Name: Badania przesiewowe w kierunku agregacji amyloidu za pomocą elektroforezy żelu z półdenaturacją detergentu i agarozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę SDD-AGE do wykrywania polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Ta skalowalna technika elektroforezy umożliwia badaczom przesiewowe analizy białek prionowych i alogennych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Simonowi Albertowi za pomoc w opracowaniu tego protokołu. Praca ta była wspierana przez grant z National Institutes of Health (GM25874), stypendium badawcze Howard Hughes Medical Institute (dla S.L.) oraz przedoktorski grant szkoleniowy z National Science Foundation (dla R.H.).

Część 1: Przygotowanie żelu
<ol>
<li>Zmontuj formę do odlewania żelu. Można użyć standardowego sprzętu do poziomej elektroforezy DNA. W przypadku dużej liczby próbek przygotowujemy płytkę o wymiarach 20 cm x 24 cm z maksymalnie czterema grzebieniami 50-dołkowymi. Upewnij się, że płytka nie posiada zarysowań, ponieważ mogą one zniekształcić obraz po transferze.</li>
<li>Przygotuj 1,5% roztwór agarozy (o średniej lub wysokiej wytrzymałości żelu, niskiej zawartości EEO) w 1X TAE. Objętość powinna być wystarczająca do całkowitego zanurzenia zębów grzebienia – należy nałożyć jak najwięcej próbek, aby zmaksymalizować detekcję. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści.</li>
<li>Szybko dodaj SDS z roztworu stokowego 10% do stężenia końcowego 0,1%. Zamieszaj ruchem wirowym. Jeśli w tym kroku część agarozy stężeje, rozpuść ją ponownie za pomocą płyty grzejnej, uważając, aby nie doprowadzić do wrzenia.</li>
<li>Wlej roztwór do formy odlewniczej. Użyj grzebienia, aby usunąć pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą one później zakłócić transfer.</li>
<li>Po stężeniu żelu wyjmij grzebienie i umieść żel w kuwecie elektroforetycznej. Całkowicie zanurz żel w 1X TAE zawierającym 0,1% SDS.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie próbek
<ol>
<li>W przypadku wysokoprzepustowej analizy lizatów drożdży rozpoczynamy od kultur o objętości 2 ml, hodowanych przez noc z szybkim mieszaniem w blokach 96-dołkowych. W tym przypadku każda kultura nadekspresuje białko docelowe. Przy analizie białek występujących w niskich stężeniach należy użyć większych objętości kultur. </li>
<li>Zbiór komórek przeprowadza się poprzez wirowanie przy 2000 RCF przez 5 min w temperaturze pokojowej. </li>
<li>Komórki resuspenduje się w wodzie i ponownie wiruje.</li>
<li>Resuspenduje się je w 1 ml roztworu do sferoplastowania. Inkubuje się przez około 30 min w 30°C (wydajność sferoplastowania można potwierdzić za pomocą mikroskopii). </li>
<li>Wiruje się przy 800 RCF przez 5 min w temperaturze pokojowej. Całkowicie usuwa się nadsącz.</li>
<li>Osad sferoplastów resuspenduje się w 100 ml buforu do lizy. </li>
<li>Blok zakleja się taśmą i miesza w wortexie z dużą prędkością przez 2 min.</li>
<li>Zanieczyszczenia komórkowe osadza się przez wirowanie przy 4000 RCF przez 2 min. </li>
<li>Nadsącz ostrożnie przenosi się do nowego naczynia, np. płytki PCR 96-dołkowej. </li>
<li>W razie potrzeby określa się stężenie białka w lizatach.</li>
<li>Do próbek dodaje się 4X bufor do próbek, aby uzyskać lizaty zawierające 1X bufor do próbek. Inkubuje się przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Nakłada się na żel. W razie potrzeby połowę objętości próbki należy zachować i zagotować do analizy SDS-PAGE. Aby później monitorować stopień transferu, należy dołączyć wstępnie zabarwiony marker SDS-PAGE. Dodatkowo, do szacowania rozmiarów rozdzielonych kompleksów można użyć markera masy cząsteczkowej składającego się z bardzo dużych białek (np. ekstraktu z mięśnia piersiowego kurczaka).</li>
<li>Elektroforezę prowadzi się przy niskim napięciu (≤ 3 V/cm długości żelu), aż front barwnika dotrze do ok. 1 cm od końca żelu. Proces ten trwa kilka godzin. Ważne jest, aby żel pozostał chłodny; w przeciwnym razie dyfuzja białek o niskiej masie cząsteczkowej (np. monomerów) może ograniczyć ich detekcję. </li>
</ol>
Część 3: Transfer
<ol>
<li>Wytnij kawałek nitrocelulozy o wymiarach odpowiadających wymiarom żelu. </li>
<li>Wytnij 20 kawałków papieru do transferu GB004 oraz 8 kawałków papieru GB002 o wymiarach odpowiadających wymiarom żelu. Wytnij dodatkowy kawałek GB004 do wykorzystania jako knot; powinien on być o około 20 cm szerszy niż żel. </li>
<li>Zanurz nitrocelulozę, knot oraz 4 kawałki GB002 w 1X TBS. </li>
<li>W plastikowym pojemniku ułóż stos papierów w następującej kolejności: 20 suchych kawałków GB004, następnie 4 suche kawałki GB002, a na koniec jeden namoczony wcześniej kawałek GB002. Na wierzchu tego stosu połóż nitrocelulozę.</li>
<li>Krótko opłucz żel na tacy odlewniczej wodą, aby usunąć nadmiar buforu do elektroforezy. Następnie ostrożnie zacznij przesuwać żel z tacy na stos. Podczas przesuwania żelu zwilżaj membranę buforem TBS w razie potrzeby. Dodatkowy bufor pomaga zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza pod żelem. Do tego celu dobrze nadaje się pipeta transferowa.</li>
<li>Po przeniesieniu żelu na stos dokładnie sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli jakieś wystąpią, unieś krawędź żelu i ponownie nanieś bufor, aż pęcherzyki zostaną usunięte.</li>
<li>Połóż pozostałe trzy namoczone kawałki GB002 na wierzchu żelu. Aby zapewnić dokładny kontakt między wszystkimi warstwami, mocno przeturlaj pipetą po wierzchu stosu.</li>
<li>Umieść stos transferowy pomiędzy dwiema podwyższonymi tacami zawierającymi TBS. Połóż namoczony knot na stosie w taki sposób, aby oba końce knota były zanurzone w TBS.</li>
<li>Przykryj złożony stos transferowy dodatkową plastikową tacą z obciążeniem (np. butelką wody o pojemności 500 ml).</li>
<li>Pozostaw transfer na minimum trzy godziny lub na całą noc.</li>
<li>Po transferze membranę można poddać standardowej procedurze Western blotting.</li>
</ol>
Roztwór do sferoplastyki 1.2 M D-sorbitol 0.5 mM MgCl2 20 mM Tris, pH 7.5 50 mM BME (dodać świeżo) 0.5 mg/ml Zymolyase 100T (dodać świeżo)
Bufor do lizy 100 mM Tris 7.5 50 mM NaCl 10 mM BME (dodać bezpośrednio przed użyciem) inhibitory proteaz (dodać bezpośrednio przed użyciem) 4X Bufor do próbek 2X TAE 20% glicerolu 8% SDS błękit bromofenolowy według uznania

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

Metoda SDD-AGE została po raz pierwszy opisana przez Kryndushkina i współpracowników1 w celu badania kompleksów prionu [PSI+] w drożdżach odpornych na SDS, a od tego czasu znajduje szerokie zastosowanie w badaniu agregatów prionowych i nieprionowych 2-9. Jednakże transfer białek na membranę po elektroforezie w żelu agarozowym jest problematyczny i może prowadzić do zniekształcenia obrazu na blocie 5. Ponadto powszechnie stosowana technika zanurzeniowego transferu elektroforetycznego wprowadza praktyczne ograniczenia dotyczące rozmiaru żelu, a tym samym liczby próbek, które można przetworzyć. Rozwiązaliśmy te problemy, stosując transfer kapilarny w dół 10, prostą procedurę wykorzystującą stos suchych papierów do transferu w celu przeniesienia białek z żelu na membranę nitrocelulozową. Transfer kapilarny zapobiega zniekształceniom i umożliwia łatwe przetwarzanie dużych żeli. Przed zastosowaniem SDD-AGE należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. W przypadku próbek surowych (np. lizatów) konieczna jest immunodetekcja specyficznych białek. SDD-AGE nie denaturuje w pełni badanych kompleksów białkowych, dlatego białka poddawane detekcji muszą posiadać znacznik epitopowy poza regionem amyloidogennym. Lizaty można zazwyczaj przygotowywać tak samo, jak do standardowej elektroforezy SDS-PAGE, z dwoma istotnymi różnicami. Po pierwsze, należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec degradacji proteolitycznej. Warunki częściowej denaturacji stosowane w tej metodzie nie są wystarczające do inaktywacji proteaz, a ponadto mogą zwiększyć podatność białek docelowych na proteolizę. Należy użyć kompletnego koktajlu inhibitorów proteaz w stężeniu co najmniej dwukrotnie wyższym od zalecanego. Po drugie, należy unikać podgrzewania próbek. Jeśli wymagana jest ujemna kontrola złożona wyłącznie z monomerów, na przykład w celu potwierdzenia, że formy o wysokiej masie cząsteczkowej nie wynikają z modyfikacji kowalencyjnych, można zastosować 10-minutową inkubację w 95°C, co przywróci większość amyloidów do postaci białka monomerowego.

<table><tbody><tr><td>zymolyaza 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>koktajl inhibitorów proteaz Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>nitroceluloza Hybond-C extra</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>papier do transferu GB004</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>papier do transferu GB002 (3MM Chr)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>agaroza (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Agregacja amyloidu wiąże się z licznymi patologiami wynikającymi z błędnego fałdowania białek i leży u podstaw właściwości zakaźnych prionów, które są białkami o konformacyjnej zdolności do samomotywacji (self-templating) i u których przypisuje się korzystne role u organizmów niższego rzędu. Amyloidy są znane z tego, że są niezwykle trudne do badania ze względu na ich nierozpuszczalność i heterogeniczność strukturalną. Jednak rozdzielenie polimerów amyloidu na podstawie wielkości i nierozpuszczalności w detergentach stało się możliwe dzięki zastosowaniu półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowo-detergentowym (SDD-AGE). Technika ta znajduje szerokie zastosowanie w wykrywaniu i charakteryzacji wariantów konformacyjnych amyloidu. W niniejszej pracy prezentujemy adaptację tej metody, która ułatwia jej wykorzystanie w zastosowaniach na szeroką skalę, takich jak przesiewy w poszukiwaniu nowych prionów i innych białek amyloidogennych. Nowa metoda SDD-AGE wykorzystuje transfer kapilarny w celu zwiększenia niezawodności i łatwości obsługi oraz pozwala na zastosowanie żeli o dowolnym rozmiarze. W ten sposób można jednocześnie przetwarzać dużą liczbę próbek, przygotowanych z komórek lub oczyszczonych białek, w celu wykrycia obecności nierozpuszczalnych w SDS konformerów białek znakowanych.

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

Agregacja amyloidu wiąże się z licznymi patologiami wynikającymi z błędnego fałdowania białek i leży u podstaw właściwości zakaźnych prionów, które są ...

Witajcie, jestem Randall Hoffman, doktorant w laboratorium Susan Linus na wydziale biologii w MIT. Dzisiaj przedstawię Państwu metodę półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z dodatkiem detergentu, czyli SDD-AGE. Nasze laboratorium wykorzystuje tę technikę do wykrywania prionów i innych białek amyloidogennych.Nasza wersja wieku SDD jest prosta i niezawodna, a ponadto może być skalowana w celu dostosowania do dowolnej liczby próbek. Amyloidy są wyjątkowo odporne na denaturację przez SDS, co pozwala na ich oddzielenie od innych białek przy użyciu SDDH. Jednak same dane z SDDH nie mogą służyć do potwierdzenia, że dana substancja jest amyloidem.Aby to osiągnąć, należy zastosować inne techniki. Mając to na uwadze, pozwolę sobie je zaprezentować. Metodę S-D-D-H-S-D-D-H można przeprowadzić przy użyciu standardowego sprzętu do poziomej elektroforezy DNA.W pierwszej kolejności należy złożyć formę do odlewania żelu. Wielkość aparatury zależy od liczby próbek. W przypadku dużej liczby próbek stosujemy płytkę o wymiarach 20 na 24 cm oraz do czterech grzebieni 50-dołkowych.Do przygotowania żelu będą potrzebne niskie EEO agros o średniej lub wysokiej wytrzymałości żelu, bufor 1x TAE oraz 10% roztwór zapasowy SDS. Przygotuj 1,5% roztwór AROS w buforze 1x TAE. Żel powinien być jak najgrubszy, aby umożliwić naniesienie maksymalnej ilości próbki i zmaksymalizować detekcję. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia aros.Szybko dodaj stok XSDS 100X do 0,1% i zamieszaj ruchem wirowym. Jeśli w tym kroku część agaru zestali się, rozpuść go na płycie grzewczej. Należy uważać, aby nie doprowadzić do wrzenia.Po dodaniu SDS roztwór będzie miał tendencję do pienienia się, dlatego należy go wlać do formy do odlewania, gdy jest jeszcze gorący. Następnie należy użyć grzebienia, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogłyby zakłócić późniejszy transfer żelu. Po całkowitym schłodzeniu i zestaleniu żelu należy ostrożnie wyjąć grzebienie i umieścić żel w komorze.Całkowicie zanurz żel w buforze one XTAE z 0,1% SDS. Można teraz przystąpić do nakładania próbek. Próbki białek wykorzystywane w SDDH przygotowuje się w taki sam sposób jak w przypadku SDS-PAGE, z dwoma istotnymi wyjątkami.Po pierwsze, należy unikać podgrzewania próbek, co mogłoby doprowadzić do denaturacji agregatów do monomerów białkowych. Po drugie, należy zadbać o to, aby uniknąć degradacji białek. Ponieważ zastosowane tutaj warunki denaturujące nie są wystarczające do inaktywacji wszystkich proteaz, zalecamy stosowanie co najmniej dwukrotnie większego niż zalecane stężenia kompletnego koktajlu inhibitorów proteaz.W niniejszej demonstracji wykorzystamy lizaty z komórek drożdży nadekspresujących konkretne białko docelowe. Zazwyczaj stosujemy kultury nocne o objętości 2 ml, hodowane w blokach 96-dołkowych dostępnych w VWR, jednak w przypadku analizy białek o niskiej zawartości należy zastosować większe objętości kultur.Zebrać komórki poprzez wirowanie hodowli z prędkością 2000 RCF przez pięć minut w temperaturze pokojowej; po wirowaniu usunąć nadsącz i wyprać komórki, resuspendując je w wodzie i ponownie wirować. Po drugim wirowaniu usunąć nadsącz i resuspendować komórki w odpowiednim roztworze do wysiewu. Enzymy w roztworze trawią ściany komórkowe, co pozwoli na efektywną lizę komórek w niewielkiej objętości buforu do lizy. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C.Tym razem wirować zapasowe komórki plastikowe w celu otrzymania osadu przy 800 RCF przez pięć minut. Całkowicie usunąć nadsącz, a następnie resuspender każdy osad w 100 µL buforu do lizy. Następnie zakryć blok taśmą i mieszać w wstrząsarze typu vortex z wysoką prędkością przez dwie minuty.Pozwala to na odwirowanie zanieczyszczeń komórkowych z plastikowych probówek przy 4 000 RCF przez dwie minuty. Ostrożnie przenieś nadsącz do 96-dołkowej płytki PCR.Zazwyczaj w naszym laboratorium analizujemy setki próbek jednocześnie, dlatego w tym celu wykorzystujemy system do pipetowania cieczy. W razie potrzeby należy oznaczyć stężenie białka w lizatach. Następnie do próbek należy dodać 4x bufor do próbek, aby uzyskać lizaty zawierające 1x bufor do próbek, i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie należy nanieść próbki na żel. Jeśli jest to wymagane, połowę próbek należy zachować do analizy SDS-PAGE. Należy również nanieść markery masy cząsteczkowej, w tym markery wstępnie barwione oraz marker o bardzo wysokiej masie cząsteczkowej, taki jak ekstrakt z fletora kurczaka.W razie potrzeby ważne jest utrzymywanie żelu w niskiej temperaturze, aby zapobiec dyfuzji białek o niskiej masie cząsteczkowej, dlatego zaleca się przeprowadzanie elektroforezy w pomieszczeniu chłodniczym. Prowadź elektroforezę przy niskim napięciu, poniżej 3 V na centymetr długości żelu. Kontynuuj proces przez kilka godzin, aż front barwnika dotrze do około 1 cm od końca żelu.Ponieważ amyloid nie ulega denaturacji w 2% SDS w temperaturze pokojowej, pozostanie on nienaruszony, podczas gdy inne kompleksy, w tym większość agregatów nieamyloidowych, rozpadną się w obecności 2% SDS. W związku z tym większość białek będzie występować w formie monomerów i szybko przejdzie przez żel, podczas gdy oporne na SDS amyloidy o wysokiej masie cząsteczkowej będą migrować wolniej.Po tym kroku żel będzie gotowy do transferu. Chociaż można zastosować wiele metod transferu, najlepsze wyniki uzyskujemy, stosując transfer kapilarny. Ponieważ transfer kapilarny pozwala na pracę z żelem o dowolnym rozmiarze, jest on praktycznym rozwiązaniem przy analizie setek próbek.Stos suchych papierów do transferu służy do przepychania buforu przez żel, co powoduje osadzanie białek na membranie nitrocelulozowej umieszczonej pomiędzy papierami a żelem. Należy wyciąć kawałek nitrocelulozy, np. high bond C, extra, o wymiarach zgodnych z wymiarami żelu. Należy również wyciąć 20 arkuszy papieru do transferu GB 04 oraz 8 arkuszy papieru do transferu GB 02 o rozmiarze odpowiadającym rozmiarowi żelu.GB 04 jest bardzo gruby i chłonny. Z kolei GB 02 jest znacznie cieńszy i ma drobniejszą teksturę, co zapewnia bardziej równomierny kontakt z membraną. Wytnij dodatkowy kawałek GB 04, który posłuży jako knot; powinien być on o około 20 centymetrów szerszy niż zanurzony żel.Przygotowując wodny WIC i cztery kawałki GBO O2 oraz jeden XTBS w plastikowym pojemniku, ułożyć stos papierów w następujący sposób: 20 kawałków suchego GBO O4, następnie cztery kawałki suchego GBO O2, a na końcu jeden kawałek uprzednio namoczonego GBO O2.Połóż membranę nitrocelulozową na wierzchu tego stosu. Krótko opłucz żel na tacy do odlewania wodą, aby usunąć nadmiar buforu do elektroforezy. Następnie ostrożnie zacznij zsuwać żel z tacy na stos, w razie potrzeby zwilżając membranę TBS podczas zsuwania żelu z tacy.Nadmiar buforu pomaga zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza w żelu. Pipeta transferowa sprawdza się w tym celu po całkowitym przeniesieniu żelu do zestawu do elektroforezy. Należy dokładnie sprawdzić, czy nie pojawiły się pęcherzyki powietrza.Podnieś krawędź żelu i ponownie nałóż bufor, aż do momentu usunięcia pęcherzyków powietrza. Połóż pozostałe trzy wstępnie zwilżone kawałki GBO na wierzchu żelu. Aby zapewnić dokładny kontakt między wszystkimi warstwami, przesuń mocno pipetę wzdłuż górnej powierzchni stosu.Po obu stronach stosu do transferu ustaw dwie podwyższone kuwety zawierające TBS, a następnie przerzuć przez stos uprzednio namoczony knot w taki sposób, aby jego oba końce były zanurzone w roztworze. Przykryj tak przygotowany stos do transferu dodatkową plastikową kuwetą z TBS, obciążając ją np. butelką wody o pojemności 500 ml. Knot będzie pobierał bufor z kuwet, a suche papiery do transferu będą przeciągać bufor przez żel w ciągu kilku godzin.Dzięki temu białka zostaną osadzone na membranie; należy pozwolić transferowi przebiegać przez minimum trzy godziny lub przez noc. Po zakończeniu transferu kapilarnego membranę można poddać standardowej analizie western blotting. Tutaj przedstawiono typowy obraz białek, które wykazano w nadmiernej ekspresji w szczepie drożdży predysponującym określone białka do tworzenia amyloidów.Wyraźnie widać, że niektóre z naszych kandydatów bardzo dobrze tworzą amyloidy lub wysokocząsteczkowe formy oporne na SDS, jak te pokazane tutaj i tutaj. Inne natomiast nie tworzą agregatów i są całkowicie monomeryczne, jak te i te. Dodatkowo można zauważyć, że wielkość polimerów amyloidu różni się w zależności od białka, co widać w tych dwóch ścieżkach.Przedstawiliśmy prostą metodę analizy wysokocząsteczkowych, nierozpuszczalnych agregatów, takich jak amyloidy potencjalnych prionów. Mamy nadzieję, że prezentacja była interesująca, a opisana technika okaże się przydatna w badaniach nad białkami immunogennymi amyloidów. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w dalszych badaniach.

screening-for-amyloid-aggregation-semi-denaturing-detergent-agarose

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie agregacji amyloidów przez półdenaturującą elektroforezę w żelu detergent-agarowym

Opisujemy technikę przygotowania klarownych homogenatów kory mózgu człowieka, rozdziału białek metodą SDS-PAGE, odsłaniania antygenów oraz immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomeryczne i multimeryczne Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Detekcja multimerów A&beta; w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

Ten film demonstruje dwuwymiarową, częściowo denaturującą separację włókien amyloidowych za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym detergentu. Technika ta polega na oddzieleniu polimorficznych agregatów amyloidowych na podstawie ich niejednorodnego rozmiaru.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu agarozowym częściowo denaturującym: technika rozdzielania polimorficznych włókien amyloidowych na podstawie niejednorodności wielkości

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Opisano proste metody demonstrowania produkcji cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa.

Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa

Tutaj używamy dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym, aby potwierdzić obecność włókien podobnych do amyloidu o niejednorodnej wielkości i wykluczyć możliwość, że niejednorodność wielkości jest spowodowana dysocjacją włókien amyloidowych podczas procesu działania żelu.

Zastosowanie dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym detergentu w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych

Ten raport opisuje techniki izolacji i oczyszczania siarczanowych glikozaminoglikanów (GAG) z próbek biologicznych oraz metodę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w celu przybliżenia ich wielkości. GAG przyczyniają się do budowy tkanek i wpływają na procesy sygnalizacyjne poprzez oddziaływanie elektrostatyczne z białkami. Długość polimeru GAG przyczynia się do ich powinowactwa do pokrewnych ligandów.

Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem

Ten protokół opisuje ekstrakcję i wizualizację zagregowanych i rozpuszczalnych białek z Escherichia coli po leczeniu proteotoksycznym środkiem przeciwbakteryjnym. Postępowanie zgodnie z tą procedurą pozwala na jakościowe porównanie tworzenia agregatów białkowych in vivo w różnych szczepach bakteryjnych i/lub między zabiegami.

Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli stresorem proteotoksycznym

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Niniejsze badanie przedstawia metody eksperymentalne biochemicznie charakteryzujące GFAP i jego mutacje wywołujące choroby, koncentrując się na składaniu, agregacji i modyfikacji potranslacyjnej filamentu. Analizowano białka GFAP o wysokiej czystości, co ujawniło wgląd w mechanizmy choroby Alexandra, które mogą stanowić ramy do badania potencjalnych celów terapeutycznych oraz zrozumienia mutacji GFAP i powiązanych schorzeń.

Eksperymentalne podejścia do analizy biochemicznej białka kwaśnego glia włóknistego i jego wariantów związanych z chorobą

Poznaj metodę SDD-AGE do wykrywania polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Ta skalowalna technika elektroforezy umożliwia badaczom przesiewowe analizy białek prionowych i alogennych.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

Przeglądaj więcej filmów