Name: Metoda barwienia przeciwciał w całej górze u piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemii całego preparatu u piskląt z zastosowaniem przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP. Technika ta umożliwia wizualizację wzorców ekspresji antygenów w embriogenezie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przeciwciała monoklonalne (15.3B9, PAX7) opracowane przez ( J. Dodd, T.M Jessell oraz A. Kawakami) zostały pozyskane z Developmental Studies Hybridoma Bank, stworzonego pod auspicjami NICHD i utrzymywanego przez University of Iowa, Department of Biological sciences, Iowa. D.P jest laureatem nagrody Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1 przyznanej przez National Institute on Drug Abuse. Praca ta była wspierana przez Margaret M. Alkek Foundation dla RHF.

I. Przegląd schematyczny:
W niniejszym filmie zaprezentowano poszczególne etapy immunohistochemii w preparatach całych zarodków kurzych. Najpierw zarodek zostaje utrwalony w PFA [IHC1]. Następnie wygasza się endogenną aktywność peroksydazy [IHC2]. Potem zarodek poddaje się inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym [IHC3]. Po kilku etapach przemywania zarodek inkubuje się z przeciwciałem drugorzędowym [IHC4]; reakcję barwną ujawnia się przy użyciu DAB [IHC5], a barwienie przeciwciałami przybiera kolor pomarańczowy [IHC6].
<img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_3/figure%201.png" alt="Schemat procesu immunohistochemicznego; aplikacja przeciwciał, barwienie, etapy wizualizacji." width="600" height="573" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 1">
Część 1: Fixowanie embrionów
<ol>
<li>Aby przeprowadzić immunohistochemię całych preparatów embrionów kurczęt, najpierw otwórz jajo, delikatnie stukając w skorupkę pęsetą i usuwając jej fragmenty.</li>
<li>Za pomocą pęsety usuń gęste białko jaja, a następnie za pomocą pęsety anatomicznej przechyl worek żółtkowy tak, aby embrion był skierowany ku górze.</li>
<li>Używając precyzyjnych nożyczek, wytnij kwadrat z worka żółtkowego wokół embrionu. Usuń embrion z żółtka za pomocą łyżeczki i umieść go w naczyniu zawierającym PBS.</li>
<li>Pod mikroskopem sekcyjnym ostrożnie usuń błony oraz resztki żółtka, a następnie przenieś embrion do nowego naczynia z PBS.</li>
<li>Unieruchom embrion pęsetą i szpilkami entomologicznymi, a następnie odessaj PBS. Zastąp go 4% PFA w PBS i pozostaw embrion do utrwalenia na 1h w RT.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie embrionów do etapu inkubacji z przeciwciałami
<ol>
<li>Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego, we wszystkich poniższych krokach należy używać ddH2O.</li>
<li>Po utrwaleniu zarodka odessać roztwór utrwalający i zutylizować go zgodnie z procedurami dla odpadów chemicznych. Napełnić szalkę PBS.</li>
<li>Następnie, używając nożyka do mikrodysekcji, wyciąć kwadrat wokół zarodka, aby usunąć błony pozazarodkowe. Usunąć szpilki entomologiczne za pomocą pęsety.</li>
<li>Po usunięciu szpilek przenieść zarodek za pomocą pipety Pasteura z zaokrąglonym końcem do fiolki scyntylacyjnej zawierającej PBT (PBS pH 7.4, 0.5% Triton X).</li>
<li>Przemyć zarodek w PBT trzykrotnie po 10 minut za każdym razem.</li>
<li>Usunąć PBT z fiolki scyntylacyjnej i zastąpić go roztworem PBTx zawierającym 0.3% H2O2 w celu inaktywacji potencjalnej endogennej peroksydazy.</li>
<li>Inkubować przez 2 hr w RT na nutatorze.</li>
<li>Przemyć zarodek w PBT trzykrotnie po 10 minut, a następnie trzykrotnie po 30 minut za każdym razem.</li>
</ol>
Część 3: Inkubacja z przeciwciałami
<ol>
<li>Aby przeprowadzić barwienie zarodka przeciwciałem, należy rozpocząć od płukania zarodka przez jedną godzinę w buforze blokującym lub 1% BSA/1% NGS/PBT (stosujemy NGS, ponieważ przeciwciało wtórne zostało wytworzone u kozy). Inkubować na nutatorze przez jedną godzinę w RT.</li>
<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne w stosunku 1:1 w buforze blokującym i inkubować zarodek w tym roztworze przez 2 dni w 4°C na nutatorze. Współczynnik rozcieńczenia przeciwciała pierwotnego zależy od wybranego przeciwciała. W tym przypadku stosujemy przeciwciało z Developmental Studies Hybridoma Bank, które jest dostarczane w formie supernatantu. Rozcieńczamy je 1:1 w buforze blokującym.</li>
<li>Następnie przeprowadzić 3 10-minutowe płukania w PBT, a następnie 3 1-godzinne płukania w PBT.</li>
<li>Po płukaniu rozcieńczyć przeciwciało wtórne 1:2500 w buforze blokującym (w tym przypadku peroksydazą sprzężone przeciwciało kozie anty-mysie IgG (H+L)) i inkubować zarodek w tym roztworze O/N w 4°C na nutatorze.</li>
<li>Przeprowadzić 3 10-minutowe płukania w PBT, a następnie 3 1-godzinne płukania w PBT.</li>
</ol>
Część 3: Reakcja barwna
<ol>
<li>Aby wywołać reakcję barwną w zbarwionym embrionie, należy najpierw przeprowadzić dwa 20-minutowe przemycia w buforze Tris (100mM Tris HCl, pH 7.4).</li>
<li>W międzyczasie rozpuścić substrat DAB (tetrahydrochlorek 3,3’-diaminobenzydyny) w buforze Tris w stężeniu 500μg/ml pod wyciągiem; roztwór przechowywać w ciemności, w lodzie.</li>
<li>Usunąć ostatnią porcję buforu Tris z probówki zawierającej embrion i zastąpić ją 5ml roztworu DAB z kroku 3.2. Przechowywać w ciemności na nutatorze przez 20 mn. Zużyty końcówkę do pipety Eppendorf wyrzucić do pojemnika z 10% roztworem wybielacza w celu dekontaminacji DAB.</li>
<li>W międzyczasie przygotować w lodzie roztwór stokowy 0.3% H2O2 w dH2O.</li>
<li>Dodać 50μl roztworu stokowego H2O2 do probówki zawierającej embriony w DAB. Przechowywać w ciemności. Po 1-2 minutach monitorować reakcję pod mikroskopem.</li>
</ol>
Część 4: Przetwarzanie zarodków do fotografii i histologii
<ol>
<li>Po zakończeniu reakcji barwnej zutylizować DAB w wiadrze z wybielaczem. Zastąpić go 5 ml wody z kranu.</li>
<li>Przeprowadzić dwa 10-minutowe przemycia w PBS.</li>
<li>W celu przygotowania do fotografii i cięcia w parafinie, odwodnić w serii etanolu (25%, 50%, 75% i 100%) po 10 minut w każdym stężeniu.</li>
<li>Zastąpić etanol 0,5 - 1 ml olejkiem cedrowym (sprawi to, że embrion stanie się przezroczysty). Wykonać dokumentację fotograficzną w olejku cedrowym.</li>
<li>Po fotografii umieścić embrion z powrotem w fiolce i zastąpić olejek cedrowy 100% etanolem. Powtórzyć etapy odwadniania w etanolu.</li>
<li>Zastąpić etanol 5% Fast green FCF w 100% etanolu i inkubować przez 3 minuty (ten etap sprawi, że embriony będą widoczne podczas badania histologicznego). Zastąpić roztwór Fast green FCF 100% etanolem i przygotować preparaty do histologii.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_2/figure2.png" alt="Etapy rozwoju zarodka, obraz mikroskopowy, analiza formowania rurki neuralnej i somytów." width="600" height="498" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 2">
Na poniższych przykładach zarodki zostały poddane sekcji na etapach HH 10 (A), 12 (B) oraz 11 (C); zarodki wykazują ekspresję PAX 7 w powstających grzebieniach neuronalnych, a także w somytach i rurce neuralnej (A,B); na zdjęciu (C) struna grzbietowa jest oznakowana przeciwciałem 15.3B9 (Not-1) (przeciwciała dostarczone przez Developmental Studies Hybridoma Bank).

<ol><li>Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+developing+nervous+system%3A+Polarizing+activity+of+the+floor+plate+and+notochord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord.</a> Cell. 64, 635-647 (1991).</li>
<li>Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+HGF%2FSF+in+neural+induction+and+its+expression+in+Hensen%27s+node+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation.</a> Development. 121, 813-824 (1995).</li>
<li>Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li>
</ol>

W niniejszym filmie zaprezentowano poszczególne etapy przeprowadzania barwienia przeciwciałami całych preparatów (whole-mount) w młodych embrionach kurzych. Protokół ten jest stosowany przede wszystkim do przestrzennej i czasowej charakterystyki nowych przeciwciał u kurcząt 2,3, a także do wykorzystania znanych markerów antygenowych w celu określenia malformacji embrionalnych po wystąpieniu czynnika uszkadzającego 4.

<table><tbody><tr><td>Jaja</td><td></td><td>Charles River Laboratories</td><td>Premium Fertile</td><td>Zapłodnione, HH4 (16 hr)</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5 lub podobny</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny inkubator Marsh</td><td>Inne</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta zakrzywiona (1)</td><td>Narzędzie</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta (2)</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki precyzyjne</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>Szalki plastikowe</td><td>Narzędzie</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Gruszka gumowa</td><td>Narzędzie</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara Pasteura</td><td>Narzędzie</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70950-12</td><td>zaokrąglona krawędź nad płomieniem</td></tr><tr><td>Nóż do mikrodyssekcji</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>Służy do wycięcia zarodka z otaczających błon po fiksacji</td></tr><tr><td>Sylgard 184 utwardzacz i baza elastomeru silikonowego</td><td>Odczynnik</td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>Wymieszać 1 część utwardzacza i 9 części bazy; utwardzać przez noc w 37°C</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>Odczynnik</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Odczynnik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td><td>Odczynnik</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4G11, 15.3B9, PAX7</td><td>W przypadku tych przeciwciał badacze wykorzystali donory mysie</td></tr><tr><td>Koniugowana z peroksydazą przeciwciała kozie przeciw mysim IgG (H+L)</td><td>Odczynnik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzydyna tetrahydrochlorek</td><td>Odczynnik</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34001</td><td>Przechowywać w -20°C; przed użyciem doprowadzić butelkę do temperatury pokojowej.</td></tr><tr><td>Olejek cedrowy</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W522503</td><td></td></tr><tr><td>Fast green FCF</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki minutowe 0,2 mm średnicy</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda barwienia przeciwciałami całych preparatów u kurczaka

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Embryon kurczaka jest cennym narzędziem w badaniach wczesnego rozwoju embrionalnego. Jego przezroczystość, łatwość dostępu i możliwość manipulacji czynią go idealnym obiektem do badań ekspresji przeciwciał w rozwijającym się mózgu, rurze nerwowej i somitach. Wideo to pokazuje poszczególne etapy barwienia przeciwciał w całości przy użyciu przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP; po pierwsze, embrion jest wycinany z jajka i utrwalany w paraformaldehydzie. Po drugie, endogenowa peroksydaza jest dezaktywowana; następnie embrion jest narażany na działanie przeciwciała pierwotnego. Po kilku przemywkach embrion inkubuje się z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP. Aktywność peroksydazy ujawnia się poprzez reakcję z substratem diaminobenzydyną. Na koniec embrion jest utrwalany i przygotowywany do fotografii oraz sekcjonowania. Zaletą tej metody w porównaniu z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych jest możliwość przygotowania embrionów do sekcjonowania w parafinie, co umożliwia badanie lokalizacji antygenów w przekrojach. Metodę tę po raz pierwszy wprowadzili Jane Dodd i Tom Jessell1.

W niniejszym filmie zaprezentowano immunohistochemię w preparatach całych (whole mount immunohistochemistry), czyli metodę pozwalającą na wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji antygenu w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Jane Dodd i Toma Jessella.

Metoda barwienia przeciwciałami całych preparatów u kurczaka

Zarodek kurczaka jest cennym narzędziem w badaniach nad wczesnym rozwojem embrionalnym. Jego przejrzystość, dostępność oraz łatwość manipulacji sprawiają, że jest on...

Niniejszy materiał wideo prezentuje poszczególne etapy immunohistochemii całego preparatu (whole mount) w embrionie kurczaka z wykorzystaniem przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP. Najpierw embrion jest utrwalany w paraformaldehydzie, a następnie blokowana jest endogenna aktywność peroksydazy.Następnie zarodek inkubuje się w przeciwciałach pierwszorzędowych. Po kilku etapach przemywania zarodek inkubuje się w przeciwciałach wtórnych sprzężonych z HRP. Reakcję barwną ujawnia się przy użyciu substratu DAB, a barwienie przeciwciał przybiera kolor pomarańczowy. Przewagą tej metody nad zastosowaniem przeciwciał fluorescencyjnych jest możliwość przygotowania zarodków do cięcia w wosku, co umożliwia badanie lokalizacji antygenów w przekroju poprzecznym.Witajcie, jestem Delphine z Laboratorium FIN w Centrum Medycyny Środowiskowej i Genomicznej na Texas A&amp;M w Houston. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykonywania barwień przeciwciałami w preparatach z embrionów kurzych z zastosowaniem przeciwciał sprzężonych z HRP. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania morfologii embrionów po podaniu leków przeciwpadaczkowych.Zacznijmy zatem. Aby przeprowadzić immunohistochemię całego preparatu na embrionach kurczaka, należy najpierw otworzyć jajo, stukając w skorupkę pęsetą i usuwając jej fragmenty. Usuń gęste białko pęsetą, a następnie odchyl worek żółtkowy za pomocą pęsety anatomicznej tak, aby embrion był skierowany ku górze.Następnie użyj precyzyjnych nożyczek, aby wyciąć kwadrat z worka żółtkowego wokół embrionu. Wyjmij embrion z żółtka za pomocą łyżeczki i umieść go w naczyniu z PBS pod mikroskopem stereoskopowym. Ostrożnie usuń błony z żółtka i przenieś embrion do nowego naczynia zawierającego PBS.Po przeniesieniu zarodka, unieruchom go za pomocą pęsety i szpilek entomologicznych, a następnie odessaj PBS. Zastąp go 4% PFA w PBS i pozostaw zarodek do utrwalenia na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować potencjalną kontaminację mikrobiologiczną. W każdym z poniższych kroków po utrwaleniu zarodka stosuj zdejonizowaną wodę H2O; odessaj roztwór utrwalający i zutylizuj go zgodnie z procedurami dla odpadów chemicznych.Napełnij szalkę roztworem BS.Następnie, używając nożyka do mikrodysekcji, wytnij kwadrat wokół embrionu, aby usunąć dodatkowe błony pozazarodkowe. Po wyjęciu szpilek owadniczych usuń je za pomocą pincety. Użyj pipety Pasteura z zaokrąglonym końcem, aby przenieść embrion do fiolki scyntylacyjnej zawierającej PBT.Przemyć embrion w PBT trzykrotnie po 10 minut każdorazowo. Usunąć PBT z fiolki scyntylacyjnej i zastąpić ją PBTX zawierającym 0,3% H₂O₂ w celu inaktywacji potencjalnej endogennej peroksydazy. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze.Przemyj embrion w PBT najpierw trzy razy po 10 minut, a następnie trzy razy po 30 minut. Aby przeprowadzić barwienie embrionu przeciwciałem, rozpocznij od płukania embrionu przez jedną godzinę w buforze blokującym lub 1%BSA 1%NGS.Stosujemy NGS, ponieważ przeciwciało wtórne zostało otrzymane u kozy. Inkubujemy na mutatorze przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej; po inkubacji rozcieńczamy przeciwciało pierwotne w stosunku jeden do jednego w buforze blokującym i inkubujemy zarodek w tym roztworze przez dwa dni w temperaturze 4 °C. Na mutatorze.Współczynnik rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego zależy od wybranego przeciwciała. W tym przypadku używamy przeciwciała z banku hybrydom DOMA opracowanego na potrzeby badań rozwojowych, dostarczonego w formie supernatantu. Rozcieńczamy go w stosunku jeden do jednego w buforze blokującym.Następnie przeprowadź trzy 10-minutowe płukania w PBT, a następnie trzy jednogodzinne płukania w PBT. Po płukaniu rozcieńcz przeciwciało wtórne w stosunku 1:2 500 w buforze blokującym. W tym przypadku jest to koniugowana z peroksydazą przeciwciała kozie anty-US IgG; inkubuj zarodek w tym roztworze przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze.Przeprowadzić trzy 10-minutowe płukania w buforze PBT, a następnie trzy jedno godzinne płukania w PBT, aby rozwinąć reakcję barwną w barwionym embrionie. Pierwsze dwa 20-minutowe płukania wykonać w buforze Tris (100 mM Tris, HCl pH 7.4). Następnie usunąć z probówki z embrionem ostatnią porcję buforu TS i zastąpić ją 5 ml roztworu DAB.Przechowywać w ciemności w inkubatorze przez 20 minut. Pozbyć się końcówki do pipety do pojemnika z 10% roztworem wybielacza. W celu dekontaminacji DAB dodać 16 µl.Dodaj H₂O₂ do probówki zawierającej embriony w DAB. Przechowuj w ciemności. Po 10 minutach monitoruj reakcję pod mikroskopem, aż reakcja barwna zostanie zakończona. Zutylizuj DAB w wiadrze z wybielaczem i zastąp go pięcioma mililitrami.Woda z kranu. Następnie przeprowadź dwa 10-minutowe przemycia w PBS w celu przygotowania do fotografii i sekcjonowania w wosku. Odwodnij zabarwiony embrion w serii etanolu 25%, 50%, 75% i 100% przez 10 minut w każdym roztworze.Po odwodnieniu zastąp etanol od 0,5 do 1 ml olejku cedrowego. Sprawi to, że zarodek stanie się przezroczysty, co umożliwi fotografowanie w olejku cedrowym. Po zakończeniu fotografowania umieść zarodek z powrotem w fiolce i zastąp olejek cedrowy 100% ethanolem.Na koniec należy zastąpić etanol 5% fast green FCF w 100% etanolu i inkubować przez trzy minuty. Krok ten sprawi, że zarodki będą widoczne podczas badania histologicznego. Następnie roztwór fast green FCF należy zastąpić 100% etanolu i przygotować próbki do badania histologicznego.Oto trzy przykłady barwionych embrionów. Te embriony w stadium 11 są znakowane przeciwciałem 15.3 B dziewięć lub nie. Jedno z nich to specyficzne przeciwciało przeciwko sznurkowi węzłowemu opracowane w laboratorium Jane dod i Toma Gessela.Po dwóch minutach w DAB zarodek pozostaje przezroczysty. Po 20 minutach w DAB w obrębie sznura węzłowego pojawia się słabe znakowanie. Ostatecznie, po 40 minutach, znakowanie sznura węzłowego jest pełne.W tym przykładzie pokazujemy, jak przeciwciało PAC seven, opracowane w laboratorium Toma Jessela, rozpoznaje wczesne etapy zamykania rurki neuralnej, a także komórki grzebienia neuralnego w obrębie czaszki wyłaniające się z mózgu przedniego. Tutaj embrion został oznakowany sondą Croc 20 z laboratorium Davida Wilkinsona, a następnie jednym przeciwciałem. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania immunohistochemii w preparatach całych embrionów.Niniejszą procedurę można zastosować również do embrionów, które zostały wcześniej poddane hybrydyzacji in situ w całym preparacie. W takim przypadku należy krótko utrwalić embrion przez jedną godzinę po hybrydyzacji in situ, a następnie przystąpić do barwienia przeciwciałami. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

method-for-whole-mount-antibody-staining-in-chick

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda całkowitego barwienia przeciwciał w całym zarodku kurczaka

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Ten film opisuje technikę barwienia immunohistochemicznego w celu identyfikacji komórek dendrytycznych z biopsji wewnątrzoskrzelowych.

Barwienie immunohistochemiczne: metoda uzyskiwania informacji przestrzennych z cienkich skrawków tkanek

Ten film demonstruje technikę lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) do badania biodystrybucji przeciwciał skierowanych przeciwko nowotworowi w mysim modelu raka piersi. Po dożylnym wstrzyknięciu przeciwciała specyficznego dla nowotworu myszy, guz jest izolowany chirurgicznie, a lokalizacja przeciwciała w tkance nowotworowej jest potwierdzana za pomocą barwienia immunologicznego ex vivo.

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo do badania biodystrybucji przeciwciał

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Tutaj prezentujemy protokół do badania inwazji komórek nowotworowych na żywe normalne fragmenty tkanek w trzech wymiarach. Ta technika hodowli narządowej jest stosowana głównie do testowania potencjalnie przeciwinwazyjnych leków in vitro.

Test inwazji serca piskląt do badania inwazyjności komórek rakowych i aktywności potencjalnie przeciwinwazyjnych związków

Opisano techniki immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadzania dwukolorowej fluorescencyjnej lokalizacji konfokalnej w strukturach komórkowych tak małych jak pierwotne rzęski. Techniki utrwalania i obrazowania mogą określać lokalizację i kinetykę pojawiania się lub aktywacji określonych białek.

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Prezentujemy metodę izolacji i hodowli mysiego kanału Wolffa (WD). Demonstrujemy również szczegółową procedurę barwienia immunologicznego całej góry hodowanych/świeżo wyizolowanych WD z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Razem techniki te umożliwiają badanie rozwoju, zwijania i różnicowania WD.

Hodowla narządów i barwienie immunofluorescencyjne całego wierzchowca mysich przewodów Wolffa

Całościowe podejście immunohistochemiczne, do wizualizacji ekspresji białka neurofilamentu w pozawątrobowym przewodzie żółciowym u Suncus murinus. jest prezentowane tutaj. Protokół ten może być wykorzystany do analizy unerwienia wszystkich narządów trzewnych u S. murinus lub innych gatunków.

Zastosowanie całościowej metody immunohistochemicznej do badania unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Poznaj metodę immunohistochemii całego preparatu u piskląt z zastosowaniem przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP. Technika ta umożliwia wizualizację wzorców ekspresji antygenów w embriogenezie.

Metoda barwienia przeciwciałami całych preparatów u kurczaka

Przeglądaj więcej filmów