Protokół hodowli neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczura

Procedura ta rozpoczyna się od wyizolowania górnych zwojów szyjnych układu współczulnego od noworodkowych szczurów w dniu 0 (P0). Każdy mózg posiada dwa górne zwoje szyjne układu współczulnego. Z jednego miotu szczurząt można pozyskać około 24 zwoje.

Dysocjacja zwojów rozpoczyna się od inkubacji i obróbki przez 30 minut. Dalszą dysocjację przeprowadza się poprzez powtarzające się traktowanie wypalaną pipetą Pasteura, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Neurony współczulne są następnie wysiewane na płytki powlekane kolagenem ENC.

Witam, nazywam się Nila Zurin i pracuję w laboratorium dr. Lloyda Greena w Katedrze Patologii i Biologii Komórki na Uniwersytecie Columbia w Nowym Jorku. Dzisiaj zaprezentujemy, jak izolować i hodować pierwotne neurony współczulne z zwojów szyjnych górnych nowonarodzonych szczurów. W naszym laboratorium wykorzystujemy te komórki zazwyczaj do badania apoptozy w odpowiedzi na odstawienie czynnika wzrostu nerwów.

Zacznijmy zatem. Procedurę rozpoczynamy od pokrycia naczynia hodowlanego kolagenem z ogona szczura na 24 godziny przed przeprowadzeniem sekcji. W zależności od charakteru eksperymentu stosuje się płytkę hodowlaną 24- lub 48-dołkową.

Następnie zostaną przygotowane pożywki i sprzęt. Materiały i odczynniki te można znaleźć w tekście protokołu towarzyszącego temu filmowi. Należy pamiętać, że roztwór urydyny i 5-FDU należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Kontynuuj przygotowanie za pomocą ognia. Wypalaj szklane pipety pasterskie dla etapów miareczkowania. Końcówkę szklanej pipety należy trzymać w płomieniu przez kilka sekund, obracając ją, aby ją zwęzić i wygładzić.

Wstępne polerowanie ogniowe należy przeprowadzić w sterylnej komorze do hodowli komórkowych. Aby rozpocząć sekcję, należy pobrać noworodkowe szczury w okresie od P0 do P1. Noworodka szczura szybko przeciera się 70% etanolem w celu ograniczenia kontaminacji.

Po przeprowadzeniu dekapitacji głowę umieszcza się na podkładce sekcyjnej stroną brzuszzną do góry, tak aby tylna część była skierowana w stronę badacza. Przecięta tchawica powinna być wyraźnie widoczna. Aby przymocować odciętą głowę do podkładki sekcyjnej, należy użyć sterylnych igieł w następujący sposób.

Wbij jedną szpilkę przez podniebienie w podkładkę sekcyjną, a drugą szpilkę przez przerwany rdzeń kręgowy w podkładkę. Po przesunięciu podkładki sekcyjnej pod mikroskop i spojrzeniu przez okulary, użyj dwóch par pęset, aby usunąć skórę i tkankę tłuszczową wokół tchawicy. Zachowując ostrożność, aby nie zagłębić się zbyt mocno, po obu stronach tchawicy odsłonięta zostanie para mięśni przebiegających niemal równolegle do siebie.

Podczas sekcji należy przemywać preparat zimnym sterylnym PBS lub zimną pożywką RPMI 1640 bez surowicy, podawaną za pomocą sterylnej pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar krwi. Czynność tę można powtórzyć raz lub wielokrotnie, w zależności od tempa pracy. Następnie za pomocą pincety należy rozciąć i usunąć mięsień z jednej strony.

Po usunięciu mięśnia widoczna stanie się tętnica szyjna. Tętnica ta biegnie wzdłuż tchawicy i rozwidla się, tworząc strukturę przypominającą wstęgę w kształcie litery Y. Rozwidlenie to jest ważnym punktem orientacyjnym, a po jego zlokalizowaniu stosunkowo łatwo będzie odnaleźć zwoje szyjne górne.

Tętnicę przecina się na najbardziej dystalnym końcu i lekko unosi za pomocą pincety. Drugi koniec tętnicy pozostaje przytwierdzony. Po wykonaniu tej czynności widoczny stanie się zwoj szyjny górny.

Należy upewnić się, że jest to mała, błyszcząca masa tkanki o migdałowatym kształcie, luźno przytwierdzona do tętnicy w punkcie jej rozwidlenia, posiadająca nitkowate połączenia przed- i/lub pozaganglionalne. Za pomocą drugiej pary pęsety należy delikatnie oddzielić zwoi szyjny górny i umieścić go w małej 35 milimetrowej szalce hodowlanej zawierającej zimne podłoże RPMI 1640 bez surowicy. Następnie, zgodnie z tym samym protokołem, należy wyekstrahować zwoi po drugiej stronie tchawicy.

Po wypreparowaniu wszystkich zwojów, należy w jak największym stopniu oczyścić je z tkanek obcych. Patrząc przez okular mikroskopu, można zauważyć, że do zwojów przytwierdzone są fragmenty tłuszczu z tętnicy szyjnej lub inne tkanki; do usunięcia tych niepożądanych materiałów należy użyć pęsety. Należy również odciąć połączenia przed- i/lub pozazwojowe.

Każdy zwoj ma około 10 000 neuronów. Po wysianiu neuronów, ich wypustki ulegną regeneracji. Następnie zwoje umieszcza się w sterylnym, 15-mililitrowym stożkowym probówce z polipropylenu zawierającej pożywkę RPMI 1640.

Następnie tworzy się kulturę neuronów współczulnych. Zwoje poddaje się wirowaniu przy 200 G przez dwie minuty, a następnie usuwa się znad. Zwoje resuspenduje się w 0,5 do 1 ml 0,25% roztworu trypsyny, po czym umieszcza w kąpieli wodnej lub inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut, aby wspomóc dysocjację komórek w zwojach.

Po 30 minutach dodaje się 10 mililitrów pożywki kompletnej w celu rozcieńczenia i neutralizacji trypsyny. Następnie roztwory wiruje się przy 200 G przez dwie minuty. Następnie odrzuca się supernatant, a zwoje resuspendsuje w dwóch mililitrach pożywki końcowej.

Używając jednej z wcześniej przygotowanych, wypalanych nad ogniem końcówek pipety o szerokim otworze, komórki są dalej dysocjowane poprzez 20-krotne zasysanie i wypuszczanie zwojów. Następnie probówkę umieszcza się w lodzie na kilka minut. W kolejnym kroku końcówkę pipety ponownie wypala się nad ogniem, aby jeszcze bardziej zwęzić jej otwór.

Po ostygnięciu pipety zwoje są rozcierane (tryturacja) jeszcze 20 razy. Pożywka będzie stawać się stopniowo bardziej mętna, co wskazuje na dysocjację komórek. Krok ten powtarza się raz lub dwa razy więcej, w zależności od stopnia dysocjacji komórek.

Po pewnym czasie zwoje ulegną dysocjacji do formy pojedynczych neuronów i w probówce nie będą już widoczne nienaruszone zwoje. Na tym etapie może pozostać niewielka ilość materiału tkankowego, który nie uległ dysocjacji. Probówkę pozostawia się na lodzie przez kilka minut, aby wszelkie niezdysocjowane resztki mogły osiąść na dnie.

Ostrożnie zbiera się cały supernatant, z wyjątkiem około 50 µL, i przenosi go do innej probówki. Na dnie probówki pozostawia się 50 µL, aby zapobiec przeniesieniu niepowiązanych zanieczyszczeń. Do probówki zawierającej zdysocjowane komórki dodaje się więcej końcowego medium.

Objętość dodawanego pożywki końcowej zależy od rodzaju płytki hodowlanej używanej do hodowli neuronów. Na przykład, w przypadku zastosowania płytki 24-dołkowej, należy umieścić jedno zwojenie na dołek w 0,5 milliliters pożywki końcowej na dołek.

Typowy miot szczura składa się z 12 młodych, co pozwala na uzyskanie 24 zwojów. Jest to ilość wystarczająca do wysiania jednej płytki 24-dołkowej, a całkowita objętość końcowego medium wynosi 12 mililitrów. Zastosowanie urydyny 5'-FDU w końcowym medium zapobiegnie proliferacji i przyspieszy obumieranie niewielkiej populacji gleju oraz innych typów komórek.

W trakcie hodowli komórki są karmione co 48 godzin poprzez wymianę dwóch trzecich pożywki. Stosuje się świeże RPMI z dodatkiem 1% surowicy koni, NGF, urydyny oraz pięciu FDU. Początkowo hodowla zawiera neurony sympatyczne, które wyglądają na okrągłe, bez obecności neuronów.

Krótkie neurony stają się widoczne 24 godziny po dysekcji, a z czasem stają się coraz gęstsze i bardziej rozgałęzione. Przedstawiliśmy właśnie sposób izolacji i hodowli pierwotnych neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych nowonarodzonych szczurów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby po pierwsze, poświęcić czas i staranność przy oczyszczaniu zwojów, usuwając wszystkie zanieczyszczenia, naczynia krwionośne oraz tkankę tłuszczową.

Ten krok jest istotny dla zapewnienia kultury, która jest w miarę jednorodna i wolna od obcych typów komórek. Po drugie, podczas etapu dysocjacji należy zachować cierpliwość i poświęcić czas na rozdzielenie neuronów, aby nie tworzyły dużych skupisk. Po ich naniesieniu na płytki, duże skupiska będą utrudniać dalsze prace.

W zastosowaniach końcowych, takich jak przecinanie lub zakażanie neuronów, barwienie immunologiczne może być również utrudnione, a wszelkie eksperymenty wymagające liczenia neuronów będą trudne do przeprowadzenia. Na koniec, nie ma potrzeby uzupełniania medium o penicylinę i streptomycynę przy każdym karmieniu kultur; wystarczy jednorazowe dodanie tych antybiotyków podczas pierwszego wysiewu komórek.

Należy dodawać świeży uridine five FDU do pożywki przy każdej wymianie medium. W naszym laboratorium wykorzystano kulturę neuronów współczulnych do badania apoptozy w odpowiedzi na odstawienie czynnika wzrostu nerwów. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.