Technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z Cisterna Magna u myszy

Zabieg rozpoczyna się od znieczulenia myszy i przygotowania pola operacyjnego. Mysz jest następnie umieszczana w pozycji leżącej na instrumencie stereotaktycznym. Strzałkowe nacięcie skóry zostało wykonane poniżej potylicy, a tkanka podskórna i mięśnie szyi przez linię środkową są tępo oddzielone.

Następnie tylna część ciała jest układana tak, aby ciało tworzyło kąt 135 stopni ze stałą głową, opona twarda CI mostka wielkiego jest penetrowana szklaną kapilarną i płyn mózgowo-rdzeniowy zostanie zebrany. Po pobraniu próbki płynu mózgowo-rdzeniowego mięśnie są wyrównywane, a skóra jest zszywana, około jednego mililitra 0,9% soli fizjologicznej NACL jest wstrzykiwany podskórnie, aby zapobiec odwodnieniu, a mysz jest utrzymywana w cieple, aż wyzdrowieje. Cześć, nazywam się Liu i pracuję w laboratorium dr Karen Duff w The Top Institute na Uniwersytecie Columbia.

Dzisiaj pokażę Ci, jak pobrać płyn mózgowo-rdzeniowy z pamięci systemowej myszy. Dzięki tej technice możemy pobrać seryjnie próbki płynu mózgowo-rdzeniowego nawet trzykrotnie od tej samej myszy w odstępie od dwóch do trzech miesięcy. W naszym laboratorium używamy tej techniki do określania poziomów CSFA beta lub tau w różnym wieku naszych transgenicznych mysich modeli choroby Alzheimera i korelujemy te wartości z tymi w mózgu.

Na koniec jesteśmy zainteresowani potencjałem poziomów beta lub tau CSFA jako potencjalnych markerów biologicznych dla postępu choroby, a także dla badań terapeutycznych na myszach. Więc zacznijmy. Do tej procedury konieczne jest wykonanie naczyń włosowatych za pomocą polarnej mikropipety.

Zastosowane tutaj kapilary to szkło krzemianowe BOA B 175 10 firmy Sutter Instruments, które ciągną kapilary na płonącej mikropipecie Sutter P 87 o biegunowym wskaźniku ciepła i indeksie ciśnienia ustawionym na trzy 30. Szklana kapilara ma pięć centymetrów długości i zwężającą się końcówkę. Końcówkę kapilary przycina się nożyczkami tak, aby jej średnica wewnętrzna wynosiła około 0,5 milimetra.

Zabieg chirurgiczny rozpoczyna się od znieczulenia myszy ketaminą 100 miligramów na kilogram i ksylazyną 10 miligramów na kilogram podawaną dootrzewnowo podczas znieczulenia, utrzymuj mysz w cieple w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po ustaleniu, że zwierzę jest w pełni znieczulone odruchem wycofania szczypania palców u stóp, przetestuj golenie szyi, a następnie umieść mysz na instrumencie stereotaktycznym, takim jak ten od Davida Kink. W bezpośrednim kontakcie z poduszką grzewczą włóż sondę temperatury doodbytniczą, aby ciepło z podkładki można było regulować w zależności od temperatury ciała myszy.

Zabezpiecz głowę adapterami do głowy, przetrzyj skórę szyi 10% jodowidonem i 70% etanolem trzykrotnie i wykonaj nacięcie strzałkowe poniżej tylnej części głowy lub potylicy. Kolejne kroki należy wykonać pod mikroskopem preparacyjnym przy użyciu kleszczy. Oddziel tkankę podskórną i mięśnie M przez usługi wentylacyjne i M mięsień prosty głowy grzbietowy większy, tak aby opona twarda mostka wielkiego była odsłonięta Prawidłowo użyj pary mikro zwijaczy, aby utrzymać mięśnie osobno.

Na koniec połóż mysz z głową pod kątem 135 stopni do ciała. Mysz jest teraz gotowa do odbioru płynu mózgowo-rdzeniowego. Ta technika pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z mostka Magno została opublikowana wcześniej.

C rysunek pierwszy A pod mikroskopem preparacyjnym. Opona twarda jawi się jako lśniący i wyraźny odwrócony trójkąt, przez który widoczny jest rdzeń przedłużony i główne naczynie krwionośne. Tętnica opony twardej spinella C rysunek pierwszy B. Można zaobserwować pulsację krążenia rdzenia i przyległej przestrzeni płynu mózgowo-rdzeniowego.

Osuszyć oponę twardą sterylnym wacikiem, przeniknąć przez naczynia włosowate do CI mostka magna przez oponę twardą boczną do spineli tętnicy grzbietowej. Zauważalna będzie zmiana oporu, gdy kapilara zostanie prawidłowo wprowadzona, a następnie płyn mózgowo-rdzeniowy wpłynie do kapilary. Po zebraniu płynu mózgowo-rdzeniowego ostrożnie usuń kapilarę i połącz ją z trzymililitrową strzykawką za pomocą rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej jednego milimetra.

Wstrzyknąć płyn mózgowo-rdzeniowy do probówki o pojemności 0,5 mililitra. Oznacz tubkę i natychmiast zamroź ją na suchym lodzie. Po zamrożeniu przenieś płyn mózgowo-rdzeniowy do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Zademonstrowana właśnie technika pobierania próbek jest niezwykle delikatna i pozwala na pobieranie kolejnych próbek płynu mózgowo-rdzeniowego od tej samej myszy w odstępie dwóch do trzech miesięcy. Dlatego po pobraniu próbki szyi, mięśnie i skóra powinny zostać wyrównane i zamknięte szwami. Po zszyciu nacięcia wstrzyknij podskórnie około jednego mililitra roztworu soli fizjologicznej 0,9% NACL, aby nawodnić mysz.

Trzymaj mysz w cieple w temperaturze około 37 stopni Celsjusza, aż dojdzie do siebie. Monitoruj jego wagę w pierwszym i siódmym dniu po zabiegu. Właśnie pokazałem ci, jak pobrać płyn mózgowo-rdzeniowy z magazynka systemowego myszy.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o trzech ważnych rzeczach. Po pierwsze, ustaw głowę i korpus myszy odpowiednio na ramie stereotaktycznej, tak aby ator Cy Magna mógł być jak najbardziej odsłonięty. Po drugie, ostrożnie omijaj naczynia krwionośne podczas penetracji twardości za pomocą naczyń włosowatych.

W przeciwnym razie próbka zostanie zanieczyszczona krwią. Na koniec należy pamiętać o utrzymywaniu myszy w cieple podczas całej procedury, aby zapobiec hipotermii. Hipotermia jest nie tylko szkodliwa dla myszy, ale także może znacząco wpłynąć na wyniki, indukując produkcję beta lub wysoki związek hipofosforylacji.

Dobra, to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.