Wykonywanie pipet krosowych i ostrych elektrod za pomocą programowalnego ściągacza

Szklane pipety kapilarne stały się wszechobecne w laboratoriach w wielu różnych technikach, takich jak elektroporacja pojedynczych komórek, mikroiniekcja DNA i elektrofizjologia patch clamp Aby przygotować szklane kapilarne elektrody zaciskowe do nagrań lub szkło krzemianowe jest naciągane na programowalny biegun. Końcówki elektrod są pokrywane woskiem, a następnie końcówki są polerowane ogniowo i przechowywane do wykorzystania w przyszłości. Cześć, nazywam się Miriam Goodman i pracuję na Wydziale Fizjologii Molekularnej i Komórkowej Uniwersytetu Stanforda.

W tym filmie pokażę, jak zrobić pipety z zaciskiem krosowym i ostre elektrody do elektrofizjologii. Szklane mikroelektrody, zwane również pipetami, od dziesięcioleci są koniem pociągowym elektrofizjologii. Obecnie pipety te są wykonane ze szklanych kapilar za pomocą programowalnego pociągnięcia.

Więc zacznijmy. Do produkcji pipet z zaciskiem krosowym używamy jedwabiu dzika Sutter w kapilarach, które są czyste i wolne od kurzu, a także używamy ściągacza mikroelektrod Sutter P nine seven z płomieniami szlifowanymi. Książka kucharska Sutter's Pipette Cookbook jest doskonałym źródłem informacji przy opracowywaniu odpowiednich programów ciągnięcia.

Aby rozpocząć, podnieś osłonę przeciwpyłową ze ściągacza. Następnie wyjmij jedną szklaną rurkę kapilarną z pudełka. Pamiętaj, aby założyć pokrywę, aby zminimalizować gromadzenie się kurzu.

Następnie jedną ręką wsuń kapilarę w rowek po jednej stronie filamentu, lekko dokręć zacisk. W tym momencie zacisk powinien być na tyle ciasny, aby zapobiec upadkowi rurki, ale na tyle luźny, aby można go było wsunąć w rowek. Teraz zwolnij metalowy ogranicznik sprężyny po tej samej stronie.

Następnie kciukiem i palcem wskazującym chwyć metalowe wypustki, które są przymocowane do spodu obu nośników. Zwolnij drugi metalowy ogranicznik sprężyny. Ściągnij nosidełka do oporu i przytrzymaj je jedną ręką.

Następnie wsuń rurkę przez obudowę filamentu w rowek nośnika po drugiej stronie. Unikaj wciskania szkła w żarnik grzewczy. Dokręć zaciski po obu stronach.

Powinny być wystarczająco ciasne, aby utrzymać nośniki na miejscu, ale nie na tyle mocno, aby szkło zostało zgniecione. Teraz zamknij osłonę przeciwpyłową i naciśnij zielony przycisk. Pipety z oznaczonymi biegunami do nagrań z zaciskiem krosowym są formowane przy użyciu pięciostopniowego programu odpytywania z malejącym ciepłem i prędkością na każdym kroku oraz małą tyczką na ostatnim kroku.

Ten program wykorzystuje ciepło i grawitację. Procedura wykonywania ostrych elektrod jest bardzo podobna, ale w tym przypadku używamy cienkiej szklanej kapilary firmy Warner Instruments, która ma średnicę zewnętrzną jednego milimetra i średnicę wewnętrzną 0,78 milimetra. Stosujemy również program ciągnący, który wykorzystuje silnik oprócz ciepła i grawitacji po zakończeniu programów ciągnięcia.

Podnieś osłonę przeciwpyłową, poluzuj oba zaciski i wyjmij gotową pipetę. Następnie umieść pipety w działającym pudełku. Pudełko można wykonać, przyklejając pasek pianki do stojaka plastikowego pudełka na końcówki do pipet, a następnie wycinając od sześciu do ośmiu szczelin w piance.

Włóż pipety do szczelin. Gdy pudełko jest pełne wyciągniętych pipet, przejdź do etapu polerowania ogniowego, aby wypolerować pipety na ogień. Ustaw zestaw do mikro kuźni z platynowym żarnikiem grzewczym sterowanym za pomocą pedału nożnego przed rozpoczęciem polerowania ognia.

Najpierw pokryj pipetę woskiem dentystycznym, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę hałasu. Aby to zrobić, trzymaj w pobliżu niewielki zapas stopionego wosku. Wywieraj nacisk na tylną część pipety, aby zapobiec przedostawaniu się wosku do końcówki.

Następnie zanurz na chwilę końcówkę w płynnym wosku. I usuń teraz. Umieść pipetę w aparacie do polerowania i wyjmij końcówkę na około 50 mikronów z filamentu.

Należy pamiętać, że żarnik rozszerzy się po podgrzaniu. Zastosuj krótki impuls cieplny trwający jedną lub dwie sekundy, aby usunąć wosk z końcówki pipety i wygładzić szklankę. Zbadaj końcówki pipet pod mikroskopem, aby określić średnicę otworu i gładkość.

W przypadku standardowych nagrań z zaciskiem krosowym otwory końcówki powinny mieć średnicę od jednego do trzech mikronów, odrzucone, szorstkie, nierówne lub nieregularne końcówki. Umieść gotową pipetę w pojemniku roboczym, upewniając się, że zamykasz pokrywę, aby chronić pipety przed kurzem Powtórz dla 10 udanych pipet. Właśnie pokazałem Ci, jak zrobić pipety z zaciskiem krosowym i ostre elektro za pomocą programowalnego ściągacza.

Ta sama procedura może być stosowana do wytwarzania różnych szklanych narzędzi, w tym igieł iniekcyjnych, w celu uzyskania optymalnych wyników zaciskania kropek. Ważne jest, aby pamiętać o wyciągnięciu nowych pipet bezpyłowych tego samego dnia eksperymentu i wypolerowaniu ich w ciągu godziny od eksperymentu. Sprawdź również podczas inspekcji, czy pipety są gładkie i wypolerowane.

Koniecznie obejrzyj nasz drugi film, który pokazuje, jak wykonać zapis patch clamp kanałów jonowych ulegających ekspresji w oocytach opus. Dobra, to wszystko. Teraz jesteś ekspertem od pipet i życzymy powodzenia w eksperymentach.