Name: Zapis kanałów jonowych ulegających ekspresji w oocytach Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj technikę patch clamp do badania kanałów jonowych w oocytach Xenopus laevis. Naucz się usuwać błonę witelinową i formować uszczelnienie gigaomowe dla niezawodnych pomiarów elektrofizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przepis na roztwór kurczący pochodzi z laboratorium R.W. Aldricha. Dziękujemy następującym agencjom finansującym i fundacjom za wsparcie: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, Donald B. and Delia E. Baxter Foundation, Klingenstein Fund oraz McKnight Endowment for Neuroscience.

Część 1: Usuwanie błony witelinowej
<ol>
<li>Przygotuj dwa zestawy pęset. Zalecamy pęsety nr 5, z czego jeden zestaw powinien być lekko zaostrzony pilnikiem. Przygotuj również szklaną pipetę transferową, przycinając i wypalając końcówkę pipety Pasteura o długości 7".</li>
<li>Zalecenie: Aby zapobiec wyślizgiwaniu się oocytów, wytnij krążek z siatki (oczka 1 mm) i przyklej go do dna szalki Petriego o średnicy 60 mm. Szalkę tę można wielokrotnie wykorzystywać, pod warunkiem zachowania czystości pomiędzy użyciami.</li>
<li>Napełnij szalkę Petriego do połowy roztworem hiperosmotycznym (patrz receptura) i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
<li>Za pomocą wypalanej pipety Pasteura przenieś 1-3 oocyty Xenopus z roztworu inkubacyjnego do szalki.</li>
<li>Odczekaj od 15 s do 2 min, aż komórki zaczną się kurczyć. Dłuższy czas ułatwia usuwanie błony; krótszy czas pozwala uzyskać zdrowsze komórki do patch-clampingu.</li>
<li>W miarę kurczenia się komórki, błona witelinowa stanie się słabo widoczna jako przezroczysta warstwa nad komórką. Wybierz zdrową komórkę (bez zawirowań lub defektów) do usunięcia błony.</li>
<li>Jedną pęsetą delikatnie chwyć błonę witelinową, nie uszkadzając błony plazmatycznej. Drugą pęsetą chwyć błonę w pobliżu tego samego miejsca, a następnie delikatnie rozdar ją i oddziel od komórki.</li>
<li>Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie przenieś komórkę do komory rejestracyjnej. Należy pamiętać, że po usunięciu błony witelinowej komórka staje się krucha.</li>
</ol>
Część 2: Tworzenie gigaseala
<ol>
<li>Napełnij pipetę rejestrującą roztworem soli fizjologicznej. Użyj minimalnej objętości roztworu zapewniającej dobry kontakt elektryczny z drutem elektrody, aby zminimalizować pojemność pipety.</li>
<li>Kilkukrotnie strzepnij pipetę, aby pęcherzyki powietrza wypłynęły i osiadły na drucie elektrody. Wywrzyj ciśnienie na napełnioną pipetę. Można to zrobić ustami lub za pomocą pompy akwariowej. Ciśnienie to jest kluczowe dla utrzymania czystości pipety podczas przechodzenia przez powierzchnię cieczy i przesuwania się w stronę komórki.</li>
<li>Zlokalizuj oocyt w komorze i ostro ustaw ostrość na krawędzi komórki.</li>
<li>Trzymając pipetę poza kąpielą, wycentruj (nieostrą) końcówkę nad komórką. Minimalizuje to czas przebywania w kąpieli przed utworzeniem uszczelnienia.</li>
<li>Obniż pipetę, aż uzyska ostry obraz obok komórki. Przysuń ją w bliską odległość (~50 mikronów). Powinno być widoczne niewielkie zniekształcenie roztworu wypychanego z pipety przez ciśnienie wsteczne.</li>
<li>Używając oprogramowania do patch clampu, sprawdź rezystancję pipety (celem jest około 3-4 MΩ) i wyzeruj prąd za pomocą offsetu napięcia.</li>
<li>Utrzymując dodatnie ciśnienie w pipecie, powoli przesuwaj końcówkę w stronę komórki, monitorując rezystancję wizualnie lub za pomocą monitora audio generującego ton o częstotliwości proporcjonalnej do rezystancji. W momencie, gdy końcówka zacznie dotykać komórki, rezystancja wzrośnie.</li>
<li>Nagle, ale delikatnie, zmień ciśnienie z dodatniego na ujemne o podobnej wartości bezwzględnej. Rezystancja powinna wzrastać aż do momentu utworzenia uszczelnienia.</li>
<li>W większości przypadków utworzenie uszczelnienia następuje w ciągu kilku sekund; sporadycznie wymagane jest 30-60 sekund.</li>
<li>Gdy rezystancja osiągnie 1GΩ, ciśnienie można zredukować do neutralnego. Otrzymano konfigurację on-cell. Aby uzyskać konfigurację inside-out, gwałtownie odciągnij pipetę od komórki. W przypadku konfiguracji outside-out, patrz poniżej.</li>
</ol>
Część 5: Topologia outside-out (opcjonalnie)
<ol>
<li>Natychmiast po uzyskaniu gigauszczelnienia (gigaseal), należy przerwać błonę. Można to zrobić za pomocą silnego ssania, jednak zalecamy użycie impulsu 1 V przez 1 ms. Rezystancja powinna spaść do poziomu nieco wyższego niż początkowa rezystancja pipety.</li>
<li>Należy powoli i płynnie odsunąć pipetę od komórki. Powinien być widoczny fragment komórki wyciągany wraz z pipetą. Nagle, w ciągu kilku sekund, komórka gwałtownie powróci do pierwotnego kształtu, a rezystancja powinna natychmiast i jednocześnie powrócić do poziomu GΩ.</li>
<li>W ten sposób uzyskano płat w konfiguracji outside-out. Ektodomeny wszystkich włączonych kanałów jonowych są teraz wyeksponowane na roztwór w kąpieli.</li>
</ol>
Część 6: Przewidywane wyniki
Zasadniczo preferowane są uszczelnienia o wyższej rezystancji, które charakteryzują się dłuższą trwałością. Wartość 10 GΩ stanowi dobrą wytyczną dla wysokiej jakości uszczelnień. W naszym doświadczeniu szanse na uzyskanie uszczelnień tej jakości zależą od wielu czynników, w szczególności od jakości komórek i pipet. Skuteczność tworzenia patchy może przekraczać 95% przy zastosowaniu zdrowych komórek, czystych pipet oraz doświadczonego badacza. Takie patche mogą być stabilne przez wiele minut i nadają się do dowolnych badań elektrofizjologicznych kanałów jonowych eksprymowanych w oocytach Xenopus, w tym do rejestracji pojedynczych kanałów.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

Istnieje wiele parametrów rejestracji elektrofizjologicznej, których tutaj nie omówiono. Konfiguracja statywu, zarządzanie szumem systemowym, ekspresja kanałów oraz protokoły rejestracji są również krytyczne dla uzyskania dobrych wyników eksperymentalnych.
W naszym doświadczeniu najistotniejszymi parametrami dla utworzenia niezawodnych uszczelnień są: wysokiej jakości oocyty, szybkie usunięcie błony witelinowej (tzw. „obieranie”), stosowanie nowo wyciągniętych pipet chronionych przed kurzem, ...

<table><tbody><tr><td>Wzmacniacz do techniki patch-clamp &amp;oprogramowanie</td><td>Instrument</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>Lub inne podobne urządzenie (np. HEKA EPC-9 lub Axopatch 200B)</td></tr><tr><td>Pincety nr 5 (dwie pary)</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do obkurczania oocytów</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>Składnik Ilość
N-metylo-D-glukamina 220 mM
HEPES 10 mM
MgCl2 1 mM
EGTA 10 mM
Kwas asparginowy 220 mM
KCl 2 mM
pH do 7,4 za pomocą N-metylo-D-glukaminy</td></tr><tr><td>siatka tkana</td><td>800 µm</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach xenopus

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Od czasu opracowania metody przez Sakmanna i Nehera 1, 2, technika patch clamp stała się uznanym i niezwykle użytecznym narzędziem do elektrofizycznych pomiarów pojedynczych lub wielu kanałów jonowych w komórkach. Technikę tę można stosować do badania kanałów jonowych zarówno w ich naturalnym środowisku, jak i w komórkach heterologicznych, takich jak oocyty pobrane z żaby pazurskiej, Xenopus laevis. W niniejszej pracy opisujemy utrwaloną metodę rejestracji patch clamp z oocytów Xenopus. Technika ta jest wykorzystywana do pomiaru właściwości ekspresyjnych kanałów jonowych, zarówno w obrębie populacji (macropatch), jak i pojedynczo (rejestracja pojedynczego kanału). Skupiamy się na metodach maksymalizacji jakości preparowania oocytów oraz tworzenia uszczelnienia (seal). Przy optymalizacji wszystkich czynników technika ta zapewnia prawdopodobieństwo pomyślnego utworzenia uszczelnienia powyżej 90%. Proces ten może być różnie optymalizowany przez poszczególnych badaczy w zależności od czynników, które uznają za najważniejsze; prezentujemy podejście, które w naszej praktyce przyniosło największe sukcesy.

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Od czasu opracowania przez Sakmanna i Nehera 1, 2, metoda patch clamp stała się uznaną i niezwykle użyteczną techniką w elektrofizjologii...

Procedura ta rozpoczyna się od usunięcia błony vilin z Opus Cytes, aby pomyślnie utworzyć uszczelnienia o rezystancji rzędu gigaomów, które są niezbędne do rejestracji metodą patch clamp. Po uzyskaniu konfiguracji patch clamp on-cell, do pipety można przyłożyć podciśnienie, aby uzyskać dostęp elektryczny do cytoplazmy komórki w tzw. konfiguracji whole-cell. Następnie końcówkę pipety można odsunąć od błony plazmatycznej, aż do momentu jej powrotu, aby uzyskać niewielki fragment błony, w którym domeny ekto kanałów są wystawione na roztwór kąpielowy; jest to znane jako konfiguracja outside-out. Cześć, jestem Austin Brown z laboratorium dr Miriam Goodman w Departamencie Fizjologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Stanforda.Jestem Brandon Johnson, również z laboratorium Goodman. W poprzednim filmie pokazaliśmy, jak przygotować pipety do techniki patch clamp oraz mikroelektrody do elektrofizjologii. Dzisiaj przedstawimy wprowadzenie do rejestracji prądów przez kanały jonowe ekspresowane w zpa metodą patch clamp.Od czasu opracowania tej metody przez S. Sacramento i współpracowników pod koniec lat 70. XX wieku, technika patch clamp stała się uznaną i niezbędną metodą elektrofizjo

patch-clamp-recording-of-ion-channels-expressed-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rejestracja Patch Clamp kanałów jonowych ekspresowanych w komórkach jajników Xenopus

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K+ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb+ lub Li+ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Metoda "cut-open Vaseline gap" służy do uzyskiwania niskoszumowych zapisów prądów jonowych i bramkujących z zależnych od napięcia kanałów jonowych wyrażonych w oocytach Xenopus z wysoką rozdzielczością kinetyki szybkich kanałów. Przy niewielkich modyfikacjach fluorometria cęgów napięciowych może być sprzężona z protokołem rozcięcia oocytów.

Technika zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową Xenopus z fluorometrią

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Ten artykuł opisuje ulepszenie konwencjonalnej fluorometrii zaciskowej (VCF), gdzie zamiast barwników maleimidowych stosuje się fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy (fUAA), aby badać strukturalne przegrupowania w kanałach jonowych. Procedura obejmuje iniekcję DNA oocytów Xenopus, koiniekcję RNA/fUAA oraz jednoczesne pomiary prądu i fluorescencji.

Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

W tym artykule omawiamy trzy preparaty mózgowe używane do rejestracji klamer z całych komórek w celu zbadania obwodu siatkówkowego kijanek Xenopus laevis. Każdy preparat, z własnymi specyficznymi zaletami, przyczynia się do eksperymentalnej wykonalności kijanki Xenopus jako modelu do badania funkcji obwodów neuronalnych.

Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania białek połączeniowych w oocytach Xenopus i rejestrowania prądu połączeniowego między dwoma przypisanymi oocytami za pomocą komercyjnego wzmacniacza zaprojektowanego do zapisów napięcia z dwoma oocytami w trybie pomiaru wysokiego prądu bocznego.

Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus

Prezentujemy podstawowe techniki rejestracji metodą patch clamp z błony presynaptycznej w kielichu Held (calyx of Held), który jest zakończeniem nerwowym w centralnym układzie nerwowym ssaków.

Metody pomiarów pojemności metodą patch-clamp w kaliksie

Poznaj technikę patch clamp do badania kanałów jonowych w oocytach Xenopus laevis. Naucz się usuwać błonę witelinową i formować uszczelnienie gigaomowe dla niezawodnych pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Przeglądaj więcej filmów