc zacznijmy. Kyle Lee rozpocznie nas dzisiaj od pokazania przygotowania testów węglowodanowych ALD w pierwszym dniu zabiegu. Upewnij się, że co najmniej 30 młodych dorosłych robaków o każdym genotypie i każdej kontrpróbie będzie dostępnych do testów na obecność węglowodanów ALD w drugim dniu.

Najlepiej, jeśli eksperymentator wybierze 50 lub więcej czteroetapowych robaków L na świeżych, wolnych od fungicydów płytkach NGM osadzonych z E coli OP 50 jako źródłem pożywienia. Hoduj robaki przez 12 do 24 godzin w stałej i dopuszczalnej temperaturze. Najlepsze jest od 20 stopni Celsjusza do 22 stopni Celsjusza, chociaż dopuszczalne jest 25 stopni Celsjusza.

Drugiego dnia przygotuj 100-milimolowy roztwór podstawowy Al Decarb i 70% etanolu, rozprowadź odpowiednią ilość Al Decarb na płytkach NGM. Konsekwentnie używamy 0,5 milimolowego al Decarb, posiewając 37,5 mikrolitrów 100-milimolowego węglowodanu alde na 60-milimetrowych, niewentylowanych płytkach Petriego o masie 7,5 mililitra w gm. Pozostaw płytki węglowodanowe alde do wyschnięcia na około 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej.

Nie ma potrzeby pękania pokrywek po wyschnięciu płytek. Dodaj stałe objętości E coli na środek każdej płytki węglowodanowej alde i susz przez kolejne 30 do 60 minut. W temperaturze pokojowej zazwyczaj dodajemy 25 mikrolitrów E coli OP 50.

Ta objętość OP 50 tworzy wystarczająco duży trawnik spożywczy, aby utrzymać robaki w małym miejscu na środku talerza bez nadmiernego zatłoczenia. Gdy trawnik spożywczy wyschnie, przystąp do testów na obecność węglowodanów alba. Ze względu na subiektywny charakter testów węglowodanów ALD zdecydowanie zaleca się przeprowadzanie eksperymentów na ślepo.

Aby to zrobić. Kolega głównego eksperymentatora ponownie oznaczył oryginalne płytki zawierające robaki, które miały być testowane, lub kolega mógł przenieść robaki z oryginalnych płytek na płytki z karbem szyfrującym alde bezpośrednio przed uruchomieniem timera. Teraz, gdy płytki zostały obsiane borem, ABO przystąpi do analizy, aby rozpocząć analizę, policz liczbę sparaliżowanych robaków.

Istnieją dwa główne podejścia do definiowania ostrego paraliżu wywołanego al dekarbem. Pierwsze podejście definiuje paraliż poprzez zaprzestanie pompowania gardła. W tej notatce wideo ciemna struktura, która znajduje się w świetle gardła robaka po prawej stronie ekranu.

Ta struktura nazywana jest młynkiem i kurczy się rytmicznie poprzez mechanizm cholinergiczny. Poruszanie się robaka na tym filmie zostało znacznie spowolnione w wyniku ekspozycji na Al Decarb. A jednak młynek gardłowy tego robaka ciągle wyraźnie się porusza.

Dlatego robak ten nie jest sparaliżowany przez zaprzestanie definicji pompowania. Na tym filmie należy zobaczyć, że młynek gardłowy znajdujący się po prawej stronie ekranu nie kurczy się wraz z zaprzestaniem pompowania, jak robocza definicja paraliżu wywołanego przez al Decarb. Ten robak powinien być oceniany jako sparaliżowany.

Jednak, podobnie jak robak z poprzedniego filmu, ten robak wykazuje lekkie ruchy żerowania na boki. Pomimo tego, że jego lokomocja jest upośledzona przez Al Decarb, ruchy te uniemożliwiłyby eksperymentatorowi uznanie tego robaka za sparaliżowanego przez drugie podejście do definiowania paraliżu wywołanego przez al Decarb, bezruch całego ciała i brak reakcji na dotyk. Drugie podejście do definiowania paraliżu wywołanego al dekarbem polega na konsekwentnym szturchaniu każdego robaka platynowym drutem i sprawdzaniu odpowiedzi.

Jeśli ruchy ciała nie mogą być wykryte gołym okiem, naszym preferowanym podejściem jest szturchanie naszych robaków dwa razy w głowę i dwa razy w ogon co 30 minut, w sumie przez trzy godziny. Jak powinieneś zauważyć, robak na tym filmie w oczywisty sposób nie porusza swoim ciałem. Niemniej jednak, ponieważ robak ten reaguje na szturchanie wyraźnym poruszaniem ogonem, nie nazywamy go sparaliżowanym.

Zgodnie z drugą definicją paraliżu wywołanego al dekarbonem. Podobnie jak robak z poprzedniego filmu, ten robak w oczywisty sposób nie porusza swoim ciałem i dlatego wymaga testu szturchania. Jednak w przeciwieństwie do robaka z poprzedniego filmu, ten robak nie reaguje wyraźnie na szturchanie.

Dlatego robak ten jest sparaliżowany przez drugą definicję paraliżu indukowanego al dekarbonem. Chociaż różnica między sparaliżowanym a niesparaliżowanym przez alde carb może być subtelna, eksperymentatorzy powinni być w stanie zidentyfikować znaczne zmiany i transmisję synaptyczną, po prostu obserwując dużą liczbę reprezentatywnych robaków wystawionych na działanie Al Decarb natychmiast po wybraniu na płytki Al Decarb. Robaki typu dzikiego są nadal mobilne.

W tym filmie. Zobaczymy te same dzikie robaki z poprzedniego filmu po godzinie ekspozycji na Al Decarb. Zauważ, że robaki zwalniają do pewnego stopnia, ale nadal wyraźnie się poruszają.

W przeciwieństwie do robaków typu dzikiego, mutanty Tomasin one w tym filmie są albo całkowicie unieruchomione, albo ledwo się poruszają po godzinie ekspozycji. Wynik ten jest zgodny z mutantami tomasyny one, które mają nadmierne wydzielanie acetylocholiny z powodu niezdolności do negatywnego regulowania uwalniania neuroprzekaźników w połączeniach nerwowo-mięśniowych, nadmiar acetylocholiny i szczeliny synaptyczne w połączeniach nerwowo-mięśniowych w połączeniu z hamowaniem degradacji acetylocholiny, Bial Decarb sprawia, że mutanty tomasin one są nadwrażliwe, chociaż nie wykazano tutaj, postuluje się, że podobne wyniki wynikają z testów ALDE carb z utratą funkcji alleli ON 43, który koduje C elegancję ortolog kinazy białkowej zależnej od wapnia cal Moulin dwa. Ten film pokazuje 25 mutantów, które mają niedobór hamującej transmisji GABA-ergicznej.

Po jednej godzinie ekspozycji na alde carb, podobny do mutantów tomasin one i M 43, mutanty te wykazują znaczne upośledzenie lokomotoryczne wywołane węglowodanami alde i wydają się być bardziej dotknięte niż robaki typu dzikiego z ekspozycją na al Decarb przez identyczny czas. Wynik ten jest zgodny z mutantami M 25, które mają nadmiernie stymulowane mięśnie ściany ciała w wyniku połączenia ekspozycji na al Decarb i zmniejszonej transmisji GABA-ergicznej, co prowadzi do większego stosunku transmisji pobudzającej do hamującej w CL, EL, połączeniach nerwowo-mięśniowych i późniejszym paraliżu. Jednak dlatego, że tomasyna jeden na 43 i na 25 mutanty wykazują podobną wrażliwość na Al Decarb w tym momencie.

Pomimo istnienia różnych przyczyn nadmiernej stymulacji mięśni ściany ciała, eksperymentator nie mógł poznać mechanizmu leżącego u podstaw nadwrażliwości bez uprzedniego poznania tożsamości mutacji sprawczych. W tym filmie powróciliśmy do tych samych robaków typu dzikiego z wcześniejszego filmu po trzech godzinach ekspozycji na al Decarb w tym końcowym punkcie naszego testu węglowodanów ALD, powinno wyraźnie zobaczyć, że te robaki, mimo że są typu dzikiego, są albo w pełni unieruchomione, albo ledwo się poruszają. Robaki te są teraz fenotypowo podobne do mutantów TOM one i M 25 pokazanych po jednej godzinie od ekspozycji na alde carb, prawdopodobnie dlatego, że pobudzająca transmisja cholinergiczna osiągnęła porównywalne poziomy w przeciwieństwie do robaków typu dzikiego, mutanty Synap Bren one pozostają znacznie mobilne po trzech godzinach ekspozycji na alde carb.

Wynik ten jest zgodny z mutantami Synaptive Bren one, które nie mają normalnego poziomu wydzielania neuroprzekaźników, mając mniejszą stymulację cholinergiczną mięśni ściany ciała niż robaki leśne typu dzikiego, które w tym czasie mają identyczne poziomy ekspozycji na węglowodany alde. Punkt na czterech mutantach, które są specyficznie wadliwe w transmisji cholinergicznej, powinien mieć podobną wrażliwość na Al Decarb jak mutanty Synaptive Bren one. I odwrotnie, nadwrażliwe mutanty Tomasin One i O 25 pozostają sparaliżowane, podobnie jak robaki typu dzikiego.

Warto zauważyć, że niektóre robaki, zwłaszcza te, które są odporne na Al Decarb, mogą próbować wypełznąć z talerza. W takim przypadku eksperymentator może rozprowadzić stałą ilość kwasu palmitynowego, fizycznej bariery dla poruszania się robaków. Wokół płytek Al Decarb rozprowadzamy 25 mikrolitrów 10 miligramów kwasu palmitynowego na mililitr etanolu.

To uzupełnia paradygmat ekspozycji Al Decarb. Teraz zademonstruję paradygmat ekspozycji Penta Lean Terazol. Kaylin Berry będzie nam pomagać w testach PTZ.

Przygotowanie robaków do testów PTZ jest zasadniczo takie samo, jak przygotowanie robaków do testów alde carb. Jedyne znaczące różnice między tymi dwoma testami są następujące. Jako rozpuszczalnik PTZ używamy DDH dwa O, zamiast 70% etanolu.

Ponadto, ponieważ często nakładamy większe ilości PTZ niż węglowodan ALDE, pozostawiamy płytki do wyschnięcia na co najmniej godzinę przed dodaniem OP 50. Kwas palmitynowy może być również stosowany z PTZ. Należy również zauważyć, że PTZ jest znacznie mniej stabilny niż alde carb i musi być przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Aby rozpocząć analizę, policz liczbę epileptycznych robaków konwulsyjnych co 30 minut, w sumie przez godzinę. Najlepiej jest ocenić liczbę robaków z różnymi typami drgawek w oddzielnych kategoriach, takich jak drgawki całego ciała, drgawki przednie, które nazywamy połączeniem drgawek przednich z paraliżem mięśni ściany ciała, co nazywamy paraliżem toniczno-klonicznym lub paraliżem całego ciała, który nazywamy tonicznym tonikiem. Aktywność podobna do napadu, obserwowana u robaka po prawej stronie, często następuje po drgawkach toniczno-klonicznych, jak widać u robaka po lewej stronie toniku.

Aktywność podobna do napadu może po prostu wynikać ze zmęczenia mięśni po powtarzających się drgawkach toniczno-klonicznych. Jednak nasze niepublikowane dane wskazują, że niektóre robaki mogą stać się toniczne na PTZ w sposób podobny do paraliżu wywołanego al dekarbonem, bez wcześniejszego toniczno-klonicznego zapłonu. Tutaj pokazujemy reprezentatywnego zmutowanego robaka z transmisją synaptyczną pełzającego pod nieobecność antagonisty receptora GABA PTZA i powszechnego induktora napadów w różnych zwierzęcych modelach napadów i padaczki.

Zwróć uwagę, że czubek lub nos robaka kołysze się z boku na bok podczas żerowania. W tym filmie pokazujemy innego robaka z tego samego zmutowanego szczepu transmisji synaptycznej, który został użyty w poprzednim filmie. Zauważ, że ten robak, który znajduje się w obecności 2,5 miligrama PTZ na mililitr wody, w większości nadal porusza głową z boku na bok podczas żerowania.

Jednak robak ten od czasu do czasu przestaje żerować z boku na bok i zamiast tego powtarzalnie popycha przód do przodu. Na koniec należy zobaczyć robaka, który ma tę samą mutację, co robaki w poprzednich dwóch filmach, w obecności 10 miligramów PTZ na mililitr wody. Zauważ, że robak ten zmniejszył żerowanie na boki i wypycha swój przód do przodu z większą częstotliwością i intensywnością niż przy niższym stężeniu PTZ.

Wyniki te wskazują na zależność PTZ od dawki, którą obserwujemy u wszystkich mutantów transmisji synaptycznej wrażliwych na PTZ. Co ważne, narażenie na PTZ nie jest wystarczające do wywołania drgawek podobnych do napadów padaczkowych u robaków typu dzikiego. Podobnie, próbowaliśmy, ale nie zaobserwowaliśmy, że drgawki podobne do padaczkowych wywołanych PTZ u robaków ze specyficznymi deficytami w transmisji cholinergicznej, takich jak na czterech, lub robaków z nadmierną transmisją cholinergiczną, takich jak tomasyna jeden.

W związku z tym powinno być możliwe dalsze scharakteryzowanie mutantów transmisji synaptycznej z opornością na węglowodany alde z powodu deficytów w ogólnej funkcji synaptycznej lub specyficznych deficytów w transmisji cholinergicznej w oparciu o ich względną wrażliwość na PTZ. Być może zaskakujące jest silne obniżenie funkcji mutanta ONC 25, któremu brakuje wykrywalnej ekspresji GABA w elegancji C. Hamujące neurony ruchowe nie wykazują spontanicznych lekkich drgawek padaczkowych, jak widać na tym filmie.

Mutant ONC 25 na 10 miligramów PTZ na mililitr wody. Wykazuje jednak silne drgawki toniczno-kloniczne, choć nie wykazano ich tylko drgawki przednie z pewnym ruchem poprzedzały drgawki toniczno-kloniczne związane z ONC 25 i naśladowały drgawki mutantów synap Bren one. Dlatego eksperymentator nie powinien zakładać, że wszystkie hamujące mutanty GABA będą wykazywać drgawki toniczno-kloniczne lub ściśle związaną aktywność podobną do napadów tonicznych w obecności PTZ, zwłaszcza biorąc pod uwagę prawdopodobieństwo uzyskania hipomorficznych zmutowanych alleli

Teraz, gdy wykazaliśmy nadwrażliwość na alde carb i PTZ przez hamujące mutanty GABA, ale tylko nadwrażliwość na alde carb i normalną wrażliwość na PTZ przez mutanty bez negatywnej regulacji transmisji cholinergicznej. Można się zastanawiać, jak wyglądają mutanty utraty funkcji UNC 43 na PTZ, ponieważ są również nadwrażliwe na węglowodan Alda, podobnie jak nasze inne mutanty transmisji synaptycznej na mutantach 43, które nie wykazują oczywistych drgawek padaczkowych pod nieobecność PTZ, chociaż te mutanty mają rzadkie, niepowtarzające się, ale nadal spontaniczne skurcze całego ciała po ekspozycji na 10 miligramów PTZ na mililitr wody na 43, Utrata funkcji mutanty obecne, silne, powtarzalne i zależne od dawki drgawki całego ciała. W tej chwili wyniki te są niejednoznaczne, ale wydają się wskazywać, że ON 43 nie może odgrywać określonej roli w hamowaniu transmisji GABA-ergicznej lub roli tylko w negatywnej regulacji uwalniania neuroprzekaźników.

W układzie nerwowym C elegancji właśnie pokazaliśmy, jak scharakteryzować mutanty transmisji synaptycznej CL elgana za pomocą uzupełniających stymulantów neuronalnych, alde carb, inhibitora cholinoesterazy i antagonisty receptora GABA PTZA. Stosując którykolwiek z uzupełniających paradygmatów farmakologicznych, należy pamiętać, że stopień wrażliwości na jeden stymulant neuronalny nie może przewidzieć stopnia wrażliwości na drugi stymulant neuronalny Wykorzystanie testów alde carb powinno pomóc w odróżnieniu hamujących mutantów GABA, które kierują Bobem na PTZ, ale są nadwrażliwe na węglowodan Alde od ogólnych mutantów z niedoborem funkcji synaptycznej, które również kierują Bobem na PTZ, ale są odporne na węglowodany Alde. Ponadto należy zdać sobie sprawę, że hamujące mutanty GABA kierują Bobem na PTZ, podczas gdy robaki, które nie mają negatywnej regulacji transmisji cholinergicznej, wydają się dzikie na PTZ.

Dlatego test PTZ może być również wykorzystany do rozróżnienia tych klas mutantów transmisji synaptycznej, które są nadwrażliwe na węglowodan Alde. Podsumowując, komplementarne podejście z testami węglowodanów PTZ i Alde powinno pozwolić eksperymentatorowi scharakteryzować mutanty transmisji synaptycznej C w sposób, który jest niemożliwy w przypadku każdego z tych leków osobno. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.