Name: Technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z Cisterna Magna u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Naucz się techniki seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cisterna magna u myszy transgenicznych modeli choroby Alzheimera. Ta metoda umożliwia dokładne monitorowanie biomarkerów Aβ i tau w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasza praca jest finansowana z grantów NIH NS048447 i AG017216 przyznanych KD. Li Liu pragnie podziękować dr. Heikkiemu Tanili (University of Kuopio, Kuopio, Finlandia) za nadzór i wsparcie podczas opracowywania oryginalnego protokołu.

Wyciąganie szklanej rurki kapilarnej
<ol>
<li>Szklaną rurkę kapilarną zakupiono w firmie The Sutter Instrument Inc (szkło borokrzemowe, B100-75-10). </li>
<li>Rurki kapilarne należy wyciągnąć za pomocą wyprawiacza mikropipet Sutter P-87, ustawiając indeks ciepła na 300, a indeks ciśnienia na 330. </li>
<li>Końcówkę szklanej rurki kapilarnej należy przyciąć nożyczkami tak, aby zwężona końcówka miała średnicę wewnętrzną około 0,5 mm.</li>
</ol>
Technika nakłucia cysterny wielkiej w celu pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego
Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego pobiera się z cysterny wielkiej (Rysunek 1) metodą opisaną w poprzedniej publikacji 1. <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_2/960_Figure-01.png" alt="Schemat anatomii mózgu: etykiety móżdżku, cysterny wielkiej, kory i pnia mózgu." width="432" height="184" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1
1. Myszy są znieczulone ketaminą (100mg/kg) i ksylazyną (10mg/kg), podanymi wewnątrzbrzusznie. Podczas indukcji znieczulenia myszy są utrzymywane w inkubatorze w temperaturze 37oC.
2. Skórę szyi ogala się, a następnie mysz umieszcza się w pozycji brzusznej na aparacie stereotaksycznym w bezpośrednim kontakcie z matą grzewczą. Do odbytu wprowadza się sondę temperatury odbytniczej, aby ciepło generowane przez matę grzewczą było regulowane w odpowiedzi na zmiany temperatury ciała. Głowę unieruchamia się za pomocą adapterów głowowych. Pole operacyjne przeciera się 10% povidone iodine, a następnie 70% etanolem (powtórzyć 3 razy), po czym wykonuje się strzałkowe nacięcie skóry poniżej potylicy.
3. Pod mikroskopem stereoskopowym tkankę podskórną i mięśnie (m. biventer cervicis oraz m. rectus capitis dorsalis major) rozdziela się za pomocą tępego rozczepiania pęsetą. Do odsunięcia i utrzymania mięśni stosuje się parę mikroretraktorów.
4. Myszy kładzie się w taki sposób, aby głowa tworzyła z ciałem kąt wynoszący blisko 135o.
5. Pod mikroskopem stereoskopowym opona twarda w obrębie cysterny wielkiej (cisterna magna) widoczna jest jako lśniący i przejrzysty odwrócony trójkąt, przez który można dostrzec rdzeń przedłużony, główne naczynie krwionośne (arteria dorsalis spinalis) oraz przestrzeń wypełnioną CSF (Rycina 2). <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_3/960_Figure-02.png" alt="Prezentacja anatomii chirurgicznej; procedura sekcyjna; odsłonięcie tkanek; cele edukacyjne." width="304" height="307" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2
6. Oponę twardą osuszamy sterylnym patyczkiem bawełnianym. Wprowadzamy rurkę kapilarną do cysterny wielkiej (citerna magna) przez oponę twardą, bocznie w stosunku do tętnicy grzbietowej rdzenia (arteria dorsalis spinalis) (Rysunek 2). Po zauważalnej zmianie oporu podczas wprowadzania rurki kapilarnej, płyn mózgowo-rdzeniowy wpływa do rurki kapilarnej.
7. Ostrożnie wyjmij kapilarę i połącz ją ze strzykawką o pojemności 3 ml za pomocą rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 1 mm. Wstrzyknij CSF do uprzednio oznakowanej probówki eppendorfa o pojemności 0,5 ml, natychmiast zamroź probówkę na suchym lodzie, a następnie przenieś ją do zamrażarki w temperaturze -80°C.
8. Po pobraniu próbek CSF mięśnie są ponownie ustawiane w odpowiedniej pozycji, a skórę zszywa się (4-0, Ethicon, Johnson &amp; Johnson). Podskórnie wstrzykuje się około 1 ml 0.9% NaCl, aby zapobiec odwodnieniu. Myszy przechowuje się w inkubatorze w celu utrzymania temperatury ciała aż do momentu wybudzenia; masę ciała myszy monitoruje się 1 dzień oraz 1 tydzień po zabiegu.
Wyniki i dyskusja
Opisaliśmy wysoce niezawodny protokół seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) od myszy bez wykrywalnego zanieczyszczenia osoczem.
1. Cała procedura trwa zazwyczaj 10 min na mysz (wliczając znieczulenie). Objętość uzyskanego CSF zależy od szczepu myszy. W przypadku myszy double Tg PS/APP 2, których używaliśmy, średnia objętość wynosi około 5 μl (od 3 do 7 μl), natomiast myszy P301L (JNPL3) 3 dają wydajność około 10 μl- 15 μl. W przypadku pobierania seryjnego, za każdym razem można bezpiecznie pobrać maksymalnie 7-8 μl w odstępach 2-3 miesięcy.
2. Podczas operacji ważne jest prawidłowe ustawienie głowy i ciała myszy w aparacie stereotaktycznym, aby umożliwić wystarczającą ekspozycję opony twardej w obrębie cysterny wielkiej. Należy zachować ostrożność i unikać naczyń krwionośnych podczas przebijania opony twardej kapilarą, aby zapobiec zanieczyszczeniu białkami osocza, co można monitorować w próbce CSF za pomocą immunoblottingu w kierunku ApoB 4.
3. Minimalizacja uszkodzeń tkanek podczas każdego zabiegu jest istotna, ponieważ zrosty tkankowe mogą utrudnić dalsze prace, zwiększając ryzyko krwawienia podczas kolejnych pobrań próbek.
4. Podczas operacji należy dbać o utrzymanie stałej temperatury ciała, ponieważ hipotermia wywołana znieczuleniem może bardzo szybko i znacząco wpłynąć na poziomy fosforylowanego białka tau w mózgu 5.
5. Protokół Ab ELISA oraz przeciwciała, których użyliśmy, zostały szczegółowo opisane w pracy Refolo et al. 6. Dwa μl płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) od myszy PS/APP dadzą satysfakcjonujące wyniki przy rozcieńczeniu 1:50-1:60. W przypadku tau ELISA, 4-5 μl CSF od myszy P301L (JNPL3) będzie wystarczające do wykrycia całkowitego białka tau lub białka tau fosforylowanego w treoninie 231 (zestachniki zakupiono w firmie Bio-Source).
6. Technikę tę można zastosować w innych modelach mysich chorób neurologicznych, w których niewielka objętość płynu mózgowo-rdzeniowego jest wystarczająca do przeprowadzenia wymaganych analiz.

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+observation+on+CSF+Abeta42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein%2Fpresenilin-1+doubly+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).</li>
<li>Holcomb, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Alzheimer-type+phenotype+in+transgenic+mice+carrying+both+mutant+amyloid+precursor+protein+and+presenilin+1+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes.</a> Nat Med. 4, 97(1998).</li>
<li>Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibrillary+tangles%2C+amyotrophy+and+progressive+motor+disturbance+in+mice+expressing+mutant+%28P301L%29+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein.</a> Nat Genet. 25, 402- (2000).</li>
<li>DeMattos, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque-associated+disruption+of+CSF+and+plasma+amyloid-beta+%28Abeta%29+equilibrium+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurochem. 81, 229(2002).</li>
<li>Planel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+leads+to+tau+hyperphosphorylation+through+inhibition+of+phosphatase+activity+by+hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia.</a> J Neurosci. 27, 3090(2007).</li>
<li>Refolo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cholesterol-lowering+drug+reduces+beta-amyloid+pathology+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 8, 890(2001).</li>
</ol>

Opisaliśmy wysoce niezawodny protokół seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego od myszy bez wykrywalnej kontaminacji osoczem.
1. Cała procedura trwa zazwyczaj 10 min na mysz (wliczając znieczulenie). Objętość uzyskanego CSF zależy od szczepu myszy. W przypadku myszy double Tg PS/APP, których używaliśmy2, średnia objętość wynosi około 5 μl (od 3 do 7 μl), natomiast myszy P301L (JNPL3) 3 dają wydajność około 10 μl- 15 μl. W przypadku pobierania seryjnego, przy odstępach 2-3 miesięcy, możn...

technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cysterny wielkiej u myszy

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującą chorobą neurodegeneracyjną, której obraz patologiczny charakteryzuje się zewnątrzkomórkowym odkładaniem peptydu β-amyloidu (Aβ) oraz wewnątrzneuronalną akumulacją hiperfosforylowanego białka tau. Ponieważ płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) pozostaje w bezpośrednim kontakcie z przestrzenią zewnątrzkomórkową mózgu, odzwierciedla on zmiany biochemiczne zachodzące w mózgu w odpowiedzi na procesy patologiczne. W CSF pacjentów z AD obserwuje się spadek poziomu 42-aminokwasowej formy Aβ (Aβ42) oraz wzrost całkowitego poziomu białka tau i tau hiperfosforylowanego, choć mechanizmy odpowiedzialne za te zmiany nie są jeszcze w pełni zrozumiałe. Transgeniczne (Tg) modele mysie AD stanowią doskonałą okazję do zbadania, w jaki sposób i dlaczego poziomy Aβ lub tau w CSF zmieniają się wraz z postępem choroby. W niniejszej pracy prezentujemy udoskonaloną technikę punkcji cysterny wielkiej w celu pobierania CSF od myszy. Ta niezwykle delikatna technika pobierania pozwala na pozyskiwanie seryjnych próbek CSF od tej samej myszy w odstępach 2-3 miesięcznych, co znacznie minimalizuje zakłócający wpływ zmienności międzyosobniczej poziomów Aβ lub tau, umożliwiając wykrycie subtelnych zmian w czasie. W połączeniu z testem ELISA dla Aβ i tau, technika ta będzie użyteczna w badaniach mających na celu analizę zależności między poziomami Aβ42 i tau w CSF a ich metabolizmem w mózgu w mysich modelach AD. Badania na myszach Tg mogą dostarczyć istotnej walidacji w kwestii potencjału wykorzystania poziomów Aβ lub tau w CSF jako markerów biologicznych do monitorowania postępu choroby oraz efektów interwencji terapeutycznych. Dzięki możliwości uśmiercenia myszy i zbadania mózgów pod kątem zmian biochemicznych lub histologicznych, można lepiej ocenić mechanizmy leżące u podstaw zmian w CSF. Dane te mogą być pomocne w interpretacji zmian w CSF u ludzi z chorobą Alzheimera.

Transgeniczne (Tg) modele mysie w chorobie Alzheimera (AD) stanowią doskonałą okazję do zbadania, w jaki sposób i dlaczego poziomy Aβ lub tau w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) zmieniają się wraz z postępem choroby u pacjentów. W niniejszej pracy prezentujemy udoskonaloną technikę punkcji cysterny wielkiej w celu seryjnego pobierania próbek CSF od myszy.

Technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cysterny wielkiej u myszy

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującą chorobą neurodegeneracyjną, która pod względem patologicznym charakteryzuje się zewnątrzkomórkowym odkładaniem &#946;-amyloidu ...

Procedurę rozpoczyna się od znieczulenia myszy i przygotowania pola operacyjnego. Następnie mysz umieszcza się w pozycji brzusznej w aparacie stereotaktycznym. Wykonuje się cięcie strzałkowe skóry poniżej potylicy, a tkankę podskórną i mięśnie szyi rozdziela się tępo wzdłuż linii środkowej.Następnie tylną część ciała opuszcza się tak, aby ciało tworzyło kąt 135 stopni z unieruchomioną głową, a następnie szklaną kapilarą przebija się oponę twardą w okolicy cisterna magna w celu pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego. Po pobraniu płynu mózgowo-rdzeniowego mięśnie są odpowiednio ułożone, a skórę zaszywa się; podskórnie wstrzykuje się około jednego mililitra 0,9% NaCl soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu, i utrzymuje się mysz w cieple do czasu wybudzenia. Cześć, nazywam się Liu i pracuję w laboratorium dr Karen Duff w The Top Institute na Columbia University.Dzisiaj pokażę Państwu, jak pobierać płyn mózgowo-rdzeniowy z opuszki twardej u myszy. Dzięki tej technice możemy pobierać seryjne próbki CSF do trzech razy od tej samej myszy w odstępach dwu- lub trzymiesięcznych. W naszym laboratorium stosujemy tę metodę do oznaczenia poziomów beta-amyloidu lub białka tau w CSF w różnym wiek

a-technique-for-serial-collection-cerebrospinal-fluid-from-cisterna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z Cisterna Magna u myszy 

Źródło: Joshi, K., et al. Stereotaktyczne podejście chirurgiczne do mikroiniekcji ogonowego pnia mózgu i górnego odcinka szyjnego rdzenia kręgowego za pośrednictwem Cisterna magna u myszy. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje stereotaktyczne podejście cisterna magna do ukierunkowanego dostarczania do pnia mózgu i górnego rdzenia kręgowego. Dzięki dostępowi do cisterna magna wypełnionego płynem mózgowo-rdzeniowym, podejście to umożliwia precyzyjne wstrzykiwanie w miejsca, do których trudno...

Stereotaktyczne podejście Cisterna Magna do dostarczania terapeutycznego w modelu mysim

Źródło: Zamboni, M., et al., Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie do wnętrzełka. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje procedurę dostarczania induktora leku do cisterna magna znieczulonej myszy. Wstrzyknięcie selektywnie indukuje ekspresję markerów fluorescencyjnych w komórkach powierzchni mózgu dostępnych za pośrednictwem płynu mózgowo-rdzeniowego, co potwierdza obrazowanie fluorescencyjne.

Celowane dostarczanie leków w modelu mysim za pomocą iniekcji Cisterna Magna

Źródło: Xavier, A. L. R., et al. Implantacja kaniuli do Cisterna Magna gryzoni. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje procedurę wszczepiania kaniuli do cisterna magna znieczulonej myszy. Technika polega na przeprowadzeniu kaniuli zamontowanej na igle przez oponę twardą do odwróconego trójkątnego cisterna magna i zabezpieczeniu jej w celu ukierunkowanego dostarczenia do płynu mózgowo-rdzeniowego.

Implantacja kaniuli do Cisterna Magna w modelu mysim

W tym filmie opisujemy procedurę dostarczania komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego do cisterna magna mózgu myszy. Ortotopowy model myszy może być wykorzystany do badania przerzutowego rozprzestrzeniania się raka do opon mózgowo-rdzeniowych.

Chirurgiczne wstrzyknięcie Cisterna Magna: metoda podawania komórek nowotworowych bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego modelu mysiego

Źródło: Sweeney, A. M., et al. Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy przy użyciu makroskopii fluorescencyjnej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film przedstawia proces wizualizacji przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) w mózgu myszy za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Znacznik fluorescencyjny jest wstrzykiwany do cisterna magna (CM), umożliwiając śledzenie jego ruchu za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego przez przestrzenie podpajęczynówkowe i...

Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w mózgu myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje ulepszoną technikę obfitego gromadzenia płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) bez zanieczyszczenia krwią. Dzięki lepszemu pobieraniu i czystości próbek można wykonać więcej analiz przy użyciu płynu mózgowo-rdzeniowego, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób wpływających na mózg i rdzeń kręgowy.

Ulepszona metoda pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego od znieczulonych myszy

Tutaj opisujemy protokół wykonywania kaniulacji cisterna magna (CMc), minimalnie inwazyjnego sposobu dostarczania znaczników, substratów i cząsteczek sygnałowych do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). W połączeniu z różnymi metodami obrazowania, CMc umożliwia ocenę dynamiki układu limfatycznego i płynu mózgowo-rdzeniowego, a także dostarczanie różnych związków do mózgu.

Implantacja kaniuli do Cisterna Magna gryzoni

Przezczaszkowe obrazowanie optyczne umożliwia szerokie obrazowanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w korze mózgowej żywych myszy przez nienaruszoną czaszkę.

Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

Podwyższony poziom białka w płynie mózgowo-rdzeniowym może być wynikiem dyfuzji białka osocza przez zmienioną barierę krew-mózg lub syntezy dokanałowej. W artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół testowy, który pomaga rozróżnić oba przypadki i zapewnia pomiary ilościowe białek syntetyzowanych dokanałowo.

Ilościowy pomiar białek syntetyzowanych dooponowo u myszy

Stereotaktyczna operacja celowania w miejsca mózgu u myszy zwykle obejmuje dostęp przez kości czaszki i jest prowadzona przez punkty orientacyjne czaszki. Poniżej przedstawiamy alternatywne podejście stereotaktyczne do celowania w ogonowy pień mózgu i górny odcinek szyjny rdzenia kręgowego za pomocą cisterna magna, które opiera się na bezpośredniej wizualizacji punktów orientacyjnych pnia mózgu.

Stereotaktyczne podejście chirurgiczne do mikroiniekcji ogonowego pnia mózgu i górnego odcinka szyjnego rdzenia kręgowego za pośrednictwem Cisterna magna u myszy

Przedstawiono tutaj protokół do oceny naczyń limfatycznych oponowych myszy (MLV), które odgrywają ważną rolę w wielu chorobach neurologicznych. Celem tego protokołu jest zapewnienie zintegrowanej metody, która umożliwia zarówno funkcjonalną ocenę drenażu znacznika, jak i szczegółową charakteryzację morfologiczną sieci grzbietowych MLV.

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu

Naucz się techniki seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cisterna magna u myszy transgenicznych modeli choroby Alzheimera. Ta metoda umożliwia dokładne monitorowanie biomarkerów Aβ i tau w czasie.

Technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cysterny wielkiej u myszy

Przeglądaj więcej filmów