Pipety z polerowaniem ciśnieniowym dla lepszego zapisu z zaciskiem krosowym
22 października 2008
To jest przewodnik po modyfikacji kształtu szklanych mikropipet. W szczególności, dzięki zastosowaniu ciepła i ciśnienia powietrza, stożek jest poszerzany bez zwiększania otworu końcówki, co prowadzi do mniejszego oporu pipety. Ma to kluczowe znaczenie dla uzyskania nagrań o niskim poziomie szumów małych komórek, ale jest przydatne w wielu zastosowaniach.
Ta procedura rozpoczyna się od umieszczenia końcówki pipety w pobliżu filamentu polerskiego pod 100-krotnym powiększeniem. Następnie włącz ciśnienie powietrza i ciepło. Żarnik.
Końcówka pipety rozszerzy się, tworząc końcówkę. Wyłącz ogień, aby uzyskać mniejszy otwór na końcówkę. Ponownie wyłącz ciśnienie i ogrzewanie.
Cześć, nazywam się Brandon Johnson i pracuję w laboratorium dr Miriam Goodman na Wydziale Fizjologii Molekularnej i Komórkowej Uniwersytetu Stanforda. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę stosowania ciśnieniowych pipet z plastrami. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania kanałów jonowych i plam błonowych oraz neuronów Elgana NC.
Więc zacznijmy. Wyciągnij zestaw od sześciu do 10 pipet z plastrami. Skonsultuj się z lokalnym ekspertem lub naszym wizualizacją eksperymentu z pipetami plastrowymi i ostrymi elektrodami z programowalnym biegunem, aby uzyskać pomoc.
Aby rozpocząć procedurę, ustaw ciśnienie w przewodzie sprężonego powietrza na około 40 PS. Następnie podłączam przewód sprężonego powietrza do czterodrogowego zaworu sterującego. Podłącz kawałek plastikowej rurki do zaworu czterodrogowego i przymocuj uchwyt na pipetę wysokociśnieniową do luźnego końca plastikowej rurki. Użyj mikro kuźni, aby wykonać polerowanie.
Używamy zestawu Ccpm two firmy LA Scientific. Ten zestaw posiada wysokociśnieniowy uchwyt na pipety, platynowy filament grzewczy sterowany pedałem nożnym oraz mikroskop wyposażony w małe i wysokie powiększenie 10 razy na 100 razy długości. Obiektywy pneumatyczne działające na odległość roboczą są idealne, ponieważ bardzo ważna jest możliwość obserwacji otwarcia pipety podczas protokołu.
Następnie sprawdź, czy zawór ciśnieniowy jest w pozycji wyłączonej. Następnie umieść pipetę w uchwycie na pipety i dokręć złączkę palcami dla bezpieczeństwa laboratorium. Upewnij się, że pipeta jest mocno trzymana w uchwycie na pipety.
W przeciwnym razie ciśnienie powietrza spowoduje wysunięcie pipety z uchwytu. Opcjonalnie można pokryć pipetę hydrofobowym izolatorem, takim jak wosk, w celu zmniejszenia pojemności i poprawy charakterystyki hałasu. Teraz umieść pipetę w uchwycie w mikrokuźni, umieść uchwyt pipety na stoliku mikroskopu, tak aby zarówno końcówka, jak i włókno polerskie były widoczne przy niskiej 10-krotnej mocy na mikrokuźni.
Umieść końcówkę na około 50 mikronów od żarnika, a następnie przełącz się na obiektyw o dużej mocy 100, zarówno końcówka pipety, jak i filament polerujący powinny być ostre i w polu view. Jeśli nie, dostosuj wysokość filamentu. Ponieważ nie można regulować położenia pipety, końcówka pipety i żarnik powinny znajdować się po przeciwnych stronach pola widzenia.
Unikaj umieszczania końcówki pipety zbyt blisko filamentu, ponieważ będzie się ona rozszerzać podczas nagrzewania i może uderzyć w pipetę. Po prawidłowym umieszczeniu końcówki i filamentu przekręć zawór, aby skierować sprężone powietrze do pipety i podgrzej końcówkę pipety, aż stożek za końcówką zacznie wybrzuszać się na zewnątrz. Zatrzymaj ogrzewanie, zanim końcówka zbyt mocno się wybrzuszy.
Wymagane są eksperymenty, aby określić odpowiednią odległość, ciepło i czas dla pożądanego kształtu. Opcjonalnie można również wypolerować końcówkę przy braku nacisku, aby zmniejszyć średnicę otworu końcówki. Należy również pamiętać, że te kroki polerowania można powtarzać z dokładnością.
Dostosuj zarówno kształt, jak i wymiary końcówki pipety. Po zakończeniu polerowania. Wyłącz punkt nacisku końcówki pipety w bezpiecznym kierunku.
Wyjmij pipetę i umieść ją w czystym pudełku do przechowywania, w którym będzie chroniona przed kurzem. Ze względu na bezpieczeństwo laboratorium należy wyłączyć ciśnienie przed wyjęciem pipety. W przeciwnym razie można go wysunąć z uchwytu na pipety.
Po usunięciu właśnie pokazaliśmy, jak naciskać na pipety polerskie, aby uzyskać lepsze nagrania z zaciskiem krosowym. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pokryciu cewki polerskiej szkłem o wysokiej temperaturze topnienia, aby zminimalizować osadzanie się odparowanego metalu na pipetach. Należy zachować ostrożność, gdy pipety są wystawione na działanie sprężonego powietrza.
Upewnij się, że pipeta jest mocno trzymana w uchwycie i należy wyłączyć dopływ powietrza przed wyjęciem pipety z uchwytu. Więc to wszystko. Dzięki za oglądanie.
Szczęśliwego polerowania ciśnieniowego i powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy przewodnik szczegółowo opisuje modyfikację kształtu szklanych mikropipet przy użyciu ciepła i ciśnienia powietrza. Proces ten umożliwia poszerzenie stożka bez zwiększania otworu końcówki, co jest niezbędne do uzyskania rejestracji o niskim poziomie szumów w badaniach nad małymi komórkami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Wytwarzanie mikropipet
Wstęp
- Szklane mikropipety są kluczowymi narzędziami w rejestracjach elektrofizjologicznych.
- Niższa rezystancja pipety jest niezbędna do uzyskania wysokiej jakości rejestracji.
- Modyfikacja kształtu może poprawić wydajność w różnych zastosowaniach.
- Technika ta jest szczególnie korzystna przy rejestracjach z małych komórek.
Cel badania
- Przedstawienie metody formowania szklanych mikropipet.
- Zmniejszenie oporu pipety bez powiększania otworu końcówki.
- Poprawa jakości rejestracji z małych komórek.
Zastosowane metody
- Ustawienie końcówki pipety w pobliżu włókna polerskiego przy dużym powiększeniu.
- Przyłożenie ciśnienia powietrza i ciepła w celu rozszerzenia końcówki pipety.
- Wyłączenie ogrzewania w celu uzyskania mniejszego otworu końcówki.
- Końcowe korekty poprzez wyłączenie ciśnienia i ogrzewania.
Główne wyniki
- Koniec pipety można skutecznie przekształcić w formę tępą.
- Niższą oporność uzyskuje się bez zwiększania rozmiaru końcówki.
- Metoda ta poprawia jakość rejestracji z małych komórek.
- Przedstawiono praktyczne podejście do modyfikacji mikropipety.
Wnioski
- Kształtowanie szklanych mikropipet jest cenną techniką w badaniach nad układem nerwowym.
- Udoskonalona konstrukcja pipety przekłada się na lepszą jakość danych.
- Metodę tę można zastosować w różnych badaniach elektrofizjologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Polerowanie pipet pod ciśnieniem zmniejsza oporność elektryczną w rejestracjach metodą patch-clamp bez zmiany średnicy końcówki, co umożliwia pomiary kanałów jonowych o wyższej wierności w małych populacjach neuronów. Ta ulepszona technika wspomaga walidację celów w procesie odkrywania leków w neuronauce poprzez poprawę stosunku sygnału do szumu w badaniach elektrofizjologicznych. Wyższa jakość rejestracji zwiększa pewność predykcyjną w wczesnych badaniach mechanistycznych nad pobudliwością neuronów i funkcją synaptyczną.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji kanałów jonowych w neuronach o małej średnicy, które mają kluczowe znaczenie dla celów terapeutycznych w leczeniu bólu neuropatycznego i epilepsji.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność w rejestracjach pojedynczych kanałów poprzez minimalizację szumów wywoływanych przez pipetę.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanej geometrii pipet w celu zapewnienia powtarzalności paneli przesiewowych w elektrofizjologii.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z mikropipetami z miękkiego i twardego szkła umożliwia elastyczne projektowanie testów dla różnych klas celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera zastosowania metody perforated-patch clamp poprzez tworzenie tępych końcówek, które zwiększają tworzenie się pęcherzyków błonowych w przypadku stosowania perforatorów antybiotykowych.
- Wartość operacyjna: Wydłuża czas rejestracji w pierwotnych kulturach neuronalnych, zwiększając przepustowość badań nad optymalizacją związków wiodących.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych, w których fenotypowanie elektrofizjologiczne służy do wyboru celu molekularnego oraz profilowania związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia walidację funkcjonalną celów w postaci kanałów jonowych w modelach neuronalnych istotnych dla przebiegu chorób.
- Przesiewanie: Zapewnia pipety o niskiej rezystancji do wysokowiernego przesiewania związków na platformach patch-clamp.
- Analityka: Pozwala na uzyskanie ilościowych pomiarów prądu i przewodnictwa z poprawioną stabilnością sygnału.
- Badania translacyjne: Ułatwia długofalowe rejestracje w ostrych skrawkach oraz hodowlach neuronów na potrzeby modelowania farmakokinetycznego i farmakodynamicznego.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Wymaga jedynie aktualizacji mikrokuźni, co czyni to rozwiązanie skalowalnym i niskokosztowym usprawnieniem istniejącej infrastruktury elektrofizjologicznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu dzięki czystszym fenotypom elektrofizjologicznym.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność testów pomiędzy ośrodkami i operatorami poprzez standaryzację geometrii pipet.
- Wartość strategiczna: Redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych w przesiewaniu kanałów jonowych poprzez minimalizację szumu technicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje go/no-go w programach przedklinicznych celujących w pobudliwość neuronalną.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w posługiwaniu się mikropipetami oraz w elektrofizjologii.
- Wymagany jest mikrokuźnia (microforge) wyposażona w zawór wysokociśnieniowy, drucik grzejny oraz optykę powiększającą.
- Niezbędna jest standaryzacja parametrów ciśnienia, temperatury i czasu dla wszystkich operatorów.
- Należy uwzględnić różnice w reakcji na polerowanie w zależności od rodzaju szkła (sodowo-wapniowe vs borokrzemianowe).
- Metoda jest ograniczona koniecznością ręcznego pozycjonowania końcówki oraz umiejętnościami operatora w celu uniknięcia nadmiernego rozszerzenia.
