Reagregacja kultur grasicy

Witam, nazywam się Andrea White i pochodzę z laboratorium Grahama Andersona i Erica Jenkinsona w MRC Center for Immune Regulation na Uniwersytecie w Birmingham. Dzisiaj przedstawiam protokół otrzymywania reaggregowanych kultur organoidalnych grasicy, które mogą być wykorzystywane do badania złożonych interakcji komórkowych zachodzących podczas różnicowania limfocytów T. Przed rozpoczęciem tej procedury wyizolowano embrionalne płaty grasicy i poddano je obróbce w celu usunięcia wszystkich limfocytów.

Można to zobaczyć na oddzielnym filmie. Następnie płaty alienoidalne są dysagregowane w celu przygotowania zawiesiny komórek stromy. Na koniec komórki są agregowane, aby utworzyć re-agregowaną hodowlę organową fmic.

Zacznijmy. Po od pięciu do siedmiu dni hodowli, LO powinny być gotowe do dysagregacji w celu przygotowania zawiesin komórek shoal; zanurz filtry 0,8 µm w szalce Petri zawierającej RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS. Za pomocą pęsety delikatnie usuń wszelkie pasma włókien, które nie odrywają się samoistnie. Użyj pipety 1 ml, aby przenieść płaty do probówki typu eppendorf 1,5 ml.

Zalecamy umieszczenie nie więcej niż 50 płatów w jednej probówce typu eend orph. Należy pozwolić płatom opaść na dno probówki pod wpływem grawitacji, a następnie usunąć medium. Płaty należy przemyć 1 ml PBS, a następnie ponownie pozwolić im opaść na dno.

Powtórz tę czynność, aby przeprowadzić łącznie trzy płukania w PBS, usuń ostatnią porcję PBS i dodaj 600 µL 0,25% roztworu trypsyny. Umieść probówkę typu Eppendorf w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 25 minut. Delikatnie potryturuj płaty za pomocą niebieskiego końcówki 1000 µL w pipecie automatycznej przez 10 sekund, a następnie umieść je ponownie w inkubatorze; po 20 minutach pipetuj płaty w górę i w dół, aby całkowicie je rozaggregatedować.

Aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, co powinno zająć około 30 sekund, należy dodać 400 µL lodowatego medium RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS w celu zneutralizowania trypsyny, a następnie osadzić komórki poprzez wirowanie przy 1000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C, usunąć nadsącz i, jeśli jest to wymagane, resuspender osad w 1 mL medium RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS. Następnie należy policzyć komórki.

Zazwyczaj oczekujemy około 50 000 komórek na płat dioksazyny, zaczynając od embrionu w 15. dniu (E 15). Teraz możemy przystąpić do tworzenia agregatów kultur fmic Corgan w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Wymieszaj świeżo przygotowane drobne komórki zrębu.

Wraz z wcześniej wyselekcjonowanymi fibrocytami CD4+ CD8+. Zalecamy stosunek komórek zrębu do fibrocytów wynoszący około 1:1. Liczba wykorzystanych komórek będzie zależeć od dostępnej liczby komórek oraz planowanych eksperymentów.

Zalecamy użycie łącznie co najmniej sto tysięcy komórek i nie więcej niż 1,5 miliona komórek. Agregaty V powinny być wystarczająco duże, aby zapewnić powtarzalność, ale nie tak duże, aby komórki w centrum obumarły. Wirować osad komórkowy z prędkością 1000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie ostrożnie złożyć filtr do hodowli organowej.

Usunąć cały nadsącz z etapu za pomocą pipety P 200. Wirujesz osad komórkowy przez 10 sekund, aby utworzyć zawiesinę. Objętość powinna wynosić około 1–2 µL.

Naciągnij zawiesinę do cienkiej pipety, utrzymując zawiesinę komórek na jej końcówce. Pod mikroskopem stereotypowym ostrożnie nanieś zawiesinę komórek na środek filtra o wielkości oczek 0,8 µm. Idealnie komórki powinny zostać naniesione w formie stojącej kropli o średnicy od jednego do dwóch milimetrów.

Jeśli zawiesina zacznie się rozprzestrzeniać, należy odczekać, aż płyn z zawiesiny spłynie przez sito przed osadzeniem pozostałych komórek. Umieścić szalkę w plastikowym pojemniku i szczelnie zamknąć. Podobnie jak w przypadku hodowli organów grasicy, pojemnik umieszczono w inkubatorze; hodowle agregacyjne tworzą nienaruszone struktury w ciągu 18 godzin hodowli.

Po czterech do pięciu dniach hodowli powstaną zarówno dojrzałe subpopulacje cytokin CD4+CD8-, jak i CD4-CD8+. Rozpoczęcie pracy z 50 płatami traktowanymi dioksazyną powinno zapewnić wystarczającą liczbę komórek zrębu do przygotowania od trzech do pięciu hodowli reaggregatów. Hodowle te zazwyczaj przyjmują formę spójnych skupisk komórek, które można zdjąć z filtrów za pomocą pincety bez ich rozrywania.

Właśnie opisaliśmy metodę badania selekcji pozytywnej przez nabłonkowe komórki F. Metoda ta może być również wykorzystana do badania selekcji negatywnej zapośredniczonej przez komórki dendrytyczne. Ostatecznie, wykorzystując transgeniczne FIBROCYTES względem TCR lub komórki zrębu z niedoborem MHC klasy I lub MHC klasy II.

System ten umożliwia oddzielne badania selekcji limfocytów T CD4+ lub CD8+. Dziękujemy za uwagę.