Name: Pipety z polerowaniem ciśnieniowym dla lepszego zapisu z zaciskiem krosowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj technikę polerowania ciśnieniowego mikropipet szklanych do elektrofizjologii. Ta metoda pozwala zmniejszyć rezystancję pipety bez zwiększania średnicy końcówki, poprawiając jakość zapisów z małych komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Technika polerowania pod ciśnieniem została opracowana we współpracy z S. R. Lockery.

Wytwarzanie pipet
Używając wyciągacza kapilar, takiego jak Sutter P-97 Flaming/Brown Microelectrode Puller, przygotuj zestaw około 10-20 pipet.
<ol>
<li>Wybierz odpowiednie szkło. My stosujemy szkło borokrzemowe (BF150-86-10, OD = 1.5 mm, ID = 0.86 mm). Przechowuj szkło ostrożnie, aby pozostało czyste i wolne od kurzu.</li>
<li>Opracuj program wyciągania. Głównym celem jest uzyskanie otworu końcówki o rozmiarze zbliżonym do pożądanego, co zależy od zastosowania. Doskonałym źródłem referencyjnym jest P-97 Pipette Cookbook 2 firmy Sutter.</li>
<li>Obejrzyj pipety pod mikroskopem, aby określić średnicę otworu oraz gładkość końcówki. Odrzuć końcówki chropowate, nierówne lub nieregularne. Dla standardowych pomiarów patch-clamp najlepszy jest otwór końcówki o średnicy 2-4 μm. Preferowana jest tępa końcówka, która zapewnia niższą rezystancję przy tej samej średnicy otworu. Kształt i rozmiar można zmodyfikować podczas polerowania, opisanego poniżej.</li>
</ol>
Polerowanie pipet pod ciśnieniem
<ol>
<li>Podłącz uchwyt pipety do czystej linii sprężonego powietrza. Za pomocą regulatora ustaw ciśnienie w linii sprężonego powietrza na ~40 PSI. Podłącz linię sprężonego powietrza do 4-drogowego zaworu sterującego, który umożliwi włączanie i wyłączanie ciśnienia w uchwycie pipety. Połącz uchwyt pipety z zaworem sterującym za pomocą odcinka ⅛ in rurki Tygon®.</li>
<li>Użyj zestawu do polerowania (mikroforge) z wysokociśnieniowym uchwytem pipety, cewki polerującej sterowanej pedałem oraz mikroskopu wyposażonego w obiektywy powietrzne o niskim i wysokim powiększeniu z dużą odległością roboczą (idealnie 10x i 100x). Kluczowe jest umożliwienie obserwacji otworu pipety podczas wykonywania procedury.</li>
<li>Opcjonalnie:&nbsp;Pokryj pipetę hydrofobowym izolatorem, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę szumów (technikę tę opisano w sekcji „Wyciąganie pipet”).</li>
<li>Upewnij się, że zawór ciśnienia znajduje się w pozycji zamkniętej. Umieść pipetę w uchwycie i dokręć złącze palcami. Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Jeśli pipeta zostanie zbyt mocno wciśnięta w uchwyt, ciśnienie powietrza może spowodować jej wyrzucenie z uchwytu. </li>
<li>Umieść pipetę wraz z uchwytem w mikroforge. Ustaw uchwyt pipety na stoliku mikroskopu tak, aby zarówno końcówka, jak i cewka polerująca były widoczne przy małym powiększeniu (10x) w mikroforge. Przysuń końcówkę na odległość ~75 mikronów od włókna. Pamiętaj, że włókno rozszerza się podczas nagrzewania.</li>
<li>Przełącz na obiektyw o dużym powiększeniu (100x). Zarówno końcówka pipety, jak i cewka polerująca powinny być w ostrości i w polu widzenia. Jeśli tak nie jest, dostosuj wysokość cewki polerującej (pozycji pipety nie można zmienić). Końcówka pipety i cewka polerująca powinny znajdować się blisko przeciwległych krawędzi pola widzenia. Unikaj ustawiania cewki zbyt blisko końcówki pipety, ponieważ podczas nagrzewania ulegnie ona rozszerzeniu i uderzy w pipetę.</li>
<li>Otwórz zawór, aby skierować sprężone powietrze do pipety, i nagrzewaj końcówkę pipety, aż zwężenie za końcówką zacznie wybrzuszać się na zewnątrz.</li>
<li>Przerwij nagrzewanie, zanim końcówka nadmiernie się wybrzuszy. Wymagane są próby w celu ustalenia odpowiedniej odległości, temperatury i czasu potrzebnego do uzyskania pożądanego kształtu.</li>
<li>Opcjonalnie: Zmniejsz średnicę otworu końcówki, polerując ją bez przyłożonego ciśnienia. Kroki 7 i 8 można powtórzyć, aby precyzyjnie dostosować kształt i wymiary końcówki pipety.</li>
<li>Wyłącz ciśnienie i, kierując końcówkę pipety w bezpiecznym kierunku, wyjmij pipetę i umieść ją w czystym pudełku do przechowywania, w którym będzie chroniona przed kurzem. Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Jeśli ciśnienie powietrza nie zostanie wyłączone, pipeta może zostać wyrzucona z uchwytu podczas wyjmowania.</li>
</ol>
Uwagi dotyczące mikrokuźni
Używamy mikrokuźni złożonej z ogólnodostępnych, komercyjnych części. (Można również kupić zestaw do polerowania ciśnieniowego od kilku firm, np. ALA Science, GlassWorx). Niezależnie od rodzaju mikrokuźni, niezbędne jest posiadanie optyki pozwalającej na dostrzeżenie otworu w końcówce, który często ma średnicę zaledwie kilku µm. W tym celu stosujemy obiektyw 100x o długiej odległości roboczej. Ponadto należy pokryć cewkę polerującą szkłem o wysokiej temperaturze topnienia, aby zminimalizować osadzanie się odparowanego metalu na pipetach.
Część 3: Przewidywane wyniki
Polerowanie pod umiarkowanym naciskiem może zmniejszyć oporność pipety bez znaczącej zmiany średnicy otworu. Jeśli jest to wymagane, niniejszy protokół można wykorzystać do wykonania pipet z otworami o rozmiarach submikronowych i opornością w zakresie 5-10MΩ.

<ol><li>Goodman, M. B., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+polishing%3A+a+method+for+re-shaping+patch+pipettes+during+fire+polishing.%C2%A0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. .</a> J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).</li>
<li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Opracowaliśmy tę metodę pierwotnie w celu dostosowania pipet do rejestracji metodą patch-clamp z neuronów o rozmiarach 2-3 µm u C. elegans 1. Jest ona rutynowo stosowana w laboratorium Goodmana. Wykorzystujemy polerowanie pipet pod ciśnieniem nie tylko do rejestracji z niewielkich neuronów C. elegans, ale również do uzyskiwania zapisów macropatch i pojedynczych kanałów z kanałami jonowymi ekspresowanymi w oocytach Xenopus. Dla danej średnicy otworu końcówki, tępy kształt pozwala uzyskać pipet...

<table><tbody><tr><td>Kapilary szklane</td><td>Materiały eksploatacyjne</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-85-10 (lub podobne)</td><td>Metoda działa z każdym typem kapilar z wyjątkiem tych wykonanych z kwarcu. Zalecamy jednak stosowanie kapilar z włóknem.</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL (lub podobny)</td><td>Wystarczy dowolny prosty mikroskop odwrócony. Niezbędne jest jednak zapewnienie odpowiedniego powiększenia, aby widzieć pipety podczas polerowania. W tym celu stosujemy obiektyw metalurgiczny 100x z dużą odległością roboczą.</td></tr><tr><td>Zestaw do mikroforge’owania</td><td>Narzędzie</td><td>ALA Science</td><td>CPM-2</td><td>Zawiera cewkę polerującą, sterownik i pedał.</td></tr><tr><td>Źródło ciśnienia powietrza</td><td>Narzędzie</td><td>ALA Science</td><td>PR-60</td><td>Akcesorium do zapewnienia wysokiego ciśnienia, zawiera odpowiedni zawór. Alternatywnie można użyć sprężonego powietrza z sieci budynkowej wraz z filtrem/regulatorem (ustawionym na 40 PSI) i zaworem 4-drożnym (patrz poniżej)</td></tr><tr><td>Zawór 4-drożny</td><td>Narzędzie</td><td>Cole-Parmer</td><td>A-98150-01</td><td>Do połączenia zaworu z przewodami będą potrzebne odpowiednie złączki</td></tr><tr><td>Uchwyt do pipet z łącznikiem Luer</td><td>Narzędzie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH-6S20</td><td>Użyj złączki typu luer-do-kolca, aby połączyć uchwyt do pipet z przewodami wysokociśnieniowymi</td></tr><tr><td>Przewody Tygon&amp;#174;</td><td>Narzędzie</td><td>Cole-Parmer</td><td>06408-62</td><td>Użyj tych przewodów do połączenia uchwytu do pipet z zaworem 4-drożnym</td></tr></tbody></table>

polerowanie pipet pod ciśnieniem w celu poprawy jakości rejestracji metodą patch-clamp

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Polerowanie ciśnieniowe jest metodą kształtowania pipet szklanych do rejestracji patch-clamp. Opracowaliśmy tę metodę początkowo w celu wytwarzania pipet odpowiednich do rejestracji z niewielkich (&lt;3 m) ciał neuronów. Podstawowa zasada jest podobna do dmuchania szkła i łączy ciśnienie powietrza oraz ciepło w celu modyfikacji kształtu pipet patch przygotowanych za pomocą konwencjonalnej wyciągarki mikrokapilar. Metoda ta może być stosowana do tzw. szkła miękkiego (sodowo-wapiennego) oraz twardego (borokrzemianowego). Ogólnie rzecz ujmując, polerowanie ciśnieniowe może zredukować oporność pipety o 25% bez zmniejszania średnicy otworu końcówki (Goodman and Lockery, 2000). Można ją zastosować praktycznie do każdego rodzaju szkła, a wymaga jedynie dodania zaworu wysokociśnieniowego i złączki do mikrokuźni. Technika ta jest niezbędna do rejestracji z ultra-małych komórek (&lt;5 m) i może również poprawić rejestrację pojedynczego kanału poprzez zminimalizowanie oporności pipety. Tępy kształt końcówki jest ponadto przydatny w rejestracji metodą perforated-patch clamp, ponieważ taki kształt końcówki pozwala na uzyskanie większego pęcherzyka błony dostępnego do perforacji.

Niniejszy przewodnik opisuje metodę modyfikacji kształtu szklanych mikropipet. W szczególności, poprzez zastosowanie ciepła i ciśnienia powietrza, poszerza się zwężenie pipety bez zwiększania otworu końcówki, co prowadzi do obniżenia oporu pipety. Jest to kluczowe dla uzyskania pomiarów o niskim poziomie szumów w małych komórkach, lecz znajduje zastosowanie w wielu innych obszarach.

Polerowanie pipet pod ciśnieniem w celu poprawy jakości rejestracji metodą patch-clamp

Polerowanie ciśnieniowe jest metodą kształtowania pipet szklanych do rejestracji metodą patch-clamp. Opracowaliśmy tę metodę w celu wytwarzania pipet odpowiednich do...

Procedura rozpoczyna się od ustawienia końcówki pipety w pobliżu włókna polerującego przy 100-krotnym powiększeniu. Następnie należy włączyć ciśnienie powietrza oraz ogrzewanie. Włókno.Końcówka pipety rozszerzy się, tworząc tępy kształt. Wyłącz grzanie, aby uzyskać mniejszy otwór końcówki. Ponownie wyłącz ciśnienie i grzanie.Witam, jestem Brandon Johnson z laboratorium dr Miriam Goodman z Katedry Fizjologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Stanforda. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę polerowania ciśnieniowego pipet patch. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania kanałów jonowych i płatów błonowych w neuronach NC elgan.Zacznijmy zatem. Przygotuj zestaw od sześciu do 10 pipet patch. W razie potrzeby skorzystaj z pomocy lokalnego eksperta lub obejrzyj nasz materiał wizualny dotyczący wytwarzania pipet patch i mikroelektrod za pomocą programowalnego wyciągacza.Aby rozpocząć procedurę, ustaw ciśnienie w linii sprężonego powietrza na około 40 PS.I, a następnie podłącz linię sprężonego powietrza do czuńcowego zaworu sterującego. Podłącz odcinek plastikowej rurki do zaworu czuńcowego i przymocuj uchwyt pipety wysokociśnieniowej do wolnego końca plastikowej rurki. Do wykonania polerowania użyj zestawu mikrokuźni.Używamy zestawu Ccpm two firmy LA Scientific. Urządzenie to posiada uchwyt do pipety wysokociśnieniowej, platynowy drut grzejny sterowany pedałem oraz mikroskop wyposażony w obiektywy o niskim i wysokim powiększeniu (10-krotnym i 100-krotnym) z długą odległością roboczą, co jest istotne, ponieważ kluczowa jest możliwość obserwacji otworu pipety podczas wykonywania procedury.Następnie należy upewnić się, że zawór ciśnienia znajduje się w pozycji wyłączonej. Potem należy umieścić pipetę w uchwycie na pipety i dokręcić złączkę palcami, aby zapewnić bezpieczeństwo w laboratorium. Należy upewnić się, że pipeta jest mocno osadzona w uchwycie.W przeciwnym razie ciśnienie powietrza spowoduje wysunięcie pipety z uchwytu. W ramach opcjonalnego kroku można pokryć pipetę hydrofobowym izolatorem, np. woskiem, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę szumów. Teraz umieść pipetę w uchwycie w pozycji mikrokucia, ustawiając uchwyt pipety na stoliku mikroskopu tak, aby zarówno końcówka, jak i włókno polerujące były widoczne przy niskim powiększeniu 10x w urządzeniu do mikrokucia.Zbliż końcówkę na odległość około 50 mikronów od włókna, a następnie przełącz na obiektyw 100 o wysokiej rozdzielczości; zarówno końcówka pipety, jak i włókno polerskie powinny być w ostrości i znajdować się w polu widzenia. Jeśli tak nie jest, dostosuj wysokość włókna. Ponieważ pozycja pipety nie może zostać skorygowana, końcówka pipety i włókno powinny znajdować się po przeciwnych stronach pola widzenia.Należy unikać umieszczania końcówki pipety zbyt blisko włókna, ponieważ będzie ono zwiększać swoją objętość podczas nagrzewania, co może spowodować uderzenie w pipetę. Po prawidłowym ustawieniu końcówki i włókna należy przekręcić zawór, aby skierować sprężone powietrze do pipety i nagrzewać jej końcówkę do momentu, aż zwężenie za końcówką zacznie wybrzuszać się na zewnątrz. Należy przerwać nagrzewanie, zanim końcówka wybrzuszy się zbyt mocno.Wymagane jest przeprowadzenie eksperymentów w celu ustalenia odpowiedniej odległości, temperatury i czasu potrzebnych do uzyskania pożądanego kształtu. Jako opcjonalny krok można również polerować końcówkę bez przyłożenia nacisku, aby zmniejszyć średnicę otworu końcówki. Należy pamiętać, że etapy polerowania te można powtarzać w celu precyzyjnego dopasowania.Dostosuj zarówno kształt, jak i wymiary końcówki pipety. Po zakończeniu polerowania wyłącz urządzenie i skieruj końcówkę pipety w bezpieczną stronę.Wyjąć pipetę i umieścić ją w czystym pudełku do przechowywania, aby chronić ją przed kurzem. Ze względów bezpieczeństwa w laboratorium należy upewnić się, że ciśnienie zostało odcięte przed wyjęciem pipety. W przeciwnym razie może ona zostać wyrzucona z uchwytu pipety.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak polerować pipety ciśnieniowo w celu poprawy rejestracji w technice patch clamp. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o pokryciu cewki polerującej szkłem o wysokiej temperaturze topnienia, aby zminimalizować osadzanie się odparowanego metalu na pipetach, oraz o zachowaniu ostrożności, gdy pipety są poddane działaniu sprężonego powietrza.Upewnij się, że pipeta jest mocno osadzona w uchwycie i wyłącz dopływ powietrza przed wyjęciem pipety z uchwytu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie.Życzymy owocnego polerowania naciskowego i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

pressure-polishing-pipettes-for-improved-patch-clamp-recording

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pipety do polerowania ciśnieniowego w celu poprawy rejestracji patch-clamp

W tym filmie pokazano, jak używać programowalnej wyciągarki do wykonywania pipet do patch-clampu oraz ostrych elektrod do elektrofizjologii. Tę samą procedurę można zastosować do wykonania różnych narzędzi szklanych, w tym igieł do iniekcji.

Wytwarzanie pipet do patch-clamp oraz mikroelektrod za pomocą programowalnej wyciągarki

Wykorzystujemy technikę patch-clamp do pomiaru prądów pojedynczych kanałów aktywowanych przez GABA (kanały GABAA, receptory GABAA) oraz generowanych przez nie prądów synaptycznych i tonicznych w neuronach. Aktywacja kanałów zmniejsza pobudliwość neuronów w stanach zdrowia i choroby 1,2,3,4.

Prądy pojedynczego kanału i prądy toniczne aktywowane przez GABA w skrawkach mózgu szczura

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Ten film demonstruje technikę nagrywania za pomocą zacisku krosowego z powierzchni membrany dendrytycznej. Pomaga to bezpośrednio badać właściwości elektryczne dendrytów i leżących u ich podstaw kanałów jonowych bramkowanych napięciem w neuronach dopaminergicznych.

Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Wieloelektrodowe nagrania patch-clamp stanowią skomplikowane zadanie. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób, poprzez automatyzację wielu etapów eksperymentu, można przyspieszyć proces prowadzący do jakościowej poprawy wydajności i liczby nagrań.

Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Subcellular patch-clamp recordings dają możliwość zbadania funkcjonalnych właściwości dendrytów. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne ze względu na ich małą średnicę. Opisany tutaj protokół ma na celu ułatwienie zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminowych w wycinkach in vitro.

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Protokół ten opisuje, jak przeprowadzać rejestracje elektryczne z komórek plemników ssaków w konfiguracji całej komórki, z celem bezpośredniego rejestrowania aktywności kanałów jonowych. Metoda ta odegrała kluczową rolę w opisie elektrofizjologicznych profili kilku kanałów jonowych plemników i pomogła ujawnić ich tożsamość molekularną oraz regulację.

Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

Przedstawione tutaj są metody dostarczające szczegółowych instrukcji do preparowania, dysocjacji, hodowli i rejestracji patch-clamp z neuronów zwojów przedsionkowych i spiralnych ucha wewnętrznego.

Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę bezpośredniego pomiaru aktywności kanałów jonowych na wewnątrzkomórkowych pęcherzykach za pomocą ręcznego endolizosomalnego systemu patch-clamp. Ilustrujemy metodę polegającą na powiększaniu endolizosomów i ręcznym izolowaniu tych pęcherzyków. Takie podejście gwarantuje, że badacze mogą dokładnie odtworzyć i zastosować procedurę.

Techniki patch-clamp do analizy pojedynczych pęcherzyków endolizosomalnych

Poznaj technikę polerowania ciśnieniowego mikropipet szklanych do elektrofizjologii. Ta metoda pozwala zmniejszyć rezystancję pipety bez zwiększania średnicy końcówki, poprawiając jakość zapisów z małych komórek nerwowych.

Polerowanie pipet pod ciśnieniem w celu poprawy jakości rejestracji metodą patch-clamp

Przeglądaj więcej filmów