Name: Reagregacja kultur grasicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Poznaj metodę przygotowania reagregatowych kultur grasicy z użyciem 2-dGuo do badania różnicowania komórek T i interakji komórkowych. Technika ta umożliwia generowanie podzbiorów CD4+ i CD8+ w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Aby uzyskać więcej informacji na temat przygotowania kultur agregatów grasicy, zapraszamy do odwiedzenia strony <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a>.

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

reagregacja kultur grasicy

Reaggregate Thymus Cultures

Komórki zrębu w tkankach limfatycznych są zorganizowane w struktury trójwymiarowe, które stanowią rusztowanie uważane za kluczowe dla kontroli migracji i rozwoju komórek hemopoeitycznych. Co istotne, utrzymanie tej trójwymiarowej organizacji wydaje się niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania komórek zrębu, podczas gdy dwuwymiarowe hodowle monowarstw często wykazują zdolność do wspierania jedynie poszczególnych fragmentów funkcji tkanki limfatycznej. W grasicy złożone sieci korowych i rdzeniowych komórek nabłonkowych pełnią rolę ramy kontrolującej rekrutację, proliferację, różnicowanie i przeżycie progenitorów limfoidalnych w trakcie wieloetapowego procesu wewnątrzgrasiczego rozwoju limfocytów T. Zrozumienie funkcjonalnej roli poszczególnych przedziałów zrębu w grasicy jest niezbędne do określenia, w jaki sposób grasica wprowadza rozróżnienie między własnym a obcym. W niniejszej pracy opisujemy technikę, w której wykorzystujemy plastyczność tkanek płodowych do ponownej asocjacji w nienaruszone struktury trójwymiarowe in vitro po ich enzymatycznej dysagregacji. Dysocjację płatów grasicy płodowej do heterogenicznych mieszanin komórkowych, a następnie ich rozdzielenie na poszczególne komponenty komórkowe, łączy się z ponowną asocjacją in vitro wybranych typów komórek w trójwymiarowe struktury reaggregatów w określonych proporcjach, co stwarza możliwość zbadania konkretnych aspektów rozwoju limfocytów T w zdefiniowanych warunkach komórkowych. (Artykuł ten opiera się na pracy pierwotnie opublikowanej w Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 strony 185-196).

W niniejszym filmie zaprezentowano przygotowanie kultur reaggregatów grasicy traktowanych 2-dGuo.

Reagregacja kultur grasicy

Komórki zrębowe w tkankach limfatycznych są zorganizowane w struktury trójwymiarowe, które tworzą rusztowanie uważane za czynnik kontrolujący migrację i...

Witajcie, nazywam się Andrea White i reprezentuję laboratorium Grahama Andersona i Erica Jenkinsona w MRC Center for Immune Regulation na Uniwersytecie w Birmingham. Dzisiaj przedstawiam protokół otrzymywania re-agregowanych kultur organowych grasicy, które mogą być wykorzystane do badania złożonych interakcji komórkowych zachodzących podczas różnicowania limfocytów T. Przed rozpoczęciem tej procedury płaty grasicy embrionalnej zostały wyizolowane i poddane obróbce w celu usunięcia wszystkich limfocytów.Można to zobaczyć na osobnym filmie. Następnie płaty alienoidowe są rozgregowane w celu przygotowania zawiesiny komórek zrębu. Na koniec komórki są agregowane, aby utworzyć re-agregowaną kulturę organową fmic.Zacznijmy. Po pięciu do siedmiu dniach hodowli organoidy wątroby (LO) powinny być gotowe do dysagregacji w celu przygotowania zawiesiny komórek. Zanurz filtry 0,8 µm w szalce Petri zawierającej pożywkę RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS. Za pomocą pęsety delikatnie oddziel wszelkie fragmenty włókien, które nie odrywają się samoistnie. Użyj pipety 1 ml, aby przenieść organoidy do probówki typu eppendorf 1,5 ml.Zaleca się umieszczenie maksymalnie 50 płatów w jednej probówce typu endotend. Należy pozwolić płatom opaść na dno probówki pod wpływem grawitacji, a następnie usunąć medium. Płaty należy przemyć 1 mL PBS, po czym ponownie pozwolić im opaść na dno.Powtórz tę procedurę łącznie trzy razy dla płukania w PBS, usuń ostatnią porcję PBS i dodaj 600 µL roztworu tripsyny 0,25%. Umieść probówkę Eppendorf w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 25 minut. Ostrożnie trituruj płaty, używając niebieskiej końcówki 1 mL w pipecie automatycznej przez 10 sekund, a następnie ponownie umieść je w inkubatorze; po 20 minutach pipetuj płaty w górę i w dół, aby całkowicie je rozagregować.Proces ten powinien zająć około 30 sekund. Aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, należy dodać 400 µL lodowatego pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS w celu neutralizacji trypsyny. Komórki należy odwirować przy 1000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C, usunąć nadsącz i w razie potrzeby resuspendować osad w 1 ml RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS. Następnie należy policzyć komórki.Zazwyczaj spodziewamy się około 50 000 komórek na jeden płat doksazynowy, zaczynając od zarodka w stadium E 15. Teraz jesteśmy gotowi do utworzenia agregatu kultur fmic Corgan w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Wymieszaj świeżo przygotowane komórki stromalne.Wraz z wcześniej wyselekcjonowanymi fibrocytami CD4+ CD8+. Zalecamy stosunek komórek zrębowych do fibrocytów w proporcji około 1:1. Liczba wykorzystanych komórek będzie zależeć od dostępnej ich liczby oraz planowanych eksperymentów.Zalecamy użycie łącznie co najmniej stu tysięcy komórek, ale nie więcej niż 1,5 miliona komórek. Agregaty V powinny być wystarczająco duże, aby zapewnić powtarzalność wyników, ale nie tak duże, aby komórki w ich centrum obumarły. Wirować osad komórkowy z prędkością 1000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie ostrożnie złożyć filtr do hodowli organowej.Usunąć cały nadsącz z etapu za pomocą pipety P 200. W vortexować osad komórkowy przez 10 s, aby utworzyć zawiesinę. Objętość powinna wynosić około 1-2 µL.Naciągnij zawiesinę do wąskiej pipety, utrzymując zawiesinę komórek w jej końcówce. Pod mikroskopem stereowym ostrożnie nanieś zawiesinę komórek na środek filtra o porach 0,8 µm. Optymalnie komórki powinny zostać naniesione w formie stojącej kropli o średnicy od jednego do dwóch milimetrów.Jeśli zawiesina zacznie się rozprzestrzeniać, należy odczekać, aż płyn z zawiesiny odpłynie przez porowe membrany przed osadzeniem pozostałych komórek. Umieść szalkę w plastikowym pojemniku i szczelnie zamknij. Podobnie jak w przypadku kultur organowych grasicy, umieść pojemnik w inkubatorze; kultury agregacyjne formują nienaruszone struktury w ciągu 18 godzin hodowli.Po czterech do pięciu dniach hodowli powstaną dojrzałe subpopulacje cytokin CD4+CD8- oraz CD4-CD8+. Wykorzystanie 50 lobuli traktowanych doksaziną powinno dostarczyć wystarczającą liczbę komórek zrębu do przygotowania od trzech do pięciu kultur reaggregacyjnych. Kultury te zazwyczaj przyjmują formę spójnych skupisk komórek, które można zdjąć z filtrów za pomocą pęsety bez ich rozrywania.Właśnie opisaliśmy metodę badania selekcji pozytywnej przez komórki nabłonkowe F. Metoda ta może być również wykorzystana do badania selekcji negatywnej pośredniczonej przez komórki dendrytyczne. Ostatecznie, poprzez zastosowanie transgenicznych FIBROCYTÓW TCR lub komórek zrębowych z niedoborem MHC klasy I lub niedoborem MHC klasy II.System ten umożliwia oddzielne badania selekcji limfocytów T CD4+ lub CD8+. Dziękujemy za oglądanie.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Reaggreguj Kultury Tymusu

W niniejszym filmie zaprezentowano technikę wycięcia i usunięcia grasicy płodowej, a także przygotowanie kultur ex vivo grasicy traktowanej 2-dGuo. <br...

Przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dGuo

Ten film demonstruje protokół generowania funkcjonalnych limfocytów T specyficznych dla antygenu z niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC za pomocą trójwymiarowego systemu hodowli grasicy. Jednoczesna hodowla niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC z endogennymi płatami grasicy płodowymi myszy zubożonymi w limfocyty spowodowała pomyślne dojrzewanie limfocytów T do utworzenia emigrantów grasicy pochodzących z iPSC CD8αβ + + MHC klasy I + (iTE).

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania emigrantów grasicy pochodzących od iPSC

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Ten film demonstruje protokół wzbogacania komórek nabłonka grasicy (TEC) o gradient gęstości do izolacji FACS. Pokazuje również zastosowanie peptydów EAK16-II/EAKIIH6 do promowania tworzenia agregatów TEC. Mikrośrodowiska hydrożelu EAK16-II/EAKIIH6 zapewniają konfigurację 3D niezbędną do utrzymania przetrwania i funkcji TEC.

Promowanie agregacji 3D oczyszczonych komórek nabłonka grasicy FACS za pomocą samoorganizującego się hydrożelu EAK 16-II/EAKIIH6

Opisujemy przygotowanie wycinków grasicy, które w połączeniu z cytometrią przepływową mogą być użyte do modelowania pozytywnej i negatywnej selekcji rozwijających się limfocytów T. Plastry grasicy można również przystosować do analizy in situ migracji, lokalizacji i sygnalizacji tymocytów za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii dwufotonowej.

Przygotowanie i zastosowanie organotypowych kultur grasicy w warstwach

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten protokół opisuje izolację podwójnie ujemnych tymocytów z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę w systemie kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego z ekspresją delta 4 (OP9-DL4) w celu dalszej analizy funkcjonalnej.

Współhodowla i transdukcja mysich tymocytów na komórkach zrębowych z ekspresją 4 podobną do delta w celu badania onkogenów w białaczce z komórek T

Tutaj opisujemy protokół tworzenia ludzkich organoidów grasicy pochodzących z iPSC, hodowanych w hydrożelach fibrynowych 3D, mających na celu wspomaganie dojrzewania komórek nabłonka grasicy (TEC) i przedłużonego utrzymania, a także tymopoezę in vitro.

Tworzenie organoidów grasicy ludzkiej w trójwymiarowych hydrożelach fibrynowych

Poznaj metodę przygotowania reagregatowych kultur grasicy z użyciem 2-dGuo do badania różnicowania komórek T i interakji komórkowych. Technika ta umożliwia generowanie podzbiorów CD4+ i CD8+ w kontrolowanych warunkach in vitro.

Reagregacja kultur grasicy

Przeglądaj więcej filmów