Izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

Procedura rozpoczyna się od wyjęcia móżdżku z myszy w wieku od P4 do P5. Z poszczególnych móżdżków noworodków myszy usuwa się opony mózgowe oraz splot naczyniowy, a następnie zbiera je do konicznej probówki o pojemności 15 ml. Móżdżki są dysocjowane za pomocą papainy, a poprzez delikatne triturację uzyskuje się zawiesinę pojedynczych komórek.

Zawiesinę tę filtruje się grawitacyjnie przez nylonową siatkę o rozmiarze porów 70 micron. Przesącz delikatnie nakłada się na nieciągły gradient Percoll i wiruje, aby oddzielić komórki ziarniste od gleju oraz neurony i neurony genu Perkin. Komórki znajdujące się na granicy faz gradientu są zbierane i wysiewane na płytki powlekane polilizyną.

Aby dodatkowo usunąć komórki glejne, komórki ziarniste są zbierane, przeliczane i wysiewane z pożądaną gęstością na szklane szkiełka nakrywkowe lub plastikowe płytki hodowlane powlekane poli-D-lizyną. Cześć, nazywam się Hey Young Lee i pracuję w laboratorium dr. Lloyda Greena w Departamencie Patologii na Uniwersytecie Columbia. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i hodowli neuronów ziarnistych móżdżku z myszy postnatalnych.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania proliferacji i różnicowania neuroprogenitorów ziarnistych. Zatem zacznijmy. Procedura rozpoczyna się od użycia 70% ethanol w obszarze sekcji; do dysocjacji komórek ziarnistych móżdżku wykorzystujemy system dysocjacji Papina.

Przy rozpoczynaniu pracy z nowym zestawem należy przygotować inhibitor albuminy OVO equate MOID. W tym celu należy odmierzyć 32 mililitrów zrównoważonego roztworu soli Earla lub EBSS, dostarczonego w zestawie, i dodać go do mieszaniny albuminy OVO moid. Odstawić roztwór podczas przygotowywania pozostałych komponentów, aby zawartość mogła się rozpuścić.

Następnie należy dodać 5 mL EBSS do jednej fiolki z papainą z zestawu do dysocjacji. Każda fiolka wystarcza do dysocjacji od 4 do 15 móżdżków od myszy P5. Następnie fiolkę z papainą należy umieścić w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C na od 5 do 10 minut, aż papaina całkowicie się rozpuści, a roztwór stanie się klarowny.

Przechowuj roztwór w temperaturze pokojowej podczas sekcji. Następnie dodaj 500 µL EBSS do fiolki 1D NAS z zestawu. Delikatnie wymieszaj, stukając fiolką.

Ponieważ DNAS jest wrażliwe na denaturację mechaniczną, należy dodać 250 µL tego roztworu do fiolki z pepane, aby uzyskać końcowe stężenie 20 jednostek/ml i 0,005% DNA; pozostałą część DNA należy zachować do późniejszych etapów. Po przygotowaniu narzędzi i odczynników należy przystąpić do wycięcia móżdżków i usunięcia opon mózgowo-rdzeniowych w ramach tej procedury. Do badań wykorzystuje się myszy C 57 black six w czwartym do szóstego dnia po urodzeniu.

Ten przedział wiekowy jest optymalny dla hodowli komórek ziarnistych, ponieważ liczba progenitorów komórek ziarnistych warstwy ziarnistej zewnętrznej (EGL) osiąga maksimum. Należy odmierzyć pipetą 15 ml HBSS z glukozą do plastikowej szalki hodowlanej o średnicy 60 mm oraz 10 ml do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Probówkę należy umieścić w lodzie, a głowę szczenięcia przemyć 70% etanolem. Do usunięcia głowy należy użyć nożyczek chirurgicznych.

Przenieś głowę pod wyciąg i przytrzymaj ją pęsetą tak, aby tył czaszki był wyraźnie widoczny. Wprowadź nożyczki mikrosekcyjne do otworu wielkiego, aby uzyskać dostęp do mózgu, a następnie wykonaj cięcie prosto w stronę oczu. Użyj precyzyjnej pęsety Dumont.

Numer pięć, pęseta do odwarstwienia skóry i uniesienia czaszki w celu odsłonięcia mózgu. Następnie odciśnij móżdżek oraz otaczający go śródmózgowie. Przenieś go do naczynia zawierającego HBSS z glukozą.

Należy pamiętać, że manipulacja móżdżkiem oraz usuwanie opon mózgowych są łatwiejsze, jeśli móżdżek pozostaje przytwierdzony do otaczających go tkanek. Następnie umieść tkankę pod mikroskopem stereoskopowym. Potem użyj jednej pary pincety, aby przymocować móżdżek do płytki.

Użyj precyzyjnej pęsety Dumont nr 5, aby delikatnie oddzielić oponami mózgowe od móżdżku oraz z obszarów pomiędzy jego półkulami. Na powierzchni móżdżku widoczne będą naczynia krwionośne.

Naczynia krwionośne te stanowią dobry punkt orientacyjny przy identyfikacji opon mózgowych. Należy kontynuować usuwanie opon, aż móżdżek nabierze zmatowiałego, białego wyglądu. Następnie należy oddzielić móżdżek od pozostałej części śródmózgowia.

Odwróć go stroną brzuszną i usuń splot naczyniówkowy, który wygląda jak czerwonawa wstążka pomiędzy brzuszną częścią móżdżku a przylegającym do niego śródmózgiem. Natychmiast po wypreparowaniu móżdżku umieść go w zimnym roztworze HBSS z glukozą w 15 mililitrowej probówce stożkowej na lodzie. Po wypreparowaniu trzech mózgów wymień roztwór do dysekcji na świeży HBSS z glukozą.

W miarę nabywania wprawy w dyssekcji móżdżku, należy dążyć do skrócenia czasu zabiegu do maksymalnie sześciu minut na jednego szczeniaka. Po zakończeniu dyssekcji należy przystąpić do przygotowania zawiesiny komórkowej. Krok: Przygotowanie zawiesiny komórkowej z wypreparowanych fragmentów móżdżku.

Najpierw usunięto z probówki HBSS z glukozą i zastąpiono go roztworem papainy. Chociaż zestaw zaleca pocięcie tkanki na małe kawałki, w przypadku tego wieku uznaliśmy, że nie jest to konieczne. Umieszczono tkankę i roztwór papainy w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 stopni na 15 do 20 minut.

W przypadku od czterech do ośmiu móżdżków inkubować przez 15 minut. Dla większej liczby próbek inkubować do pół godziny. Delikatnie mieszać zawartość probówki co trzy do czterech minut.

Po zakończeniu inkubacji rozpocznij etap powlekania: pokryj sterylną końcówkę pipety aerosolowej P 1000 FBS, pipetując ciecz w górę i w dół dwukrotnie. Następnie nanieś mieszaninę. Należy pipetować delikatnie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.

Około 10 ruchów pipetą w górę i w dół jest wystarczających do rozdziału tkanki. Roztwór powinien stać się mętny. Pozostaw zawiesinę na 30 do 60 sekund, aby wszelkie duże fragmenty nierozdzielonej tkanki opadły na dno probówki.

Chociaż do titracji można używać pipet szklanych wypalanych ogniowo, stwierdziliśmy, że sterylne końcówki P 1000 powlekane surowicą sprawdzają się równie dobrze. Następnie, używając końcówki pipety powlekanej surowicą, przenieś zawiesinę komórek do nowej probówki stożkowej 15 ml, uważając, aby nie usunąć niepowiązanych fragmentów tkanki z dna. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową przy około 200 G przez pięć minut.

W temperaturze pokojowej, podczas wirowania, przygotować medium do resuspensji. W tym celu do sterylnej probówki dodać 2,7 ml EBSS. Następnie dodać 300 µl zrekonstytuowanego roztworu inhibitora albuminy OVO MOID.

Na koniec należy dodać 150 µL roztworu DNA. Po zakończeniu wirowania odrzuć nadsącz i natychmiast resuspenduj osad komórkowy w rozcieńczonym roztworze inhibitora albuminy z DNA. Do resuspensji osadu ponownie użyj końcówki do pipety powlekanej surowicą.

Następnie należy przygotować nieciągły gradient gęstości. W tym celu do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml należy dodać pięć mililitrów roztworu albuminy oval MOID inhibitor. Zawiesinę komórkową należy nanieść na powierzchnię roztworu, ostrożnie dodając komórki wzdłuż ścianki probówki, a następnie wirować z przyspieszeniem około 70 G przez sześć minut.

W temperaturze pokojowej dysocjowane komórki opadną na dno probówki, podczas gdy fragmenty błony pozostaną na granicy faz. Jeśli chcą Państwo uzyskać kultury wzbogacone w komórki ziarniste, dalsze oczyszczanie nie jest konieczne. Odlej nadpływ i natychmiast resuspenduj osad w czterech mililitrach medium z 10% FBS oraz 50 microliters DNAs.

Przefiltrować tę zawiesinę grawitacyjnie przez nylonową siatkę o rozmiarze oczek 70 mikronów. Krok ten usuwa duże komórki nieneuronalne i pozwala na uzyskanie lepszej zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie pominąć poniższy krok separacji w gradiencie Percoll i przejść do etapu wysiewania komórek.

Jeśli natomiast chcą Państwo dodatkowo oczyścić komórki ziarniste z gleju i dużych neuronów interneuronów, należy przejść do etapu gradientu Percoll. Odrzucić nadsącz i niezwłocznie resuspendować osad w dwóch mililitrach HBSS z glukozą z dodatkiem 50 µL DNase.

Ponownie przefiltruj zawiesinę przez nylonową siatkę. Przed rozpoczęciem separacji w gradiencie Percoll przygotuj dwie wypalane pipety Pasteura. Delikatnie opal końcówkę pipety płomieniem, aż krawędź stanie się gładka, a światło pipety zmniejszy się do około połowy pierwotnego rozmiaru. Należy uważać, aby nie zrobić otworu zbyt małego.

Teraz należy przygotować gradient per cell. Do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml wlać 10 ml 35% roztworu per cell. Następnie do sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml z dołączoną sterylną igłą spinalną nabrać 10 ml 60% roztworu per cell.

Ostrożnie nałóż roztwór 60% pod roztwór 35%, przykładając końcówkę strzykawki do dna probówki. Należy zadbać o zachowanie wyraźnej granicy między obiema warstwami. Następnie dodaj komórki na górę gradientu.

Używając pipety z polerowanymi ogniowo końcami, powoli dodaj komórki wzdłuż ścianki probówki, nie zakłócając warstwy granicznej. Po naniesieniu komórki ostrożnie umieść probówkę w wirówce. Rozpocznij wirowanie przy prędkości około 18 G. Zwiększaj prędkość stopniowo co 20 sekund, tak aby osiągnięcie 1800 G zajęło około dwóch minut. Po 10 minutach wirowania przy 1800 G, stopniowo zmniejszaj prędkość o jeden stopień co 20 sekund.

Po zakończeniu wirowania usuń górny interfejs gradientu i go wylutuj. Interfejs ten zawiera duże komórki ggl bikini oraz interneurony. Następnie, używając wypalanej pipety, ostrożnie usuń komórki znajdujące się na interfejsie.

Przenieś komórki do probówki 50 ml. Jeśli objętość przekroczy 15 ml, rozdziel je do dwóch probówek 50 ml i resuspenduj w trzech objętościach glukozy HB S'S, mieszając poprzez kilkukrotne odwrócenie probówek. Następnie wiruj przez pięć minut przy 1100 G. Teraz usuń nadsącz i dodaj cztery ml pożywki zawierającej 10% FBS oraz 50 µL D ns reus.

Gently resuspend pellet za pomocą wypalanej pipety, aby utworzyć zawiesinę pojedynczych komórek. Po resuspensji komórek przystąp do etapu prepl. Komórki osadzają zebrane komórki na płytce powlekanej poli-L-lizyną przez 20 minut.

W inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2. Podczas inkubacji astroglej oraz cięższe komórki opadną i przywrą do naczyń, podczas gdy małe neurony ziarniste i komórki progenitorowe neuronów pozostaną w zawieszeniu lub będą słabo przylegające. Po 20 minutach delikatnie ostukaj naczynie, aby odczepić słabo przylegające komórki ziarniste.

Następnie przenieś zawiesinę komórkową na nową płytkę powlekaną polilizyną i powtórz inkubację. Następnie zbierz neurony ziarniste oraz komórki progenitorowe neuronów do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wiruj przy 200 G przez pięć minut. Po tym czasie resuspenduj osad w 1 ml pożywki wolnej od C i dokonaj zliczenia za pomocą komory licznikowej.

Na koniec należy dodać pożywkę bezsurowiczą, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek do wysiewu przy średnim zagęszczeniu. W przypadku płytek 6-dołkowych należy użyć około 3,5 do 4 milionów komórek na płytki 4-dołkowe.

Użyć 650 000 komórek. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2. Całkowicie wymienić medium 24 godziny po początkowym wysiewaniu, a następnie co dwa do trzech dni.

Poniżej przedstawiono obrazy zdrowych kultur neuronów ziarnistych oraz komórek progenitorowych. 24 godziny po wysiewaniu oraz sześć dni po wysiewaniu. Komórki te można utrzymywać w kulturze do dwóch tygodni.

Należy zauważyć, że w ciągu 24 godzin od wysiania zdrowe komórki rozprzestrzenią się równomiernie wokół szkiełek nakrywkowych lub plastikowej studni i zaczną emitować wypustki. Agregacja komórek oraz obecność zgrubień na wypustkach komórkowych wskazują, że komórki są w złym stanie lub że podłoże z poli-L-lizyny jest toksyczne. Jak pokazano na schemacie, progenitorowe neurony ziarniste zaczynają różnicować się po wysianiu i wykazują ekspresję markerów.

Reprezentatywny obraz ich różnicowania. Proliferacja progenitorów neuronów ziarnistych może zostać znacznie przedłużona poprzez dodanie sonic hedgehog do pożywki. Jako podłoże, oprócz polilizyny, można dodać lamininę, aby wspomóc wzrost neurytów.

Cechy hodowli komórek ziarnistych stanowią system do badania biologii neuronów ziarnistych lub regulacji różnicowania się komórek progenitorowych w neurony. Przedstawiliśmy sposób izolacji i hodowli progenitorów oraz neuronów ziarnistych móżdżka myszy (MAO). Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że przybliżona wydajność wynosi 4-25 × 10⁶.

Liczba komórek z jednego szczenięcia oraz gęstość wysiewu mogą mieścić się w zakresie od pięciu do pięciu razy większej liczby komórek na centymetr kwadratowy. Zatem, jeśli pominiemy etap gradientu Percoll, osiem szczeniąt myszy z piątego dnia postnatalnego może dostarczyć wystarczającej liczby komórek do sześciu płytek hodowlanych z 4 studniami. W moim doświadczeniu zastosowanie etapu gradientu Percoll zmniejsza wydajność komórek o około 22-35%. Jednakże odsetek neuronów ziarnistych w hodowlach wzrasta z 90-95% do 99%. Wzbogacone komórki ziarniste otrzymane bez etapu separacji gradientem Percoll były wykorzystywane do badania regulacji proliferacji i różnicowania progenitorów neuronów ziarnistych. Jeśli jednak hodowle mają być wykorzystywane przez więcej niż kilka dni in vitro, zaleca się włączenie etapu gradientu Percoll w celu zmniejszenia zanieczyszczenia neuronów ziarnistych przez proliferujące komórki nieneuronalne.

Należy również upewnić się, że roztwory użyte do przygotowania gradientu perchlorowego są świeże, ponieważ niewłaściwe buforowanie prowadzi do zwiększonej śmiertelności komórek. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.