Reagregacja kultur grasicy
August 28th, 2008
W tym filmie pokazano przygotowanie reagregowanych kultur grasicy poddanych działaniu 2-dGuo.
Cześć, nazywam się Andrea White i pochodzę z laboratorium Grahama Andersona i Erica Jenkinsona w MRC Center for Immune Regulation na Uniwersytecie w Birmingham. Dzisiaj przedstawiam protokół wyprowadzania reagregacji kultur narządów grasicy, który może być wykorzystany do badania złożonych interakcji komórkowych zachodzących podczas różnicowania limfocytów T. Przed rozpoczęciem tej procedury wyizolowano zarodkowe płaty grasicy i poddano je leczeniu w celu usunięcia wszystkich limfocytów.
Można to zobaczyć na osobnym filmie. Płaty alienoidalne są następnie dezagregowane w celu wytworzenia preparatu komórek zrębu. I wreszcie, komórki są agregowane w celu utworzenia ponownie zagregowanej kultury narządów fmic.
Zacznijmy. Po pięciu do siedmiu dniach w hodowli LO powinien być gotowy do dezagregacji w celu przygotowania komórek ławicy, zanurz filtry 0,8 mikrometra na szalce Petriego zawierającej RPMI 1640 plus 10% FCS Za pomocą kleszczy delikatnie odepchnij wszelkie zbocza włókien, które nie unoszą się. Użyj jednego mili na zwierzę, aby przenieść płaty do 1.5 milimetrowej rurki orph.
Zalecamy nie więcej niż 50 płatków na rurkę eend orph. Pozwól, aby krzywki opadły na dno rurki pod wpływem jednostkowej grawitacji i usuń medium. Umyj płaty jednym mil PBS, a następnie pozwól płatom ponownie opaść na dno.
Powtórz to dla łącznie trzech prań PBS, usuń ostatnie płukanie PBS i dodaj 600 mikrolitrów 0,25% płynu do roztworu. Umieść probówkę einor w inkubatorze o temperaturze 37 stopni na 25 minut. Delikatnie rozdrobnij płatki za pomocą niebieskiej końcówki o grubości jednego mili na perpet przez 10 sekund, a następnie umieść z powrotem w inkubatorze po 20 minutach, pipetuj płatki w górę iw dół, aby całkowicie je zdezagregować.
Powinno to zająć około 30 sekund Aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, dodaj 400 mikrolitrów lodowatego lodu, RPMI 1640 plus 10% FCS, aby zneutralizować osad chochlika trypsyny komórki przez odwirowanie przy tysiącu obr./min, 10 minut w czterech stopniach C, usuń sup natant i ponownie zawieś osad w jednym mili. RPMI 1640 plus 10% FCS w razie potrzeby. Policz komórki.
Zazwyczaj spodziewamy się około 50 000 komórek na płat dioksazyny, zaczynając od włóknistego E 15. Teraz jesteśmy gotowi do uformowania zagregowanych kultur fmic Corgana w półtorakilometrowej probówce orph. Mieszane, świeżo przygotowane drobne komórki zrębu.
Wraz z wstępnie wyselekcjonowanymi CD cztery dodatnie CD osiem dodatnich fibrocytów. Zalecamy stosunek komórek zrębu do fibrocytów jeden do jednego. Liczba komórek, których użyjesz, będzie zależeć od liczby dostępnych komórek i eksperymentów, które mają zostać wykonane.
Zalecamy w sumie co najmniej sto tysięcy ogniw i nie więcej niż 1,5 miliona ogniw. Chcesz, aby agregaty V były wystarczająco duże, aby były powtarzalne, ale nie na tyle duże, aby środek umarł komórki peletów przez wirowanie z prędkością tysiąca obrotów na minutę przez 10 minut. W temperaturze czterech stopni C ostrożnie zamontuj filtr do hodowli narządów.
Usuń wszystkie SUP natin na etapie z P 200 na zwierzę. Osad komórek wirowych przez 10 sekund, aby utworzyć zawiesinę. Objętość powinna wynosić około jednego do dwóch mikrolitrów w ustach.
Pogłaszcz gnojowicę w drobno narysowanym zwierzaku, utrzymując zawieszenie komórek na końcu zwierzęcia. Pod naszym mikroskopem preparacyjnym ostrożnie wypychaj zawiesinę komórek PET na środek filtra 0,8 mikrometra. Idealnie, komórki powinny być umieszczone jako stojąca kropla w okręgu o średnicy od jednego do dwóch milimetrów.
Jeśli gnojowica zacznie się rozprzestrzeniać, pozwól, aby płyn z gnojowicy spłynął przez pos przed zdeponowaniem pozostałych komórek. Umieść naczynie w plastikowym pudełku na kanapki i zamknij. Jeśli chodzi o hodowle narządów grasicy i umieszczamy pudełko w inkubatorze, agregujemy kultury w nienaruszone struktury w ciągu 18 godzin od posiewu.
Po czterech do pięciu dniach hodowli wygenerują zarówno CD cztery dodatnie osiem ujemnych, jak i CD cztery ujemne osiem dodatnich podzbiorów dojrzałych cytów. Zaczynając od 50 płatów traktowanych dioksazyną, powinno to dać wystarczającą ilość komórek zrębu do przygotowania od trzech do pięciu kultur reagregujących. Kultury te zazwyczaj wyglądają jak spójne kopce komórek, które można zepchnąć z filtrów za pomocą kleszczy bez ich naruszania.
Właśnie opisaliśmy metodę, za pomocą której można badać pozytywną selekcję przez komórki nabłonka F. Metoda ta może być również wykorzystana do badania selekcji negatywnej za pośrednictwem komórek dendrytycznych. Wreszcie, przy użyciu transgenicznych FIBROCYTÓW TCR lub komórek zrębowych z niedoborem MHC klasy pierwszej lub komórek zrębowych z niedoborem MHC klasy drugiej.
System ten pozwala na oddzielne badania nad selekcją limfocytów T CD 4 dodatnich lub CD 8 dodatnich. Dziękujemy za dołączenie.
Przegląd
To wideo pokazuje przygotowanie reaggregowanych kultur tymusu traktowanych 2-dGuo. Te kultury są niezbędne do badania różnicowania limfocytów T i interakcji komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Kultury narządów tymusu
Tło
- Kultury narządów tymusu są używane do badania rozwoju limfocytów T.
- Reaggregowano kultury pozwalają na badanie interakcji komórkowych.
- Leczenie 2-dGuo jest wykorzystywane do przygotowania płatów tymusu.
- Rozumienie różnicowania limfocytów T jest kluczowe dla badań immunologicznych.
Cel badania
- Aby uzyskać reaggregowano kultury narządów tymusu.
- Aby zbadać procesy różnicowania limfocytów T.
- Aby zbadać interakcje komórkowe w kontrolowanym środowisku.
Stosowane metody
- Izolacja i leczenie płatów tymusu embrionalnego.
- Dysagregacja w celu uzyskania preparatów komórek stromalnych.
- Agregacja komórek w celu utworzenia reaggregowanych kultur.
- Inkubacja i obserwacja rozwoju kultury.
Główne wyniki
- Reaggregowano kultury formują nienaruszone struktury w ciągu 18 godzin.
- Generuje się podzbiory limfocytów T CD4 dodatnich i CD8 dodatnich.
- Metoda pozwala na badanie dodatniej i ujemnej selekcji.
- Wykorzystanie TCR transgenicznych fibroblastów do dalszych badań.
Wnioski
- Protokół skutecznie pokazuje różnicowanie limfocytów T.
- Reaggregowano kultury stanowią cenne narzędzie do badań immunologicznych.
- Dalsze badania mogą wykorzystywać tę metodę do różnych badań selekcji limfocytów T.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reaggregate thymus cultures enable precise dissection of stromal-hematopoietic interactions critical for T-cell lineage commitment and selection. This three-dimensional in vitro system supports mechanistic de-risking at the target validation stage by allowing controlled manipulation of cellular composition and microenvironment. The approach enhances predictive confidence for immunology-focused discovery portfolios by modeling key aspects of thymic selection and self/non-self discrimination.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of stromal compartment roles in T-cell development and selection.
- Enables functional validation of candidate targets involved in thymic microenvironment signaling.
- Supports mechanistic de-risking by isolating effects of specific cell types or genetic backgrounds.
- Provides a platform for hypothesis-driven manipulation of thymic selection processes.
Screening & Assay Development
- Generates reproducible three-dimensional cultures for standardized functional assays.
- Allows quantitative assessment of T-cell subset differentiation under defined conditions.
- Supports assay development for evaluating modulators of thymic selection or stromal function.
- Enables scalable preparation of organotypic cultures for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant thymic microenvironments for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of immune-modulating interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanisms of T-cell selection.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo immune development processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling controlled, quantitative studies of thymic selection mechanisms in a physiologically relevant context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stromal-hematopoietic interactions and pathway elucidation.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible organotypic cultures for functional evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative readouts of T-cell subset generation and selection outcomes.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant immune development and biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse genetic backgrounds and experimental variables.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes three-dimensional culture preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying functional roles of thymic compartments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue handling and three-dimensional culture techniques.
- Needs access to cell separation, counting, and organ culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell ratios and culture conditions for reproducibility.
- Adaptable to various genetic models, including transgenic or MHC-deficient backgrounds.
- Limited by the scalability of primary tissue sourcing and manual aggregation steps.
