Name: Wykonywanie pipet krosowych i ostrych elektrod za pomocą programowalnego ściągacza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Naucz się wykonywać pipety krosowe i ostre elektrody do elektrofizjologii za pomocą programowalnego ściągacza. Metoda obejmuje powlekanie woskiem i polerowanie termiczne końcówek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy następującym agencjom finansującym i fundacjom za wsparcie: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, the Donald B. and Delia E. Baxter Foundation, the Klingenstein Fund oraz the McKnight Endowment for Neuroscience.

Wytwarzanie pipet kapilarnych
Za pomocą wyciągarki do mikroelektrod, takiej jak Sutter P-97 Flaming/Brown, wyciągnij zestaw około 10-20 pipet.
<ol>
<li>Wybierz szklaną kapilarę. Stosujemy kapilary borokrzemianowe (Sutter BF150-110-10, średnica zewnętrzna 1,5mm, średnica wewnętrzna 1,1mm, długość 10cm). Przechowuj szkło ostrożnie, aby pozostało czyste i wolne od kurzu.</li>
<li>Opracuj program wyciągania. Stosujemy program 5-stopniowy, z malejącą temperaturą i prędkością na każdym etapie oraz niewielkim wyciągnięciem w ostatnim kroku. Podręcznik do pipet firmy Sutter stanowi doskonały punkt odniesienia przy tworzeniu odpowiednich programów.</li>
<li>Zbadaj końcówki pipet pod mikroskopem, aby określić średnicę otworu oraz gładkość powierzchni. Odrzuć końcówki szorstkie, nierówne lub nieregularne. Prawidłowy protokół wyciągania powinien ograniczyć występowanie takich wad. Dla standardowych pomiarów patch-clamp otwory końcówek powinny mieć średnicę 1-3 mikronów. Stromy stożek (tępa końcówka) prowadzi do niższej rezystancji przy tej samej średnicy otworu. Kształt i rozmiar można zmodyfikować poprzez polerowanie ciśnieniowe.</li>
</ol>
Wypalanie pipet
<ol>
<li>Przygotować zestaw do polerowania (mikrokuźnię) z platynowym włóknem grzejnym sterowanym pedałem nożnym. Odpowiedni zestaw jest dostępny w firmie ALA Scientific (CPM-2), lub podobne urządzenie można złożyć z pojedynczych elementów.</li>
<li>Opcjonalnie: Pokryć pipetę izolatorem, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę szumów. Stosujemy wosk dentystyczny. Inną opcją jest Sylgard 184™ (elastomer poli-dimetylosiloksanowy, znany również jako PDMS).</li>
<li>W przypadku użycia wosku, należy trzymać w pobliżu niewielki zapas w stanie stopionym. Przy zastosowaniu ciśnienia powietrza z tyłu pipety, aby zapobiec dostaniu się wosku do jej wnętrza, należy krótko zanurzyć końcówkę w płynnym wosku, a następnie ją wyjąć. W przypadku Sylgardu należy przechowywać przygotowany elastomer w zamrożonych aliquotach i nanosić go na końcówkę pipety pod mikroskopem. Następnie należy podgrzać próbkę, aby utwardzić elastomer.</li>
<li>Umieścić pipetę (pokrytą izolatorem lub nie) w urządzeniu do polerowania i zbliżyć końcówkę do włókna na odległość ~50 mikronów. Należy pamiętać, że włókno rozszerza się podczas nagrzewania.</li>
<li>Zalecane: Postępować zgodnie z osobnym protokołem „polerowania ciśnieniowego”, aby zmienić kształt pipety w celu uzyskania optymalnej rezystancji i średnicy końcówki.</li>
<li>Krótki impuls cieplny (1-2 sekundy) jest wystarczający, aby usunąć wosk z końcówki pipety i wygładzić szkło.</li>
<li>Gotową pipetę umieścić w zamkniętym pudełku, aby chronić ją przed kurzem; powtórzyć czynność, aż do uzyskania 10 prawidłowych pipet.</li>
</ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Przedstawiony tutaj protokół jest codziennie stosowany w laboratoriach elektrofizjologii, a także służy do wykonywania igieł iniekcyjnych dla komórek i zwierząt. Dzięki programowalnemu wyciągaczowi (pullerowi) łatwo jest przygotować pipety do różnych zastosowań.&nbsp; Przy zachowaniu uwagi i staranności włókno w wyciągaczu wytrzyma rok lub dłużej.&nbsp; Powodzenia w eksperymentach.

<table><tbody><tr><td>Wytwornica micropipet</td><td>Instrument</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Lub podobny instrument (np. Sutter P-87 lub P-2000)</td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>Odczynnik</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>Lub podobne szkło kapilarne. Aby ułatwić napełnianie pipety, należy użyć kapilary z włóknem szklanym.</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie pipet do patch-clamp oraz mikroelektrod za pomocą programowalnej wyciągarki

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Szklane mikroelektrody (nazywane również pipetami) od dziesięcioleci stanowią podstawowe narzędzie w elektrofizjologii. Obecnie takie pipety wykonuje się z kapilar szklanych przy użyciu programowalnego wyciągacza. Instrumenty te ogrzewają kapilarę za pomocą włókna metalowego lub lasera i wyciągają szkło, wykorzystując grawitację, silnik lub obie te metody jednocześnie. Pipety do rejestracji metodą patch-clamp formuje się wyłącznie za pomocą ciepła i grawitacji, natomiast ostre elektrody do rejestracji wewnątrzkomórkowej wymagają kombinacji ciepła, grawitacji i silnika. Procedura wytwarzania pipet do rejestracji wewnątrzkomórkowej jest zbliżona do tej stosowanej przy produkcji igieł iniekcyjnych do różnych zastosowań, w tym do wstrzykiwania cRNA do oocytów Xenopus. Zazwyczaj do produkcji pipet do rejestracji patch-clamp stosuje się szkło kapilarne o średnicy &lt;1.2 mm, natomiast do rejestracji wewnątrzkomórkowej używa się węższego szkła (średnica zewnętrzna = 1.0 mm). Dla każdego narzędzia wyciągacz jest programowany nieco inaczej. W niniejszym materiale wideo pokazano, jak wykonać oba rodzaje pipet rejestracyjnych, korzystając z wcześniej ustalonych programów wyciągacza.

W tym filmie pokazano, jak używać programowalnej wyciągarki do wykonywania pipet do patch-clampu oraz ostrych elektrod do elektrofizjologii. Tę samą procedurę można zastosować do wykonania różnych narzędzi szklanych, w tym igieł do iniekcji.

Wytwarzanie pipet do patch-clamp oraz mikroelektrod za pomocą programowalnej wyciągarki

Szklane mikroelektrody (nazywane również pipetami) od dziesięcioleci stanowią podstawowe narzędzie w elektrofizjologii. Obecnie takie pipety wykonuje się z kapilar szklanych...

Szklane pipety kapilarne stały się powszechne w laboratoriach w szerokim zakresie technik, takich jak elektroporacja pojedynczych komórek, mikroiniekcja DNA oraz elektrofizjologia patch clamp. Aby przygotować szklane elektrody kapilarne do rejestracji patch clamp, wyciąga się szkło krzemianowe na programowalnym wyciągaczu. Końcówki elektrod pokrywa się woskiem, a następnie poddaje się je polerowaniu ogniowemu i przechowuje do późniejszego użycia. Witajcie, jestem Miriam Goodman z Departamentu Fizjologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Stanforda.W tym filmie zaprezentuję sposób przygotowania pipet do techniki patch clamp oraz mikroelektrod ostrych do elektrofizjologii. Szklane mikroelektrody, nazywane również pipetami, od dziesięcioleci stanowią podstawowe narzędzie w elektrofizjologii. Obecnie pipety te wykonuje się z kapilar szklanych przy użyciu programowalnego wyciągacza.Zacznijmy zatem. Do wykonania pipet do techniki patch-clamp wykorzystujemy kapilary borokrzemianowe, które są czyste i wolne od kurzu, oraz mikroelektrodowy wyciągacz Sutter P-97. Książka Sutter's Pipette Cookbook stanowi doskonały materiał referencyjny przy opracowywaniu odpowiednich programów wyciągania.Na początek podnieś osłonę przeciwkurzową wyciągacza. Następnie wyjmij jedną szklaną kapilarę z pudełka. Pamiętaj o ponownym zamknięciu pokrywy, aby zminimalizować gromadzenie się kurzu.Następnie, jedną ręką wsuń kapilarę w rowek po jednej stronie włókna i lekko dokręć zacisk. Na tym etapie zacisk powinien być wystarczająco mocny, aby zapobiec wypadnięciu rurki, ale na tyle luźny, by można było ją wsunąć w rowek. Teraz zwolnij sprężynowy ogranicznik metalowy po tej samej stronie.Następnie kciukiem i palcem wskazującym chwyć metalowe zakładki przymocowane do spodu obu nośników. Zwolnij drugi sprężynowy ogranicznik. Przyciągnij nośniki do siebie tak daleko, jak to możliwe, i przytrzymaj je jedną ręką.Następnie przesuń probówkę przez obudowę włókna do rowka nośnika po drugiej stronie. Unikaj wpychania szkła w włókno grzejne. Zaciśnij zaciski po obu stronach.Powinny być one wystarczająco ciasne, aby utrzymać nośniki na miejscu, ale nie tak ciasne, by zmiażdżyć szkło. Teraz zamknij osłonę przeciwpyłową i naciśnij zielony przycisk. Pipetki do rejestracji patch-clamp z zaznaczonymi biegunami są formowane przy użyciu pięciostopniowego programu wyciągania z malejącą temperaturą i prędkością na każdym etapie oraz utworzeniem małego bieguna w ostatnim kroku.Program ten wykorzystuje ciepło i grawitację. Procedura wytwarzania ostrych elektrod jest bardzo podobna, jednak w tym przypadku używamy cienkiej kapilary szklanej firmy Warner Instruments o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,78 mm. Po zakończeniu programów wyciągania stosujemy również program wyciągania, który oprócz ciepła i grawitacji wykorzystuje silnik.Podnieś osłonę przeciwkurzową, poluzuj oba zaciski i wyjmij gotową pipetę. Następnie umieść pipety w pudełku roboczym. Pudełko można wykonać, przyklejając pasek pianki do statywu plastikowego pudełka na końcówki do pipet, a następnie wycinając w piance od sześciu do ośmiu nacięć.Włóż pipety do szczelin. Po zapełnieniu pudełka wyciągniętymi pipetami przejdź do etapu polerowania ogniowego w celu wypolerowania pipet. Przed rozpoczęciem polerowania ogniowego przygotuj zestaw mikrokucia z platynowym włóknem grzejnym sterowanym pedałem.Najpierw pokryj pipetę woskiem dentystycznym, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę szumów. W tym celu przygotuj w pobliżu niewielki zapas roztopionego wosku. Wywieraj ciśnienie powietrza z tyłu pipety, aby zapobiec przedostaniu się wosku do końcówki.Następnie zanurz końcówkę na krótko w płynnym wosku. Teraz ją wyjmij. Umieść pipetę w urządzeniu polerującym i zbliż końcówkę na odległość około 50 microns od włókna.Należy pamiętać, że włókno rozszerzy się podczas podgrzewania. Zastosuj krótki impuls ciepła trwający jedną lub dwie sekundy, aby usunąć wosk z końcówki pipety i wygładzić szkło. Obejrzyj końcówki pipet pod mikroskopem, aby określić średnicę otworu oraz gładkość powierzchni.W przypadku standardowych pomiarów metodą patch clamp otwory końcówek powinny mieć średnicę od jednej do trzech mikronów; należy odrzucić końcówki szorstkie, nierówne lub nieregularne. Gotową pipetę należy umieścić w pudełku roboczym, upewniając się, że pokrywa jest zamknięta, aby chronić pipety przed kurzem; powtórzyć czynność dla 10 prawidłowo wykonanych pipet. Przedstawiłem właśnie sposób wykonania pipet do metody patch clamp oraz mikroelektrod ostrych przy użyciu programowalnej wyciągarki.Tę samą procedurę można wykorzystać do wykonania różnych narzędzi szklanych, w tym igieł do mikroiniekcji, w celu uzyskania optymalnych wyników w technice patch clamp. Ważne jest, aby wyciągać nowe, wolne od zanieczyszczeń pipety w dniu przeprowadzenia eksperymentu i polerować je w ciągu godziny przed badaniem. Należy również sprawdzić w ramach inspekcji, czy pipety są gładkie i wypolerowane.Koniecznie obejrzyj nasz inny film, który demonstruje, jak przeprowadzić rejestrację patch-clamp kanałów jonowych wykazujących ekspresję w oocytach opus. To wszystko. Teraz jesteś ekspertem w posługiwaniu się pipetą, życzymy powodzenia w Twoich eksperymentach.

making-patch-pipettes-and-sharp-electrodes-with-a-programmable-puller

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wytwarzanie pipet płaszczyznowych i ostrych elektrod za pomocą programowalnego urządzenia do ściągania

Niniejszy przewodnik opisuje metodę modyfikacji kształtu szklanych mikropipet. W szczególności, poprzez zastosowanie ciepła i ciśnienia powietrza, poszerza się zwężenie pipety bez zwiększania otworu końcówki, co prowadzi do obniżenia oporu pipety. Jest to kluczowe dla uzyskania pomiarów o niskim poziomie szumów w małych komórkach, lecz znajduje zastosowanie w wielu innych obszarach.

Polerowanie pipet pod ciśnieniem w celu poprawy jakości rejestracji metodą patch-clamp

Planarne dwuwarstwy lipidowe, nazywane również sztucznymi dwuwarstwami lipidowymi, pozwalają na badanie kanałów przewodzących jony w ściśle określonym środowisku. W niniejszym materiale prezentujemy poszczególne kroki niezbędne do przygotowania komory do dwuwarstw, elektrod oraz sposób sprawdzenia, czy dwuwarstwa nadaje się do pomiarów pojedynczych kanałów.

Przygotowanie sztucznych dwuwarstw do eksperymentów elektrofizjologicznych

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

Jontoforeza agonistów i antagonistów neuronalnych podczas zewnikomórkowych rejestracji in vivo jest potężnym sposobem manipulowania mikrośrodowiskiem neuronu. Manipulacje te można najłatwiej przeprowadzić za pomocą wielokanałowych elektrod typu „piggy-back”. W niniejszej pracy opisujemy sposób ich wykonania oraz zastosowania podczas rejestracji słuchowych.

Wytwarzanie i zastosowanie wielokanałowych elektrod typu „piggy-back” do farmakologicznych manipulacji odpowiedziami neuronalnymi in vivo

Wieloelektrodowe nagrania patch-clamp stanowią skomplikowane zadanie. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób, poprzez automatyzację wielu etapów eksperymentu, można przyspieszyć proces prowadzący do jakościowej poprawy wydajności i liczby nagrań.

Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych.  Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych.  W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę bezpośredniego pomiaru aktywności kanałów jonowych na wewnątrzkomórkowych pęcherzykach za pomocą ręcznego endolizosomalnego systemu patch-clamp. Ilustrujemy metodę polegającą na powiększaniu endolizosomów i ręcznym izolowaniu tych pęcherzyków. Takie podejście gwarantuje, że badacze mogą dokładnie odtworzyć i zastosować procedurę.

Techniki patch-clamp do analizy pojedynczych pęcherzyków endolizosomalnych

Naucz się wykonywać pipety krosowe i ostre elektrody do elektrofizjologii za pomocą programowalnego ściągacza. Metoda obejmuje powlekanie woskiem i polerowanie termiczne końcówek.

Wytwarzanie pipet do patch-clamp oraz mikroelektrod za pomocą programowalnej wyciągarki

Przeglądaj więcej filmów