Metoda barwienia przeciwciał w całej górze u piskląt
2 lutego 2009
Ten film demonstruje całą immunohistochemię, metodę, dzięki której przestrzenny i czasowy wzór ekspresji antygenu może być wizualizowany w młodych zarodkach piskląt. Ta metoda została pierwotnie wprowadzona przez Jane Dodd i Toma Jessella.
Ten film pokazuje różne etapy całej immunohistochemii Mount w zarodku piskląt przy użyciu sprzężonych przeciwciał drugorzędowych HRP. Najpierw zarodek jest utrwalany w paraformaldehydzie. Następnie aktywność endogennej peroksydazy zostaje wygaszona.
Zarodek jest następnie inkubowany w przeciwciałie pierwotnym. Po kilku płukaniach zarodek inkubuje się w przeciwciałie drugorzędowym Reakcja barwna sprzężona z HRP ujawnia się przy użyciu substratu DAB, a barwienie przeciwciałami zmienia kolor na pomarańczowy. Przewagą tej metody nad zastosowaniem przeciwciał fluorescencyjnych jest to, że zarodki mogą być przetwarzane do wycinka woskowego, co umożliwia badanie miejsc antygenów w przekroju poprzecznym.
Cześć, jestem Delphine i pracuję w Laboratorium FIN w Centrum Medycyny Środowiskowej i Genomicznej w Teksasie w Houston. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę wykonywania przeciwciał montujących hormony, barwienia w zarodkach policzków przy użyciu przeciwciał sprzężonych z HRP. Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania morfologii zarodków po leczeniu lekami przeciwpadaczkowymi.
Więc zacznijmy od przeprowadzenia całej immunohistochemii na zarodkach piskląt. Najpierw otwórz jajko, stukając w skorupkę kleszczami i usuwając kawałki skorupki. Usuń grubą albuminę za pomocą kleszczy i przechyl worek z żółtkiem za pomocą grubych kleszczy tak, aby zarodek był skierowany do góry.
Następnie połącz cienkie nożyczki, aby wyciąć kwadrat worka z żółtkiem wokół zarodka. Usuń zarodek z żółtka łyżką i umieść w naczyniu zawierającym PBS pod mikroskopem preparacyjnym. Ostrożnie usuń błony z żółtka i przenieś zarodek do świeżego naczynia zawierającego PBS.
Po przeniesieniu zarodka przypnij zarodek kleszczami i szpilkami do owadów i odessaj PBS. Zastąp to 4% PFA w PBS i pozwól zarodkowi utrwalić się przez godzinę w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Użyj Dejonizowanego H2O D, gdy wszystkie poniższe kroki po utrwaleniu zarodka są w stanie zapylić, odessać roztwór utrwalający i odpowiednio zutylizować jako odpady chemiczne.
Napełnij naczynie BS. Następnie za pomocą noża do mikrodysekcji wytnij kwadrat wokół zarodka, aby usunąć dodatkowe błony embrionalne. Usuń szpilki do owadów za pomocą kleszczy po usunięciu szpilek. Użyj pipety do pastwiska, aby przenieść zarodek do fiolki scyntylacyjnej zawierającej PBT.
Umyj zarodek PBT trzy razy po 10 minut. Usunąć PBT z fiolki scyntylacyjnej i zastąpić PBTX zawierającym 0,3% H 2 0 2 w celu inaktywacji potencjalnej endogennej peroksydazy. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na mutatorze.
Najpierw przemyj zarodek PBT trzy razy przez 10 minut, a następnie trzy razy po 30 minut. Aby zabarwić zarodek przeciwciałem. Zacznij od mycia zarodka przez godzinę w buforze blokującym lub 1%BSA 1%NGS.
Używamy NGS, ponieważ przeciwciało drugorzędowe jest hodowane u kóz. Po inkubacji inkubować na mutatorze przez godzinę w temperaturze pokojowej, po inkubacji rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe jeden do jednego w buforze blokującym i inkubować zarodek w tym roztworze przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na modyfikatorze.
Pierwszorzędowy czynnik rozcieńczenia przeciwciała zależy od wyboru przeciwciała pierwszorzędowego. W tym przypadku używamy przeciwciała z hybrydowego banku DOMA badań rozwojowych, które jest dostarczane w postaci super natyny. Rozcieńczamy go jeden do jednego w buforze blokującym.
Następnie wykonaj trzy 10-minutowe prania w PBT, a następnie trzy jednogodzinne prania w PBT. Po przemyciu rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w ilości 1 do 2 500 w buforze blokującym. W tym przypadku peroksydaza sprzężona z kozią anty-amerykańską IgG i inkubować zarodek w tym roztworze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na mutatorze.
Wykonaj trzy 10-minutowe płukania w PBT, a następnie trzy jednogodzinne płukania w PBT, aby rozwinąć reakcję barwną barwionego zarodka. Pierwsze dwa 20-minutowe płukanie w buforze tris 100 milimolowym tris, HCL pH 7,4. Następnie należy usunąć ostatni płyn do płukania buforem TS z fiolki zawierającej zarodek i zastąpić go pięciomililitrowym roztworem DAB.
Trzymaj go w ciemności na modyfikatorze przez 20 minut. Wyrzuć końcówkę einor do wiadra zawierającego 10% roztwór wybielacza. Aby odkazić DAB, dodaj 16 mikrolitrów.
Stado H 2 0 2 do fiolki zawierającej zarodki w DAB. Trzymaj go w ciemności Po 10 minutach monitoruj reakcję pod mikroskopem, gdy reakcja barwna jest zakończona. Wyrzuć DAB do wiadra z wybielaczem, zastąp na pięć mililitrów.
kranówka. Następnie wykonaj dwa 10-minutowe mycie w PBS, aby przetworzyć do fotografii i sekcji wosku. Odwodnić zabarwiony zarodek w serii etanolowej, 25%50%75% i 100% przez 10 minut każda.
Po odwodnieniu zastąp etanol 0,5 do jednego mililitra oleju cedrowego. To sprawi, że zarodek będzie półprzezroczysty do fotografii w olejku z drzewa cedrowego. Po wykonaniu zdjęć włóż zarodek z powrotem do fiolki i zastąp olejek z drzewa cedrowego 100% etanolem.
Na koniec zastąp etanol 5% szybkim zielonym FCF w 100% etanolu i inkubuj przez trzy minuty. Ten krok sprawi, że zarodki będą widoczne dla histologii. Zastąp szybki zielony roztwór FCF 100% etanolem i poddaj procesowi histologicznemu.
Oto trzy przykłady barwionych zarodków. Te zarodki w stadium 11 są oznaczone jako 15.3 B 9 lub nie. Jedno z nich to przeciwciało specyficzne dla rdzenia węzłowego opracowane w laboratorium Jane Dod i Toma Gessela.
Po dwóch minutach w DAB zarodek jest nadal przezroczysty. Po 20 minutach w DAB na przewodzie węzłowym pojawia się delikatne oznaczenie. Wreszcie, po 40 minutach, etykietowanie przewodu węzłowego jest zakończone.
W tym przykładzie pokazujemy, w jaki sposób PAC 7, przeciwciało opracowane w laboratorium Toma Jessela, rozpoznaje wczesne etapy zamykania cewy nerwowej, a także komórki grzebienia nerwowego czaszki wyłaniające się ze śródmózgowia. Tutaj zarodek jest znakowany sondą Croc 20 z laboratorium Davida Wilkinsona, a następnie nie ma ani jednego przeciwciała. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać całą immunohistochemię na zarodkach.
Procedura ta może być również stosowana w przypadku zarodków, które zostały wcześniej przetworzone w celu hybrydyzacji in situ w całości. W takim przypadku należy na krótko utrwalić zarodek przez godzinę po hybrydyzacji in situ, a następnie przystąpić do barwienia przeciwciałami. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy film demonstruje immunohistochemię całych preparatów, technikę stosowaną do wizualizacji przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji antygenów w młodych embrionach kurcząt. Metoda ta obejmuje kilka etapów, w tym fiksację oraz inkubację z przeciwciałami, w celu uzyskania wyników barwienia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Immunohistochemia
Wstęp
- Immunohistochemia całego preparatu umożliwia badanie rozmieszczenia antygenów w embrionach.
- Technika ta została pierwotnie wprowadzona przez Jane Dodd i Toma Jessella.
- Dostarcza ona wiedzy na temat procesów rozwojowych i ekspresji genów.
- Przeciwciała wtórne sprzężone z HRP poprawiają wizualizację antygenów.
Cel badania
- Zaprezentowanie procedury immunohistochemii całych preparatów.
- Wizualizacja ekspresji antygenu w embrionach kurczaka.
- Porównanie zalet tej metody w stosunku do technik z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych.
Zastosowane metody
- Fiksacja embrionów w paraformaldehydzie.
- Blokowanie endogennej aktywności peroksydazy.
- Inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi.
- Reakcja barwna ujawniona przy użyciu substratu DAB w celu wizualizacji.
Główne wyniki
- Barwienie przeciwciałami ma kolor pomarańczowy, co wskazuje na pomyślną detekcję antygenu.
- Zabarwione zarodki mogą zostać poddane dalszej obróbce w celu wykonania przekrojów w wosku.
- Metoda ta umożliwia przeprowadzenie badań przekrojowych miejsc lokalizacji antygenów.
- Wykazuje skuteczność przeciwciał koniugowanych z HRP w procesie barwienia.
Wnioski
- Immunohistochemia całych preparatów jest cenną techniką badania embrionów kurzych.
- Umożliwia ona wyraźną wizualizację wzorców ekspresji antygenów.
- Metoda ta jest korzystna dla późniejszej analizy histologicznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Immunohistochemia całych preparatów w embrionach kurczęt umożliwia przestrzenne mapowanie ekspresji antygenów, co wspiera walidację celów w neurobiologii rozwojowej. Metoda ta pozwala na ograniczenie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie celów molekularnych z efektami fenotypowymi w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej. Kompatybilność z sekcjonowaniem w wosku pozwala zespołom interdyscyplinarnym korelować dane immunohistochemiczne z analizą histologiczną, co poprawia ciągłość translacyjną w przedklinicznej ocenie celów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację rozkładu antygenów w rozwijającej się rurce neuralnej i somytach.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki bezpośredniej obserwacji oddziaływania z celem w nienaruszonych embrionach.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność wyboru celu poprzez dostarczenie danych o ekspresji z rozdzielczością przestrzenną w celu identyfikacji wiodących kandydatów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje zestandaryzowane, powtarzalne wzory barwienia z wykorzystaniem przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP i substratu DAB.
- Wynik ilościowy: Umożliwia półilościową ocenę miejsc antygenowych poprzez intensywność koloru, co wspiera optymalizację testu.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Kompatybilne z sekcjonowaniem w wosku, co pozwala na wykorzystanie tej samej zabarwionej próbki w wielu kolejnych procesach analitycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla badań nad chorobami: Możliwość zastosowania w badaniu efektów embriotoksycznych związków, takich jak leki przeciwpadaczkowe, w modelu kręgowców.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etapy odkrywania i badań przedklinicznych poprzez umożliwienie spójnego śledzenia antygenów w preparatach całych oraz w sekcjach.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala ustalić, czy obserwowane fenotypy korelują z modulacją celu w rozwijających się tkankach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od fazy odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając wczesne etapy walidacji punktów uchwytu oraz opracowywania testów przed optymalizacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez poprzez ujawnianie czasoprzestrzennej ekspresji antygenów w rozwijającym się mózgu i rurce neuralnej.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowanych odczytów immunohistochemicznych, które wspierają powtarzalną ocenę związków w układach embrionalnych.
- Analityka: Generuje sygnał chromogenny wykrywalny za pomocą mikroskopii w polu jasnym, co umożliwia ilościową analizę obrazu w celu porównania warunków.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów, umożliwiając walidację lokalizacji antygenu zarówno w preparatach całych obiektów, jak i w przekrojach histologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi wielokrotnie wykorzystywalną platformę histologiczną, którą można zastosować w wielu projektach badających toksyczność rozwojową lub ekspresję celu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie obecności antygenu z konkretnymi strukturami embrionalnymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji etapów utrwalania, blokowania i inkubacji z przeciwciałami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez dostarczenie histologicznego potwierdzenia modulacji celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o profile oddziaływania z celem rozwojowym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie sekcji zarodków, immunohistochemii oraz detekcji chromogennej.
- Zależne od dostępu do mikroskopów, mikrotomów oraz systemów wentylacyjnych do pracy z DAB i H2O2.
- Niezbędna jest standaryzacja rozcieńczeń przeciwciał oraz protokołów płukania w obrębie zespołów badawczych.
- Adaptacja do innych gatunków może wymagać optymalizacji etapów przepuszczalności i blokowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują dłuższy czas inkubacji oraz konieczność ostrożnej utylizacji DAB w celu zapobiegania powstawaniu artefaktów.
