Metoda barwienia przeciwciałami całych preparatów u kurczaka

Niniejszy film prezentuje poszczególne etapy immunohistochemii całego preparatu (whole mount) u zarodka kurczaka z wykorzystaniem przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP. Najpierw zarodek zostaje utrwalony w paraformaldehydzie, a następnie neutralizuje się endogenną aktywność peroksydazy.

Następnie zarodek inkubuje się z przeciwciałem pierwszorzędowym. Po kilku etapach przemywania zarodek inkubuje się z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP. Reakcję barwną wywołuje się przy użyciu substratu DAB, w wyniku czego barwienie przeciwciałami przybiera kolor pomarańczowy. Przewagą tej metody nad zastosowaniem przeciwciał fluorescencyjnych jest możliwość przygotowania zarodków do cięcia w parafinie, co umożliwia badanie lokalizacji antygenów w przekroju poprzecznym.

Cześć, jestem Delphine z Laboratorium FIN w Centrum Medycyny Środowiskowej i Genomowej na Texas A&M w Houston. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykonywania barwień przeciwciałami w preparatach embrionów kurzych z wykorzystaniem przeciwciał sprzężonych z HRP. Stosujemy tę procedurę w laboratorium w celu badania morfologii embrionów po podaniu leków przeciwdrgawkowych.

Przejdźmy zatem do rozpoczęcia procedury immunohistochemii całego preparatu (whole mount) embrionów kurczaka. Najpierw otwórz jajko, delikatnie opukując skorupkę pęsetą i usuwając jej fragmenty. Usuń grubą warstwę albuminy za pomocą pęsety, a następnie przechyl worek żółtkowy pęsetą chirurgiczną tak, aby embrion był skierowany ku górze.

Następnie użyj ostrych nożyczek, aby wyciąć kwadrat z worka żółtkowego wokół embrionu. Wyjmij embrion z żółtka za pomocą łyżeczki i umieść go w naczyniu z PBS pod mikroskopem stereomikroskopowym. Ostrożnie usuń błony żółtkowe i przenieś embrion do nowego naczynia zawierającego PBS.

Po przeniesieniu zarodka, unieruchom go za pomocą pęsety i szpilek entomologicznych, a następnie odessaj PBS. Zastąp go 4% PFA w PBS i pozostaw zarodek do utrwalenia na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować potencjalną kontaminację mikrobiologiczną. W każdym z kolejnych kroków po utrwaleniu zarodka stosuj dejonizowaną H2O; odessaj roztwór utrwalający i zutylizuj go zgodnie z procedurami dotyczącymi odpadów chemicznych.

Napełnij naczynie roztworem BS. Następnie, używając noża do mikrosekcji, wytnij kwadrat wokół embrionu, aby usunąć dodatkowe błony pozazarodkowe. Po wyjęciu szpilek entomologicznych usuń je za pomocą pincety. Użyj pipety Pasteura z tępym końcem, aby przenieść embrion do fiolki scyntylacyjnej zawierającej PBT.

Przemyć embrion PBT trzykrotnie przez 10 minut za każdym razem. Usunąć PBT z fiolki scyntylacyjnej i zastąpić go PBTX zawierającym 0,3%H 2 0 2 w celu inaktywacji potencjalnej endogennej peroksydazy. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze.

Zmyć zarodek w PBT najpierw trzy razy przez 10 minut każde płukanie, a następnie trzy razy przez 30 minut każde płukanie. Aby przeprowadzić barwienie zarodka przeciwciałem, należy rozpocząć od inkubacji zarodka przez jedną godzinę w buforze blokującym lub w 1% BSA 1% NGS.

Stosujemy NGS, ponieważ przeciwciało wtórne zostało wytworzone u kozy. Inkubować na mutatorze przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji rozcieńczyć przeciwciało pierwotne w stosunku jeden do jednego w buforze blokującym i inkubować embrion w tym roztworze przez dwa dni w temperaturze 4 °C. Na mutatorze.

Współczynnik rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego zależy od wybranego przeciwciała. W tym przypadku stosujemy przeciwciało z banku hybrydomy DOMA wykorzystywanej w badaniach nad rozwojem, dostarczone w formie nadsączu. Rozcieńczamy je w stosunku jeden do jednego w buforze blokującym.

Następnie przeprowadź trzy 10-minutowe płukania w PBT, a następnie trzy godzinną płukania w PBT. Po płukaniu rozcieńcz przeciwciało wtórne w stosunku 1:2 500 w buforze blokującym. W tym przypadku zastosowano koniugat peroksydazy z kozim przeciwciałem anty-US IgG; inkubuj embrion w tym roztworze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze.

Przeprowadzić trzy 10-minutowe płukania w buforze PBT, a następnie trzy jednogodzinne płukania w PBT, aby rozwinęła się reakcja barwna zbarwionego zarodka. Dwa pierwsze 20-minutowe płukania wykonać w buforze TRIS (100 mM TRIS, HCl pH 7,4). Następnie usunąć ostatnią porcję buforu TS z probówki zawierającej zarodek i zastąpić ją pięcioma mililitrami roztworu DAB.

Przechowuj w ciemności na mutatorze przez 20 minut. Pozbądź się końcówki einor do wiadra zawierającego 10% roztwór wybielacza. W celu dekontaminacji DAB dodaj 16 µL.

Dodaj H₂O₂ do probówki zawierającej embriony w DAB. Przechowuj w ciemności. Po 10 minutach monitoruj reakcję pod mikroskopem, aż reakcja barwna zostanie zakończona. Zutylizuj DAB w wiadrze z wybielaczem, a następnie uzupełnij pięcioma mililitrami.

Woda z kranu. Następnie przeprowadź dwa 10-minutowe płukania w PBS w celu przygotowania do fotografii i cięcia w wosku. Odwodnij zbarwiony zarodek w serii etanolu o stężeniach 25%, 50%, 75% i 100% przez 10 minut w każdym z nich.

Po odwodnieniu zastąpić etanol od 0,5 do 1 ml olejku cedrowego. Dzięki temu embrion stanie się przezroczysty, co umożliwi fotografowanie w olejku cedrowym. Po wykonaniu zdjęć przenieść embrion z powrotem do fiolki i zastąpić olejek cedrowy 100% etanolem.

Na koniec zastąpić etanol 5% fast green FCF w 100% etanolu i inkubować przez trzy minuty. Ten etap sprawi, że embriony będą widoczne podczas badania histologicznego. Zastąpić roztwór fast green FCF 100% etanolem i poddać dalszej obróbce do analizy histologicznej.

Oto trzy przykłady barwionych embrionów. Te embriony w stadium 11 zostały znakowane przeciwciałem 15.3 B nine lub nie. Jest to przeciwciało specyficzne dla sznura węzłowego, opracowane w laboratorium Jane dod i Toma Gessela.

Po dwóch minutach w DAB zarodek nadal pozostaje przezroczysty. Po 20 minutach w DAB w sznurze węzłowym pojawia się słabe znakowanie. Ostatecznie, po 40 minutach, znakowanie sznura węzłowego jest kompletne.

W tym przykładzie pokazujemy, jak przeciwciało PAC seven, opracowane w laboratorium Toma Jessela, rozpoznaje wczesne etapy zamykania rurki nerwowej, a także komórki grzebienia neuralnego czaszki wywodzące się z mózgu śródmózgowia. Tutaj embrion został oznakowany sondą Croc 20 z laboratorium Davida Wilkinsona, a następnie jednym przeciwciałem. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania pełnej immunohistochemii w embrionach.

Tę procedurę można również zastosować do embrionów, które zostały wcześniej poddane hybrydyzacji in situ w całym preparacie. W takim przypadku należy krótko utrwalić embrion przez jedną godzinę po hybrydyzacji in situ, a następnie przejść do barwienia przeciwciałami. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w eksperymentach.