Badania przesiewowe w kierunku agregacji amyloidu za pomocą elektroforezy żelu z półdenaturacją detergentu i agarozy
16 lipca 2008
SDD-AGE jest użyteczną techniką do wykrywania i charakteryzowania polimerów podobnych do amyloidu w komórkach. Tutaj pokazujemy adaptację, która sprawia, że ta technika jest podatna na zastosowania na dużą skalę.
Cześć, nazywam się Randall Hoffman i jestem doktorantem w Susan Linus Laboratory na wydziale biologii na MIT. Dzisiaj przedstawię Wam półdenaturujący detergent agro rose, elektroforezę żelową, czyli wiek SDD. Nasze laboratorium wykorzystuje tę technikę do badań przesiewowych pod kątem prionów i innych białek alogennych.
Nasza wersja wieku SDD jest prosta i niezawodna i może być skalowana w celu uwzględnienia dowolnej liczby próbek. Amyloidy są wyjątkowo odporne na denaturację przez SDS, co pozwala na ich oddzielenie od innych białek za pomocą SDDH. Jednak dane z SDDH same w sobie nie mogą być wykorzystane do potwierdzenia, że coś jest amyloidem.
Aby to zrobić, musisz użyć innych technik. Mając to na uwadze, pozwólcie, że wam pokażę. S-D-D-H-S-D-D-H można wykonać przy użyciu standardowego sprzętu do poziomej elektroforezy DNA.
Najpierw musisz zmontować tackę do odlewania żelu. Wielkość aparatu będzie zależała od liczby posiadanych próbek. W przypadku dużej liczby próbek używamy płyty o wymiarach 20 na 24 centymetry i do czterech grzebieni 50-studziennych.
Do przygotowania żelu potrzebny jest żel o średniej lub wysokiej mocy i niskiej gęstości, agros EEO, jeden bufor XTAE i 10% roztwór podstawowy SDS Make a 1,5% roztwór AROS i jeden XTAE. Będziesz chciał, aby żel był tak gęsty, jak to możliwe, aby można było załadować jak najwięcej próbki i zmaksymalizować wykrywanie. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż aros całkowicie się rozpuści.
Szybko dodaj 100 bulionów XSDS do 0,1% i zamieszaj, aby wymieszać. Jeśli na tym etapie trochę agro zestali się, czerwone, rozpuść je na gorącej płycie. Uważaj, aby się nie zagotował.
Po dodaniu SDS, ponieważ roztwór będzie łatwo bulgotał, wlej ten roztwór do tacki odlewniczej, gdy jest jeszcze gorący. Następnie użyj grzebienia, aby pozbyć się wszelkich pęcherzyków, które mogą przeszkadzać później podczas przenoszenia żelu. Po całkowitym schłodzeniu i zestaleniu się żelu ostrożnie wyjmij grzebienie i umieść żel w zbiorniku.
Całkowicie zanurz żel w jednym XTAE z 0,1% SDS. Jesteś teraz gotowy do załadowania swoich próbek. Próbki białek używane w SDDH są przygotowywane tak samo jak na stronie SDS z dwoma ważnymi wyjątkami.
Po pierwsze, należy unikać podgrzewania próbek, które mogłoby zdenaturować agregaty do monomerów białkowych. Po drugie, uważaj, aby uniknąć degradacji białka. Ponieważ zastosowane tutaj warunki denaturacji nie są wystarczające do dezaktywacji wszystkich proteaz, zalecamy użycie co najmniej dwukrotnie większego stężenia niż zalecane w przypadku kompletnego koktajlu inhibitorów proteazy.
W tej demonstracji użyjemy lizatów z komórek drożdży, które mają nadmierną ekspresję określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zazwyczaj używamy dwóch mil na noc. Kultury wyhodowane w 96, studzienkach dostępnych w firmie VWR, ale podczas analizy białek o niskiej liczebności należy użyć większych objętości kultur.
Zebrać komórki przez odwirowanie kultury w temperaturze 2000 RCF przez pięć minut w temperaturze pokojowej po odwirowaniu, usunąć nadnatant i umyć komórki za pomocą Resus, zawiesić w wodzie i ponownie odwirować po drugim wirowaniu, usunąć supernatant i żywicę komórki w zapasowym roztworze galwanicznym. Zy w roztworze trawi ściany komórkowe, co pozwoli ci skutecznie ułożyć komórki i niewielką objętość buforu do lizy. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.
Granuluj zapasowe plastikowe ogniwa, tym razem w temperaturze 800 RCF przez pięć minut. Całkowicie usuń sat i ponownie zawieś każdą granulkę i 100 mikrolitrów buforu do lizy. Następnie przykryj blok taśmą i wiruj na wysokich obrotach przez dwie minuty.
Pomaga to wszystkim kulistym tworzywom sztucznym w usuwaniu zanieczyszczeń komórkowych przy 4 000 RCF. Przez dwie minuty. Ostrożnie przenieść S natin na 96-dołkową płytkę PCR.
Zazwyczaj w naszym laboratorium analizujemy setki próbek jednocześnie, więc pomaga nam w tym system obsługi cieczy. W razie potrzeby należy określić stężenie białka w lizatach. Następnie dodaj cztery x bufor próbki do próbek, aby wytworzyć lizaty zawierające jeden x bufor do próbek, inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Teraz załaduj próbki do żelu. W razie potrzeby zachowaj połowę próbek do analizy strony SDS. Załaduj również markery masy cząsteczkowej, w tym markery wstępnie barwione i marker o bardzo wysokiej masie cząsteczkowej, taki jak ekstrakt z kurczaka.
W razie potrzeby ważne jest, aby żel był chłodny, aby zapobiec dyfuzji białek o niskiej masie cząsteczkowej, dlatego warto uruchomić go w chłodni. Uruchom żel przy niskim napięciu mniejszym niż trzy wolty na centymetr długości żelu. Uruchom żel na kilka godzin, aż diare osiągnie około jednego centymetra od końca żelu.
Ponieważ amyloid nie ulega denaturacji przez 2%SDS w temperaturze pokojowej, pozostanie nienaruszony, podczas gdy inne kompleksy, w tym większość agregatów nieamyloidowych, dysocjują w obecności 2% SDS. W ten sposób większość białek będzie monomeryczna i szybko przejdzie przez żel. Podczas gdy oporne na SDS amyloidy o dużej masie cząsteczkowej będą migrować wolniej.
Po tym żel będzie gotowy do przeniesienia. Chociaż można zastosować wiele metod transferu, najlepsze efekty uzyskujemy stosując transfer kapilarny. Ponieważ transfer kapilarny może pomieścić dowolny rozmiar żelu, praktyczna jest analiza setek próbek w transferze kapilarnym.
Stos suchych bibułek działa w celu wciągnięcia buforu przez żel, osadzając białka na membranie nitrocelulozowej umieszczonej między bibułkami a żelem. Będziesz musiał wyciąć kawałek nitrocelulozy, taki jak C o wysokim spoiwie, dodatkowo do tych samych wymiarów co żel. Będziesz także musiał pociąć 20 kawałków bibuły GBO o cztery i osiem kawałków bibuły GBO oh dwa do tego samego rozmiaru co żel.
GB oh four jest bardzo gęsty i chłonny. Natomiast GBO oh two jest znacznie cieńszy i ma delikatniejszą teksturę, co zapewnia bardziej równomierny kontakt z membraną. Wytnij dodatkowy kawałek GBO o cztery, który będzie używany jako i spraw, aby był o około 20 centymetrów szerszy niż zanurzony żel.
Nitro UL WIC i cztery kawałki GBO o dwa i jeden XTBS w plastikowym pojemniku składają stos papierów w następujący sposób, 20 kawałków suchego GBO o cztery. Potem cztery kawałki suchego GBO o dwa. Następnie jeden kawałek wstępnie zwilżonego GBO i dwa.
Połóż nitrocelulozę na wierzchu tego stosu. Krótko wypłucz żel na tacy odlewniczej w wodzie, aby usunąć nadmiar buforu. Następnie ostrożnie zacznij zsuwać żel z tacki na stos, jednocześnie zsuwając żel z tacki, w razie potrzeby nabijając membranę TBS.
Dodatkowy bufor zapobiega uwięzieniu pęcherzyków w żelu. Pipeta transferowa dobrze sprawdza się w tym celu po całkowitym przeniesieniu żelu do stosu. Sprawdź dokładnie, czy nie ma bąbelków, jeśli są obecne.
Podnieś krawędź żelu i ponownie nałóż bufor, aż pęcherzyki będą mogły zostać wypracowane. Umieść pozostałe trzy wstępnie zwilżone GBO lub dwie części na wierzchu żelu. Zapewnij dokładny kontakt między wszystkimi warstwami, mocno przetaczając pipetę po górnej części stosu.
Umieść stos transferowy z dwiema podniesionymi tacami zawierającymi TBS Ułóż wstępnie zmoczony w poprzek stosu, tak aby oba końce były zanurzone. W TBS przykryj zmontowany stos transferowy dodatkową plastikową tacą o dodatkowym ciężarze, taką jak butelka wody o pojemności 500 mil. pobierze bufor z tac, a sucha bibuła przeciągnie bufor przez żel w ciągu kilku godzin.
Spowoduje to osadzenie białek na błonie, umożliwiając transfer przez co najmniej trzy godziny lub noc. Po zakończeniu transferu kapilarnego membrana może być przetwarzana za pomocą standardowego western blotting. Tutaj widzisz typową plamę białek, które uległy nadmiernej ekspresji w szczepie drożdży, który predysponuje pewne białka do tworzenia amyloidu.
Wyraźnie widać, że niektórzy z naszych kandydatów bardzo dobrze tworzą gatunki odporne na amyloid lub SDS o wysokiej masie cząsteczkowej, jak te pokazane tutaj i tutaj. Inne jednak nie tworzą agregatów i są całkowicie monomeryczne, takie jak te i te. Dodatkowo można zauważyć, że wielkość polimerów amyloidowych różni się w zależności od białka, co można zobaczyć na tych dwóch pasach.
Właśnie pokazaliśmy prostą metodę analizy nierozpuszczalnych agregatów o dużej masie cząsteczkowej, takich jak amyloidy kandydujących prionów. Mamy nadzieję, że podobało Ci się oglądanie naszej prezentacji i uważasz, że ta technika jest przydatna w badaniach nad białkami immunogennymi Amy. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w badaniach.
Przegląd
SDD-AGE to skuteczna metoda wykrywania i charakteryzowania polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Niniejszy artykuł przedstawia adaptację tej techniki do zastosowań na szeroką skalę.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Analiza białek
Wstęp
- Amyloidy są odporne na denaturację przez SDS, co umożliwia ich oddzielenie od innych białek.
- Metodę SDD-AGE można wykorzystać do wykrywania prionów i innych białek alogennych.
- Do przeprowadzenia SDD-AGE można wykorzystać standardowy sprzęt do horyzontalnej elektroforezy DNA.
- Dane z samej metody SDD-AGE nie mogą potwierdzić obecności amyloidu; konieczne jest zastosowanie dodatkowych technik.
Cel badania
- W celu zademonstrowania skalowalnej adaptacji metody SDD-AGE dla dużych liczebności próbek.
- W celu dostarczenia niezawodnej metody przesiewowej do wykrywania polimerów amyloidopodobnych.
- W celu przedstawienia przygotowania i wykonania techniki SDD-AGE.
Zastosowane metody
- Przygotowanie żelu agarozowego o określonych stężeniach i buforach.
- Przygotowanie próbek bez ogrzewania w celu uniknięcia denaturacji.
- Metoda transferu kapilarnego do przenoszenia białek na membrany.
- Stosowanie inhibitorów proteaz w celu zapobiegania degradacji białek podczas procesu.
Główne wyniki
- Skuteczne oddzielenie polimerów amyloidopodobnych od innych białek.
- Wykazana niezawodność techniki SDD-AGE w zastosowaniach na dużą skalę.
- Podkreślenie znaczenia starannego przygotowania i obchodzenia się z próbkami.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu efektywnego przeprowadzania SDD-AGE.
Wnioski
- SDD-AGE jest cennym narzędziem dla badaczy analizujących polimery amyloidopodobne.
- Technikę tę można dostosować do analiz wysokoprzepustowych.
- Dalsza walidacja z zastosowaniem dodatkowych technik jest niezbędna do potwierdzenia obecności amyloidu.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Metoda SDD-AGE umożliwia skalowalną detekcję konformerów amyloidu odpornych na SDS, wspierając wczesną walidację celów w przypadku chorób neurodegeneracyjnych i zaburzeń związanych z błędnym zwijaniem białek. Technika ta zapewnia ilościową rozdzielczość agregatów patogennych w oparciu o ich wielkość, co dostarcza informacji niezbędnych do identyfikacji związków wiodących oraz redukcji ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania leków. Jej adaptacja do wysokoprzepustowych przesiewów usprawnia selekcję projektów poprzez odróżnianie kandydatów podatnych na agregację od kontroli monomerowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez rozdzielanie nierozpuszczalnych w SDS konformerów białek z etykietą, co pozwala wyjaśnić potencjał amyloidogenny.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią wizualizację gatunków podatnych na agregację w lizatach komórkowych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność wyboru celu poprzez odróżnianie agregatów patogennych od kompleksów nieamyloidowych na podstawie odporności na detergenty.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów pracy poprzez izolację polimerów odpornych na SDS z rozpuszczonych białek.
- Powtarzalność: Standaryzacja detekcji amyloidu za pomocą transferu kapilarnego, umożliwiająca zastosowanie dowolnego rozmiaru żelu w celu zapewnienia spójnego przetwarzania próbek na dużą skalę.
- Skalowalność przesiewania: Ułatwienie wysokoprzepustowej analizy setek próbek przy użyciu grzebieni wielodołkowych i systemów do manipulacji cieczami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dane o agregacji z fazy odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez profilowanie polimerów amyloidu z rozdzielczością według rozmiaru.
- Mitygacja ryzyka mechanistycznego: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju leku w oparciu o analizę ryzyka poprzez identyfikację wariantów konformacyjnych o różnym stopniu patogenności.
- Korelacja z biomarkerami: Wspiera opracowywanie translacyjnych biomarkerów poprzez korelację rozmiaru agregatów z fenotypami istotnymi dla przebiegu choroby.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda SDD-AGE wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając analizę mechanistyczną przed etapem badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez wykrywanie gatunków wysokocząsteczkowych opornych na SDS, co wskazuje na tworzenie się amyloidu.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analizy oraz wyniki ilościowe dzięki rozdzieleniu konformerów podatnych na agregację na podstawie ich wielkości.
- Analityka: Dostarcza mierzalne odczyty (wielkość polimeru, odporność na SDS), które umożliwiają analizę porównawczą w różnych warunkach i w zależności od tła genetycznego.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez ustalanie profili agregacji istotnych dla danej choroby w celu priorytetyzacji celów terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma przesiewowa dzięki skalowalnym formatom żeli i ustandaryzowanym protokołom transferu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: pewność prognostyczna w walidacji celu, zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w testach agregacji.
- Wartość operacyjna: standaryzacja, powtarzalność i skalowalność przy przetwarzaniu setek próbek równolegle.
- Wartość strategiczna: lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju terapeutyków białkowych.
- Wpływ na portfolio: priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o tendencję do agregacji i stabilność konformacyjną.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza z zakresu biochemii białek oraz elektroforezy w żelach agarozowych, aby uniknąć denaturacji agregatów.
- Konieczne jest posiadanie sprzętu do poziomej elektroforezy DNA, agarozy, SDS, inhibitorów proteaz oraz materiałów do transferu kapilarnego.
- Wymagana jest standaryzacja postępowania z próbkami w ramach zespołu (brak ogrzewania, inhibicja proteaz) w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacyjne dla różnych białek z tagami oraz systemów ekspresyjnych (drożdże, komórki ssacze).
- Metoda ogranicza się do wykrywania frakcji nierozpuszczalnych w SDS; nie pozwala na potwierdzenie struktury amyloidowej bez walidacji ortogonalnej (np. ThT, barwienie włókien).
