Name: Protokół hodowli neuronów współczulnych z górnych zwojów szyjnych szczura (SCG) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj izolację i hodowlę pierwotnych neuronów współczulnych z górnych zwojów szyjnych szczura. Ta metoda umożliwia badanie właściwości komórkowych i apoptozy in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NZ pragnie podziękować członkom laboratorium: Subhasowi Biswasowi, Andrew Sproulowi i Ryanowi Willetowi za przeszkolenie w zakresie dysekcji i pozyskiwania neuronów współczulnych. Praca wspierana była z grantów NIH-NINDS.

1.	Przygotowanie do sekcji:
<ol>
<li>Wybierz odpowiednie naczynie hodowlane (płytki 10 cm, 6-dołkowe lub 24-dołkowe itp.) w zależności od charakteru przeprowadzanych doświadczeń i pokryj je kolagenem z ogona szczura na 24 godziny przed sekcją. Metody przygotowania kolagenu z ogona szczura i jego wykorzystania do pokrywania naczyń hodowlanych zostały opisane w innym opracowaniu (1).</li>
<li>Przygotuj 0,25% roztwór trypsyny w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (bez EDTA) i wysterylizuj go przez filtrację. Przygotuj alikwoty po 1 ml i przechowuj w temperaturze -20ºC.</li>
<li>Przygotuj roztwór zawierający po 2,5 mM urydyny i 5-FDU w destylowanej/dejonizowanej H2O. Wysterylizuj go przez filtrację i przygotuj alikwoty po 50 µl. Przechowuj w temperaturze -20ºC.</li>
<li>Przygotuj pożywkę kompletną: pożywka hodowlana RPMI 1640 z 10% inaktywowaną termicznie surowicą konia (inaktywacja termiczna poprzez inkubację w kąpieli wodnej o temperaturze 56ºC przez 30 minut) i 5% płodową surowicą bydlęcą.</li>
<li>Przygotuj pożywkę końcową: pożywka hodowlana RPMI 1640 z 1% inaktywowaną termicznie surowicą konia + NGF (stężenie końcowe 100ηg/ml) + penicylina/streptomycyna (1/250) + 1/250 roztworu urydyny/5-FDU (stężenie końcowe 10 µM). Uwaga: pożywkę tę należy przygotowywać świeżo przed każdym użyciem. W przypadku doświadczenia w formacie płytki 24-dołkowej konieczne będzie przygotowanie 12 ml tej pożywki. Zaleca się przygotowanie niewielkiej nadwyżki. NGF można nabyć z różnych źródeł komercyjnych (patrz tabela na końcu protokołu).</li>
<li>Sprzęt: Niezbędny będzie mikroskop sekcyjny i źródło światła. Preferowany jest podwójny światłowodowy oświetlacz typu „gęsia szyja” z końcówkami skupiającymi. Ponadto należy oczyścić i wysterylizować (poprzez autoklawowanie lub moczenie w 70% etanolu przez co najmniej 20 minut) następujące narzędzia sekcyjne: dwie pary mikro-pincet sekcyjnych ze stali nierdzewnej oraz parę nożyczek sekcyjnych (również ze stali nierdzewnej, obie marki Roboz). Przydadzą się również dwie sterylne igły do strzykawek (rozmiar 26 G x 1 ½ cala lub podobne). Należy przygotować deskę sekcyjną, która stanowi kawałek styropianu o wymiarach 3”x3”, owinięty folią aluminiową i przykryty chusteczką Kimwipe. Spryskaj deskę 70% etanolem w celu dekontaminacji. Na koniec przygotuj szklaną pipetę Pasteura polerowaną ogniowo. Aby przeprowadzić polerowanie ogniowe, weź szklaną pipetę i trzymaj jej końcówkę w płomieniu przez kilka sekund, obracając nią. Po sprawdzeniu końcówka powinna być gładsza, a otwór węższy. Jest to niezbędne do etapu dysocjacji komórek. Polerowanie ogniowe wykonaj pod wyciągiem do hodowli komórkowych, aby pipeta pozostała sterylna.</li>
</ol>
2. Disekcja zwojów szyjnych górnych:
<ol>
<li>Pobierz noworodki szczura w wieku P0 lub P1.</li>
<li>Szybko przemyj noworodka 70% etanolem przed sekcją, aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji.</li>
<li>Szybko dokonaj dekapitacji noworodka za pomocą ostrych nożyczek (ten etap nie zostanie pokazany na filmie). Przytrzymaj głowę za pomocą sterylnej pęsety przeciwko sterylnej gazie, aby krótko odprowadzić nadmiar krwi.</li>
<li>Umieść głowę na podkładce sekcyjnej stroną brzuszną do góry, a końcem ogonowym skierowanym w Twoją stronę. Przecięta tchawica powinna być wyraźnie widoczna. Użyj sterylnych igieł ze strzykawki, aby przymocować odciętą głowę do podkładki sekcyjnej w następujący sposób: wbij jedną szpilkę przez podniebienie w podkładkę, a drugą szpilkę przez przeciętą tchawicę w podkładkę. Umieść podkładkę pod mikroskopem sekcyjnym i rozpocznij sekcję.</li>
<li>Używając obu pęset (jedna w każdej ręce), usuń skórę i tkankę tłuszczową wokół tchawicy, uważając, aby nie zagłębić się zbyt mocno. Pozwoli to odsłonić parę mięśni biegnących niemal równolegle do siebie po obu stronach tchawicy. Uwaga: podczas sekcji konieczne będzie przemywanie zimnym, sterylnym PBS lub zimną pożywką RPMI 1640 bez surowicy, podawaną sterylną pipetą Pasteura, w celu usunięcia nadmiaru krwi oraz utrzymania obszaru w czystości i wilgotności. Można to zrobić raz lub wielokrotnie, w zależności od tempa pracy. Doświadczonemu sekcjonerowi wypreparowanie pary zwojów zajmuje około dwóch do trzech minut.</li>
<li>Użyj pęsety, aby przeciąć i usunąć mięsień najpierw po jednej stronie.</li>
<li>Po usunięciu mięśnia widoczna stanie się tętnica szyjna wspólna. Często ma ona jasnoróżowy kolor i zawiera krew. Może wydawać się jaśniejsza od innych naczyń krwionośnych widocznych w sąsiedztwie, przez co tętnica szyjna wspólna może nie być od razu zauważalna. Tętnica ta biegnie wzdłuż tchawicy i rozwidla się w kształt przypominający literę „Y”. To rozwidlenie jest ważnym punktem orientacyjnym i po jego zlokalizowaniu stosunkowo łatwo będzie odnaleźć SCG.</li>
<li>Przetnij tętnicę na najbardziej ogonowym końcu i lekko unieś ją pęsetą (drugi koniec pozostaje przyczepiony). Po wykonaniu tej czynności zobaczysz migdałowatą, lśniącą, małą masę tkanki, która jest luźno przytwierdzona do tętnicy dokładnie w punkcie rozwidlenia i posiada nitkowate połączenia przed- i/lub pozwojowe. Jest to górny zwoj szyjny. Użyj drugiej pęsety w drugiej ręce, aby delikatnie go oddzielić i umieścić w małej płytce hodowlanej (35 mm) zawierającej zimną pożywkę RPMI 1640 bez surowicy.</li>
<li>Następnie wypreparuj zwoj po drugiej stronie tchawicy, postępując zgodnie z tym samym protokołem.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie zwojów:
<ol>
<li>Po wypreparowaniu wszystkich zwojów należy je w maksymalnym stopniu oczyścić z tkanek obcych.</li>
<li>Pod mikroskopem sekcyjnym można zauważyć, że do zwojów przyłączone są fragmenty tętnicy szyjnej, tkanka tłuszczowa lub inne tkanki. Używając pęset w obu dłoniach, należy ostrożnie usunąć te niepożądane materiały. Oczyszczone zwoje należy umieścić w sterylnej, stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 15ml, zawierającej pożywkę RPMI 1640.</li>
<li>Należy również odciąć łączniki przed- i/lub pozazwojowe. Każdy zwój zawiera około 10 000 neuronów. Po wysianiu na podłoże neurony odtworzą swoje neuryty.</li>
</ol>
4. Zakładanie hodowli neuronów współczulnych:
<ol>
<li>Odwiruj zwoje przy 200xg przez 2 minuty i odlej supernatant.</li>
<li>Resuspenduj zwoje w 0,5 do 1 ml 0,25% roztworu trypsyny. Umieść w kąpieli wodnej lub inkubatorze w temperaturze 37˚C na 30 minut. Pomoże to w dysocjacji komórek w zwojach.</li>
<li>Po 30 minutach dodaj 10 ml Pożywki Kompleksowej (Complete Medium), aby rozcieńczyć i zneutralizować trypsynę, a następnie odwiruj przy 200xg przez 2 minuty.</li>
<li>Odlej supernatant i resuspenduj w 2 ml Pożywki Końcowej (Final Medium).</li>
<li>Dalszą dysocjację komórek przeprowadź poprzez tryturację zwojów za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura. Tryturuj zwoje 20 razy, a następnie umieść probówkę na lodzie na kilka minut.</li>
<li>W międzyczasie dodatkowo wypal pipetę, aby zwęzić otwór (do średnicy około 2/3 do 1/2 mm). Odczekaj kilka minut do ostygnięcia i ponownie tryturuj zwoje 20 razy. W miarę kontynuowania procesu pożywka będzie stawać się coraz bardziej mętna, co wskazuje na dysocjację komórek. Powtórz ten krok raz lub dwa razy więcej, w zależności od stopnia dysocjacji komórek. Po pewnym czasie zauważysz, że wszystkie zwoje uległy dysocjacji do neuronów i w probówce nie widać już nienaruszonych zwojów. Może pozostać niewielka ilość materiału tkankowego, który nie uległ dysocjacji. W tym momencie pozostaw probówkę na lodzie na kilka minut, aby niedysocjowane resztki opadły na dno. Następnie ostrożnie zbierz prawie całą pożywkę z góry i przelej do innej probówki. Aby uniknąć zebrania niedysocjowanych resztek, pozostaw około 50 µl na dnie probówki. Do probówki z dysocjowanymi komórkami dodaj więcej Pożywki Końcowej: objętość ta zależy od rodzaju płytki inkubacyjnej używanej do hodowli neuronów. Na przykład: jeśli używany jest wypływek 24-dołkowy, wysiej 0,5 zwoju na dołek (~10 000 neuronów na dołek) w 0,5 ml Pożywki Końcowej na dołek. Typowy miot szczura składa się z 12 młodych, co daje 24 zwoje. Jest to wystarczająca ilość, aby zasiać jedną płytkę 24-dołkową, a całkowita objętość Pożywki Końcowej wynosi 12 ml. Uwaga: zwoje zawierają również niewielką populację glii i innych typów komórek, które będą obecne w hodowli. Zastosowanie Uridyny/5-FDU w Pożywce Końcowej zapobiegnie ich proliferacji i przyspieszy ich obumieranie.</li>
<li>Dokarmiaj komórki co 48 godzin, wymieniając 2/3 pożywki na świeże RPMI + 1% surowicy konskiej + NGF oraz urydynę/5-FDU. Uwaga: Na początku hodowla zawiera neurony współczulne, które wyglądają na okrągłe i nie posiadają neurytów. Krótkie neuryty stają się widoczne 24 godziny po wyizolowaniu i z czasem stają się coraz gęstsze i bardziej rozgałęzione.</li>
</ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
<li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chat+in+the+Trophic+Web%3A+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li>
<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+%28NGF%29+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li>
<li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).</li>
<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Do naszych hodowli wykorzystujemy szczury Sprague Dawley.
Czyszczenie zwojów należy przeprowadzić starannie i z należytą uwagą. Należy usunąć wszystkie zanieczyszczenia, naczynia krwionośne oraz tkankę tłuszczową. Krok ten jest istotny dla uzyskania kultury w miarę jednorodnej i wolnej od obcych typów komórek. Dodatek uridine/5-FDU w znacznym stopniu wyeliminuje wszelkie pozostałe nieneuronalne (mitotyczne) komórki zanieczyszczające kulturę lub przynajmniej zahamuje ich proliferację.
<p cl...

<table><tbody><tr><td>Pęseta stalowa, nr 5</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki DEAVER proste, ostra-tępa krawędź, ostrza 43mm - 5,5</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 z L-glutaminą</td><td>Odczynnik</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Odczynnik</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska od dawcy</td><td>Odczynnik</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>Inaktywować termicznie, inkubując w kąpieli wodnej o temperaturze 56&amp;#x00B0;C przez 30 minut.</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna bez EDTA</td><td>Odczynnik</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo;-deoksyurydyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Odczynnik</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy i źródło światła</td><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe 15 ml</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych</td><td>Narzędzie</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół hodowli neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (scg) szczura

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Zgorzele szyjne górne (SCG) u szczurów to małe, błyszczące, migdałowate struktury zawierające neurony współczulne. Neurony te zapewniają unerwienie współczulne obszarów głowy i szyi oraz stanowią dobrze scharakteryzowaną i stosunkowo jednorodną populację (4). Neurony współczulne są zależne od czynnika wzrostu nerwów (NGF) w zakresie przeżywalności, różnicowania i wzrostu aksonów, a szeroka dostępność NGF ułatwia ich hodowlę oraz manipulacje eksperymentalne (2, 3, 6). Z tych reasons hodowlane neurony współczulne były wykorzystywane w szerokim zakresie badań, w tym nad rozwojem i różnicowaniem neuronów, mechanizmami programowanej i patologicznej śmierci komórek oraz transdukcją sygnału (1, 2, 5 i 6). Wyizolowanie SCG od nowonarodzonych szczurów i hodowla neuronów współczulnych nie są skomplikowane i można w nich szybko osiągnąć biegłość. W niniejszym artykule szczegółowo opiszemy sposób wyizolowania SCG z nowonarodzonych szczurząt oraz ich wykorzystania do tworzenia kultur neuronów współczulnych. W artykule opisane zostaną również kroki przygotowawcze oraz różnorodne odczynniki i sprzęt niezbędne do osiągnięcia tego celu.

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji i hodowli pierwotnych neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) nowo narodzonych szczurów.

Protokół hodowli neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczura

Zwoje szyjne górne (SCG) u szczurów to niewielkie, błyszczące, migdałowate struktury zawierające neurony współczulne. Neurony te zapewniają...

Procedura ta rozpoczyna się od wyizolowania górnych zwojów szyjnych układu współczulnego od noworodkowych szczurów w dniu 0 (P0). Każdy mózg posiada dwa górne zwoje szyjne układu współczulnego. Z jednego miotu szczurząt można pozyskać około 24 zwoje.Dysocjacja zwojów rozpoczyna się od inkubacji i obróbki przez 30 minut. Dalszą dysocjację przeprowadza się poprzez powtarzające się traktowanie wypalaną pipetą Pasteura, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Neurony współczulne są następnie wysiewane na płytki powlekane kolagenem ENC.Witam, nazywam się Nila Zurin i pracuję w laboratorium dr. Lloyda Greena w Katedrze Patologii i Biologii Komórki na Uniwersytecie Columbia w Nowym Jorku. Dzisiaj zaprezentujemy, jak izolować i hodować pierwotne neurony współczulne z zwojów szyjnych górnych nowonarodzonych szczurów. W naszym laboratorium wykorzystujemy te komórki zazwyczaj do badania apoptozy w odpowiedzi na odstawienie czynnika wzrostu nerwów.Zacznijmy zatem. Procedurę rozpoczynamy od pokrycia naczynia hodowlanego kolagenem z ogona szczura na 24 godziny przed przeprowadzeniem sekcji. W zależności od charakteru eksperymentu stosuje się płytkę hodowlaną 24- lub 48-dołkową.Następnie zostaną przygotowane pożywki i sprzęt. Materiały i odczynniki te można znaleźć w tekście protokołu towarzyszącego temu filmowi. Należy pamiętać, że roztwór urydyny i 5-FDU należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.Kontynuuj przygotowanie za pomocą ognia. Wypalaj szklane pipety pasterskie dla etapów miareczkowania. Końcówkę szklanej pipety należy trzymać w płomieniu przez kilka sekund, obracając ją, aby ją zwęzić i wygładzić.Wstępne polerowanie ogniowe należy przeprowadzić w sterylnej komorze do hodowli komórkowych. Aby rozpocząć sekcję, należy pobrać noworodkowe szczury w okresie od P0 do P1. Noworodka szczura szybko przeciera się 70% etanolem w celu ograniczenia kontaminacji.Po przeprowadzeniu dekapitacji głowę umieszcza się na podkładce sekcyjnej stroną brzuszzną do góry, tak aby tylna część była skierowana w stronę badacza. Przecięta tchawica powinna być wyraźnie widoczna. Aby przymocować odciętą głowę do podkładki sekcyjnej, należy użyć sterylnych igieł w następujący sposób.Wbij jedną szpilkę przez podniebienie w podkładkę sekcyjną, a drugą szpilkę przez przerwany rdzeń kręgowy w podkładkę. Po przesunięciu podkładki sekcyjnej pod mikroskop i spojrzeniu przez okulary, użyj dwóch par pęset, aby usunąć skórę i tkankę tłuszczową wokół tchawicy. Zachowując ostrożność, aby nie zagłębić się zbyt mocno, po obu stronach tchawicy odsłonięta zostanie para mięśni przebiegających niemal równolegle do siebie.Podczas sekcji należy przemywać preparat zimnym sterylnym PBS lub zimną pożywką RPMI 1640 bez surowicy, podawaną za pomocą sterylnej pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar krwi. Czynność tę można powtórzyć raz lub wielokrotnie, w zależności od tempa pracy. Następnie za pomocą pincety należy rozciąć i usunąć mięsień z jednej strony.Po usunięciu mięśnia widoczna stanie się tętnica szyjna. Tętnica ta biegnie wzdłuż tchawicy i rozwidla się, tworząc strukturę przypominającą wstęgę w kształcie litery Y. Rozwidlenie to jest ważnym punktem orientacyjnym, a po jego zlokalizowaniu stosunkowo łatwo będzie odnaleźć zwoje szyjne górne.Tętnicę przecina się na najbardziej dystalnym końcu i lekko unosi za pomocą pincety. Drugi koniec tętnicy pozostaje przytwierdzony. Po wykonaniu tej czynności widoczny stanie się zwoj szyjny górny.Należy upewnić się, że jest to mała, błyszcząca masa tkanki o migdałowatym kształcie, luźno przytwierdzona do tętnicy w punkcie jej rozwidlenia, posiadająca nitkowate połączenia przed- i/lub pozaganglionalne. Za pomocą drugiej pary pęsety należy delikatnie oddzielić zwoi szyjny górny i umieścić go w małej 35 milimetrowej szalce hodowlanej zawierającej zimne podłoże RPMI 1640 bez surowicy. Następnie, zgodnie z tym samym protokołem, należy wyekstrahować zwoi po drugiej stronie tchawicy.Po wypreparowaniu wszystkich zwojów, należy w jak największym stopniu oczyścić je z tkanek obcych. Patrząc przez okular mikroskopu, można zauważyć, że do zwojów przytwierdzone są fragmenty tłuszczu z tętnicy szyjnej lub inne tkanki; do usunięcia tych niepożądanych materiałów należy użyć pęsety. Należy również odciąć połączenia przed- i/lub pozazwojowe.Każdy zwoj ma około 10 000 neuronów. Po wysianiu neuronów, ich wypustki ulegną regeneracji. Następnie zwoje umieszcza się w sterylnym, 15-mililitrowym stożkowym probówce z polipropylenu zawierającej pożywkę RPMI 1640.Następnie tworzy się kulturę neuronów współczulnych. Zwoje poddaje się wirowaniu przy 200 G przez dwie minuty, a następnie usuwa się znad. Zwoje resuspenduje się w 0,5 do 1 ml 0,25% roztworu trypsyny, po czym umieszcza w kąpieli wodnej lub inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut, aby wspomóc dysocjację komórek w zwojach.Po 30 minutach dodaje się 10 mililitrów pożywki kompletnej w celu rozcieńczenia i neutralizacji trypsyny. Następnie roztwory wiruje się przy 200 G przez dwie minuty. Następnie odrzuca się supernatant, a zwoje resuspendsuje w dwóch mililitrach pożywki końcowej.Używając jednej z wcześniej przygotowanych, wypalanych nad ogniem końcówek pipety o szerokim otworze, komórki są dalej dysocjowane poprzez 20-krotne zasysanie i wypuszczanie zwojów. Następnie probówkę umieszcza się w lodzie na kilka minut. W kolejnym kroku końcówkę pipety ponownie wypala się nad ogniem, aby jeszcze bardziej zwęzić jej otwór.Po ostygnięciu pipety zwoje są rozcierane (tryturacja) jeszcze 20 razy. Pożywka będzie stawać się stopniowo bardziej mętna, co wskazuje na dysocjację komórek. Krok ten powtarza się raz lub dwa razy więcej, w zależności od stopnia dysocjacji komórek.Po pewnym czasie zwoje ulegną dysocjacji do formy pojedynczych neuronów i w probówce nie będą już widoczne nienaruszone zwoje. Na tym etapie może pozostać niewielka ilość materiału tkankowego, który nie uległ dysocjacji. Probówkę pozostawia się na lodzie przez kilka minut, aby wszelkie niezdysocjowane resztki mogły osiąść na dnie.Ostrożnie zbiera się cały supernatant, z wyjątkiem około 50 µL, i przenosi go do innej probówki. Na dnie probówki pozostawia się 50 µL, aby zapobiec przeniesieniu niepowiązanych zanieczyszczeń. Do probówki zawierającej zdysocjowane komórki dodaje się więcej końcowego medium.Objętość dodawanego pożywki końcowej zależy od rodzaju płytki hodowlanej używanej do hodowli neuronów. Na przykład, w przypadku zastosowania płytki 24-dołkowej, należy umieścić jedno zwojenie na dołek w 0,5 milliliters pożywki końcowej na dołek.Typowy miot szczura składa się z 12 młodych, co pozwala na uzyskanie 24 zwojów. Jest to ilość wystarczająca do wysiania jednej płytki 24-dołkowej, a całkowita objętość końcowego medium wynosi 12 mililitrów. Zastosowanie urydyny 5'-FDU w końcowym medium zapobiegnie proliferacji i przyspieszy obumieranie niewielkiej populacji gleju oraz innych typów komórek.W trakcie hodowli komórki są karmione co 48 godzin poprzez wymianę dwóch trzecich pożywki. Stosuje się świeże RPMI z dodatkiem 1% surowicy koni, NGF, urydyny oraz pięciu FDU. Początkowo hodowla zawiera neurony sympatyczne, które wyglądają na okrągłe, bez obecności neuronów.Krótkie neurony stają się widoczne 24 godziny po dysekcji, a z czasem stają się coraz gęstsze i bardziej rozgałęzione. Przedstawiliśmy właśnie sposób izolacji i hodowli pierwotnych neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych nowonarodzonych szczurów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby po pierwsze, poświęcić czas i staranność przy oczyszczaniu zwojów, usuwając wszystkie zanieczyszczenia, naczynia krwionośne oraz tkankę tłuszczową.Ten krok jest istotny dla zapewnienia kultury, która jest w miarę jednorodna i wolna od obcych typów komórek. Po drugie, podczas etapu dysocjacji należy zachować cierpliwość i poświęcić czas na rozdzielenie neuronów, aby nie tworzyły dużych skupisk. Po ich naniesieniu na płytki, duże skupiska będą utrudniać dalsze prace.W zastosowaniach końcowych, takich jak przecinanie lub zakażanie neuronów, barwienie immunologiczne może być również utrudnione, a wszelkie eksperymenty wymagające liczenia neuronów będą trudne do przeprowadzenia. Na koniec, nie ma potrzeby uzupełniania medium o penicylinę i streptomycynę przy każdym karmieniu kultur; wystarczy jednorazowe dodanie tych antybiotyków podczas pierwszego wysiewu komórek.Należy dodawać świeży uridine five FDU do pożywki przy każdej wymianie medium. W naszym laboratorium wykorzystano kulturę neuronów współczulnych do badania apoptozy w odpowiedzi na odstawienie czynnika wzrostu nerwów. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

protocol-for-culturing-sympathetic-neurons-from-rat-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół hodowli neuronów współczulnych z górnych splotów szyjnych szczurów (SCG)

Opisujemy protokół wykorzystania białka morfogenetycznego kości-7 (BMP-7) lub Matrigelu do selektywnego indukowania wzrostu dendrytów w pierwotnych neuronach współczulnych rozdzielonych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczurów perinatalnych.

Indukowanie wzrostu dendrytów w hodowlanych neuronach współczulnych

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Ten film demonstruje procedurę izolowania neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od zarodków szczurów i współhodowli ich z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia dojrzałych komórek Schwanna. Wyizolowane DRG są przetwarzane w celu wyizolowania neuronów i komórek glejowych. Wyizolowane komórki są hodowane w celu oczyszczenia neuronów, które są następnie hodowane wspólnie z komórkami podobnymi do komórek Schwanna (SCLC) w pożywce do wspólnej hodowli. Interakcja z neuronami DRG...

Izolacja neuronów DRG i kokultura z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia komórek Schwanna

Ten film przedstawia izolację i hodowlę komórek Schwanna z korzeni rdzeniowych myszy. Wyizolowane komórki są następnie hodowane w określonych pożywkach. Komórki Schwanna są izolowane poprzez zróżnicowane trawienie i przyleganie. Następnie są przenoszone do szkiełek nakrywkowych pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową w celu przyczepienia i proliferacji.

Izolacja komórek Schwanna z korzeni rdzeniowych myszy

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego (DRG) z kręgosłupa szczura. DRG wycięte z kręgosłupa są traktowane enzymami i mechanicznie dysocjowane w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Komórki są hodowane w pożywce zawierającej inhibitory i czynniki wzrostu, które odpowiednio ograniczają proliferację komórek glejowych i promują wzrost neuronów.

Ustanowienie pierwotnej hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego z kręgosłupa szczura

Tutaj opisujemy test migracji komórek Schwanna (SC), w którym SC są w stanie rozwijać się wzdłuż rozszerzających się aksonów.

Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.

Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Hodowle pierwotne zwojów korzenia grzbietowego (DRG) są często używane do badania funkcji fizjologicznych lub zdarzeń związanych z patologią w neuronach czuciowych. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie lędźwiowych hodowli DRG do wykrywania uwalniania neuroprzekaźników po stymulacji neuropeptydowego receptora FF typu 2 selektywnym agonistą.

Izolacja zwojów korzenia grzbietowego i hodowla pierwotna w celu zbadania uwalniania neuroprzekaźników

Ten artykuł opisuje izolację i hodowlę embrionalnych neuronów współczulnych szczurów z górnych zwojów szyjnych. Zawiera również szczegółowe protokoły barwienia immunocytochemicznego i przygotowywania ekstraktów neuronalnych do analizy spektrometrii mas.

Hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej

Zwoje rzęskowe piskląt (CG) są częścią przywspółczulnego układu nerwowego. Wykazano, że hodowle neuronów CG piskląt są skutecznymi modelami komórkowymi w badaniu interakcji między mięśniami nerwowymi. Opisujemy szczegółowy protokół sekcji, dysocjacji i hodowli in vitro neuronów CG z zarodków piskląt.

Izolacja i hodowla neuronów zwojowych rzęsek piskląt

Obecny protokół opisuje mysi model ablacji unerwienia adrenergicznego poprzez identyfikację i resekcję górnego zwoju szyjnego.

Technika chirurgiczna dla górnej ganglionektomii szyjki macicy w modelu mysim

Poznaj izolację i hodowlę pierwotnych neuronów współczulnych z górnych zwojów szyjnych szczura. Ta metoda umożliwia badanie właściwości komórkowych i apoptozy in vitro.

Protokół hodowli neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczura

Przeglądaj więcej filmów