Name: Izolacja i hodowla komórek progenitorowych i neuronów progenitorowych neuronów ziarnistych móżdżku myszy po urodzeniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych oraz neuronów ziarnistych móżdżku myszy po urodzeniu. Technika ta umożliwia badanie rozwoju neuronów i ich funkcji w warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Barbarze Carletti i Annie Marie Kenney za nieocenione sugestie. HYL jest wspierany przez grant szkoleniowy „Hormones: Biochemistry and Molecular Biology”, DK07328. Wsparcie częściowo zapewnił grant NIH 5R01 NS16951 (CAM).

Część 1: Przygotowanie (1–2 dni przed sekcją) (Nie pokazano w filmie)
<ol>
<li>PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW I PODŁOŻY DO KULTURY:
<ul>
<li>4X CMF-PBS-EDTA (fosforanowy bufor solny bez wapnia i magnezu z dodatkiem EDTA do rozcieńczeń Percoll): na litr dodać 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g glukozy, 2 g NaH2PO4, 1 g KH2PO4, 8 ml 2% roztworu zapasowego NaHCO3, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) do wody destylowanej/dejonizowanej. Doprowadzić objętość do 1 litra i dostosować pH do 7,4. Sterylizować przez filtrowanie.</li>
<li>HBSS-GLUKOZA: Dodać glukozę (6 g/litr) do zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) bez wapnia i magnezu i przefiltrować przez filtr sterylny. 500 ml można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie miesiąc.</li>
<li>PODŁOŻA DO KULTURY: podłoże bezsurowicze (SFM) oraz podłoże z 10% FBS. Do 48 ml podłoża Neurobasal A dodać 500 μl 100X GlutaMAX I, 500 μl 100X penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe: 100 jednostek penicyliny i 100 μg streptomycyny), 6,25 μl 2 M KCl (stężenie końcowe 250 μM). Podzielić na dwie alikwoty o objętości 9 ml i 40 ml. Aby przygotować podłoże z 10% FBS, dodać 1 ml inaktywowanej ciepłem FBS do alikwoty 9 ml. Aby przygotować SFM, dodać 800 μl bezsurowiczego suplementu B-27 do alikwoty 40 ml. Sterylizować przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie. Dla uzyskania najlepszych wyników należy przygotowywać świeże podłoża do każdego eksperymentu.</li>
</ul>
</li>
<li>PRZYGOTOWANIE ROZCIEŃ PERCOLL:
<ul>
<li>Percoll jest dostarczany w formie ciekłej i przed użyciem musi zostać zakwaszony. Aby przygotować roztwór zapasowy, dodawać 1N HCl małymi porcjami do roztworu Percoll w ciągu 1-2 godzin, aż do osiągnięcia pH 7,4. Zbyt szybkie dodawanie HCl spowoduje agregację Percoll. Na każdy litr Percoll potrzeba około 6,5 ml 1N HCl. Sterylizować przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
<li>W kroku tworzenia gradientu Percoll zostaną użyte rozcieńczenia 35% i 60% (vol:vol). Przygotować 100 ml rozcieńczeń Percoll zawierających odpowiednio 35 lub 60 ml roztworu zapasowego Percoll, 25 ml 4X CMF-PBS-EDTA i wodę destylowaną/dejonizowaną H2O do uzyskania końcowej objętości. Do roztworu 60% dodać kilka kropli błękitu toluidyny; ułatwi to wizualizację granicy faz oraz komórek. Sterylizować przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
<li>4X CMF-PBS-EDTA nie może być starszy niż 3 miesiące, ponieważ niewłaściwe buforowanie spowoduje zwiększoną śmiertelność komórek podczas procedury.</li>
</ul>
</li>
<li>PRZYGOTOWANIE PRZYKRYWEK: Szklane przykrywki (najlepiej z Carolina Biological Supply Company) myje się w 10% HCl przez noc w temperaturze pokojowej przy łagodnym wytrząsaniu, płucze dokładnie wodą destylowaną/dejonizowaną i przechowuje w 70% etanolu. Przed użyciem pojedyncze przykrywki sterylizuje się płomieniem, trzymając je przez chwilę pęsetą nad otwartym ogniem (palnik Bunsena), aż etanol wyparuje. Przykrywki szklane o średnicy 12 mm można umieścić w 4-dołkowych płytkach hodowlanych, a przykrywki 25 mm w 6-dołkowych płytkach hodowlanych.</li>
<li>POKRYWANIE NACZYNI HODOWLANYCH SUBSTRATEM: W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego lub traktowania lekami bardziej odpowiednie są szklane przykrywki, ponieważ można je łatwo zamocować na szkiełkach przedmiotowych w celu wizualizacji pod mikroskopem. Gdy do pobrania próbek białek lub RNA potrzebna jest duża liczba komórek, komórki można hodować na plastikowych szalkach hodowlanych. W noc poprzedzającą sekcję, szklane przykrywki lub plastikowe szalki hodowlane muszą zostać pokryte poli-D-lizyną (500 μg/ml; 800 μl/dołek dla płytek 6-dołkowych lub 350 μl/dołek dla płytek 4-dołkowych). Roztwór zapasowy poli-D-lizyny o stężeniu 5 mg/ml przechowuje się w temperaturze -20°C, a następnie rozcieńcza w sterylnej wodzie destylowanej/dejonizowanej i filtruje sterylnie bezpośrednio przed użyciem. Naczynia hodowlane inkubuje się w temperaturze 37°C przez noc (lub co najmniej przez 2 godziny przed wysiewaniem) i płucze dwukrotnie sterylną wodą destylowaną/dejonizowaną bezpośrednio przed wysiewaniem.</li>
<li>PRZYGOTOWANIE SZALEK DO WYSIEWANIA WSTĘPNEGO: Szalki te będą służyć do wstępnego wysiewania wyizolowanych komórek móżdżku przed właściwą kulturą w celu usunięcia zanieczyszczeń glejowych, które łatwiej przylegają do niższego stężenia substratu. Pokryć dwie plastikowe szalki hodowlane o średnicy 60 mm poli-D-lizyną (4 ml na szalkę, 100 μg/ml; uwaga: jest to 1/5 stężenia używanego do hodowli). Inkubować w temperaturze 37°C przez noc (lub co najmniej przez 2 godziny przed sekcją). Bezpośrednio przed sekcją usunąć roztwór poli-D-lizyny, dwukrotnie opłukać szalki sterylną wodą i pozostawić do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
<li>Sterylizować narzędzia do sekcji w autoklawie lub w dniu sekcji zanurzyć narzędzia w 70% etanolu na 20 minut. Wymagane narzędzia: nożyczki Permaset, nożyczki do mikrosekcji, cztery pęsety sekcyjne Dumont #5.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie do sekcji (dzień sekcji) – (Zaprezentowane w filmie)
Wszystkie poniższe procedury są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
<li>Przetrzyj obszar sekcji 70% etanolem. Podgrzej podłoża do 37°C w łaźni wodnej lub w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C.</li>
<li>Przy rozpoczęciu pracy z nowym zestawem Papain Dissociation System Kit (Worthington) przygotuj roztwór inhibitora albuminowo-owomukoidowego. Do mieszaniny inhibitora albuminowo-owomukoidowego dodaj 32 ml EBSS (Earle’s Balanced Salt Solution; dostarczony w zestawie) i pozostaw do rozpuszczenia podczas przygotowywania pozostałych komponentów. Rekonstytuuj roztwór przy pierwszym użyciu, a następnie przechowuj pozostałą część w temperaturze 2-8°C i stosuj do momentu przeprowadzenia pięciu izolacji przewidzianych w każdym zestawie.</li>
<li>Do jednej fiolki z papainą z zestawu do dysocjacji dodaj 5 ml EBSS (jedna fiolka wystarcza do dysocjacji od 4 do 15 móżdżków myszy w 5. dobie po urodzeniu). Umieść fiolkę z papainą w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C lub w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 5 do 10 minut, aż papaina całkowicie się rozpuści, a roztwór stanie się klarowny. Podczas sekcji przechowuj roztwór w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Do jednej fiolki z DNazą z zestawu do dysocjacji dodaj 500 μl EBSS. Wymieszaj delikatnie, stukając w fiolkę, ponieważ DNaza jest wrażliwa na denaturację spowodowaną siłami ścinającymi. Dodaj 250 μl tego roztworu do fiolki zawierającej papainę (stężenie końcowe to 20 jednostek/ml papainy i 0,005% DNazy). Pozostałą część DNazy zachowaj do etapu 5.1 lub 6.1.</li>
</ol>
Część 3: Disekcja i usuwanie opon mózgowych
<ol>
<li>Optymalny wiek do hodowli komórek ziarnistych z myszy C57BL/6J to 4-6 dzień po urodzeniu, kiedy liczba progenitorów komórek ziarnistych w EGL osiąga szczyt1,10. Przeprowadzaj sekcję szczeniąt pojedynczo; w miarę nabywania wprawy w sekcji móżdżku staraj się skrócić czas zabiegu do nie więcej niż 6 minut na szczenię. Szybkość działania jest kluczowa. 
Jeśli pominięto etap gradientu Percoll, osiem 5-dniowych myszy może dostarczyć wystarczającą liczbę komórek dla jednej płytki hodowlanej z 6 dołkami (lub sześciu szkiełek podstawkowych o średnicy 25 mm) lub dla sześciu płytek hodowlanych z 4 dołkami (lub dwudziestu czterech szkiełek podstawkowych o średnicy 12 mm). Przybliżona wydajność wynosi 4 do 5x106 komórek na szczenię, a gęstość wysiewu może wynosić od 1 do 5X105 komórek/cm2. Ponieważ podczas etapu z Percollem tracone jest 15-20% komórek4, do uzyskania tej samej pożądanej gęstości komórek potrzeba więcej zwierząt.</li>
<li>Pipetuj 15 ml HBSS-glukozy do plastikowej płytki hodowli tkanek o średnicy 60 mm oraz 10 ml do sterylnej stożkowej plastikowej probówki Falcon 15 ml. Umieść na lodzie.</li>
<li>Poza dygestorium przemyj głowę szczenięcia 70% etanolem. Użyj nożyczek Permaset do dekapitacji szczenięcia. (Dekapitacja nie zostanie pokazana w filmie).</li>
<li>W dygestorium przytrzymaj głowę pęsetą Dumont tak, abyś mógł wyraźnie widzieć tył czaszki. Uzyskaj dostęp do mózgu, wkładając nożyczki mikrochirurgiczne do otworu wielkiego (foramen magnum) i tnąc prosto w kierunku oczu. Za pomocą pęsety zdejmij skórę i unieś czaszkę, aby odsłonić mózg. Używając pęsety Dumont, odetnij móżdżek wraz z otaczającym go śródmózgiem i przenieś go do płytki z HBSS-glukozą. (Łatwiej jest manipulować móżdżkiem i usuwać opony, jeśli móżdżek jest nadal przytwierdzony do otaczającej tkanki).</li>
<li>Pod mikroskopem sekcyjnym delikatnie oddziel opony od móżdżku, a także pomiędzy jego półkulami, używając jednej precyzyjnej pęsety Dumont #5, podczas gdy drugą pęsetą unieruchom móżdżek na płytce. Na powierzchni móżdżku zauważysz naczynia krwionośne; stanowią one dobry sposób na zidentyfikowanie opon. Usuwaj opony, aż móżdżek przyjmie matową, białą barwę. Oddziel móżdżek od reszty śródmózgowia. Odwróć go stroną brzuszzną i usuń splot naczyniowy, który wygląda jak czerwona wstążka między brzuszną częścią móżdżku a przyległym śródmózgowiem. Każdy wypreparowany móżdżek umieszczaj natychmiast w zimnym HBSS-glukozie w probówce stożkowej 15 ml na lodzie. Wymień roztwór sekcyjny na świeży HBSS-glukozę po wypreparowaniu 3 mózgów.</li>
</ol>
Część 4: Zawiesina komórkowa
<ol>
<li>Po zakończeniu wszystkich sekcji usunąć HBSS-glucose z probówki i zastąpić go roztworem papainy przygotowanym w kroku 2.4. Choć zestaw zaleca cięcie tkanki na małe kawałki, stwierdziliśmy, że w tym wieku cięcie lub rozdrabnianie móżdżków nie jest konieczne. Umieścić tkankę z roztworem papainy (w stożkowej probówce 15 ml) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C lub w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C na 15 do 20 minut. W przypadku 4 do 8 móżdżków wystarczy 15 minut w 37°C; dla większej liczby móżdżków lepsze będzie 20 do 30 minut. Delikatnie mieszać zawartość probówki co 3 do 4 minut.</li>
<li>Zhomogenizować mieszaninę za pomocą sterylnego końcówki do pipety p1000 z filtrem, pokrytej FBS. Ten krok należy wykonywać delikatnie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Można użyć wypalanych pipet szklanych, jednak stwierdziliśmy, że sterylne końcówki p1000 z filtrem pokryte surowicą działają równie dobrze. Aby pokryć końcówkę pipety FBS, należy dwa razy pobrać i wypuścić FBS tuż przed użyciem. Około 10 ruchów pipety w górę i w dół jest wystarczających do dysocjacji tkanki. Roztwór stanie się mętny. Pozostawić zawiesinę na 30-60 sekund, aby większe fragmenty niedysocjowanej tkanki opadły na dno probówki.</li>
<li>Przenieść zawieszone komórki (uważając, aby nie pobrać niedysocjowanych fragmentów tkanki z dna) do nowej stożkowej probówki 15 ml za pomocą końcówki pipety pokrytej surowicą. Odwiruj przy około 200xg przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować medium do resuspensji. W tym celu zmieszać 2,7 ml EBSS z 300 μl zrekonstytuowanego roztworu inhibitora albuminy-owomukoidy w sterylnej probówce. Dodać 150 μl roztworu DNase z kroku 2.4.</li>
<li>Po wirowaniu odlać nadsącz i natychmiast resuspendować osad komórkowy w rozcieńczonym roztworze DNase/inhibitora albuminy przygotowanym w kroku 4.3, używając sterylnej końcówki p1000 z filtrem pokrytej surowicą.</li>
<li>Przygotować nieciągły gradient gęstości w następujący sposób. Dodać 5 ml roztworu inhibitora albuminy-owomukoidy do stożkowej probówki 15 ml. Ostrożnie nałożyć zawiesinę komórkową na górę. Wirować przy około 70xg przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Dysocjowane komórki tworzą osad na dnie probówki, a fragmenty błon pozostają na granicy faz.</li>
<li>Jeśli chcą Państwo uzyskać hodowle wzbogacone w komórki ziarniste, należy pominąć etap separacji gradientem Percoll (który pozwala na uzyskanie czystszych hodowli ziarnistych komórek móżdżku) i przejść do części 6. Jeśli chcą Państwo dalej izolować komórki ziarniste od gleju i dużych interneuronów za pomocą separacji gradientem Percoll, należy przejść do części 5. Zastosowanie gradientu Percoll zmniejszy wydajność komórek. W naszych badaniach spadek wydajności wynosi około 20-35%. Następuje jednak wzrost stopnia wzbogacenia neuronów ziarnistych i komórek progenitorowych z około 90% do 95-99%.</li>
</ol>
Część 5: Rozdział w gradiencie Percollu
<ol>
<li>Odlej supernatant i natychmiast resuspenduj osad w 2 ml HBSS-glucose z dodatkiem 50 μl DNase z kroku 2.4. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez nylonowy filtr (rozmiar porów 70 μm) metodą grawitacyjną. Ten krok usunie duże komórki nieneuronalne i pozwoli na uzyskanie lepszej zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
<li>Przygotuj dwie wypalane szklane pipety Pasteura. W tym celu delikatnie ogrzewaj końcówkę szklanej pipety w płomieniu, aż krawędź zostanie wygładzona, a prześwit pipety zmniejszy się do 40-50% pierwotnego rozmiaru. Należy uważać, aby otwór nie był zbyt mały.</li>
<li>Przygotuj gradient Percoll. Wlej 10 ml 35% roztworu Percoll do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. 60% Percoll (10 ml) naciągnij do sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml z przymocowaną sterylną igłą spinalną. Delikatnie nanieś 60% roztwór Percoll pod warstwę 35% roztworu, wprowadzając go na dno probówki za pomocą igły spinalnej. Należy zadbać o zachowanie wyraźnej granicy między dwiema warstwami. Dodaj komórki na górę gradientu za pomocą wypalanej pipety, delikatnie wprowadzając je wzdłuż ścianki probówki, aby nie zaburzyć granicy faz.</li>
<li>Ostrożnie umieść probówkę w wirówce i wiruj przy 1800xg. Zwiększaj prędkość stopniowo co 20 sekund (przyrosty prędkości są następujące: około 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg), tak aby osiągnięcie pożądanej prędkości zajęło około 2 minut. Po osiągnięciu 1800xg uruchom czasomierz na 10 min. Po zakończeniu stopniowo zmniejszaj prędkość co 20 sekund.</li>
<li>Usuń górną granicę gradientu (zawierającą duże komórki glejowe, komórki Purkinjego i interneurony) i odrzuć ją.</li>
<li>Ostrożnie pobierz komórki z granicy między 35% a 60% Percoll za pomocą wypalanej pipety i przenieś je do stożkowej probówki 50 ml. Resuspenduj w 3 objętościach HBSS-glucose i wymieszaj, kilkukrotnie odwracając probówkę. Wiruj przez 5 minut przy 1100xg.</li>
<li>Usuń supernatant i dodaj 4 ml pożywki z 10% FBS z dodatkiem 50 μl DNase. Delikatnie resuspenduj osad za pomocą wypalanej pipety, aby utworzyć zawiesinę pojedynczych komórek. Przejdź do kroku 6.2.</li>
</ol>
Część 6: Przygotowanie płytek i wysiewanie
<ol>
<li>Odlej nadsącz i natychmiast resuspenduj osad w 4 ml pożywki z 10% FBS oraz 50 μl DNazy z kroku 2.4. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez siatkę nylonową (rozmiar porów 70 μm) grawitacyjnie. Krok ten usunie duże komórki nieneuronalne i pozwoli na uzyskanie lepszej zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
<li>Wysiej zebrane komórki na płytkę do wstępnego wysiewu pokrytą poli-D-lizyną na 20 minut w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37°C. Powtórz procedurę z użyciem nowej płytki. Astroglia i cięższe komórki osiądą i przylgną do płytek, pozostawiając małe neurony ziarniste oraz komórki progenitorowe neuronów w zawiesinie. Po inkubacji słabo przylegające neurony ziarniste i komórki progenitorowe neuronów można łatwo oderwać i poluzować poprzez delikatne opukiwanie płytki.</li>
<li>Zbierz neurony ziarniste i komórki progenitorowe neuronów do probówki stożkowej 15 ml i odwiruj przy 200xg przez 5 minut. Resuspenduj osad w 1 ml pożywki bezsurowiczej i policz alikwot 10 μl za pomocą hemocytometru.</li>
<li>Dodaj pożywkę bezsurowiczą, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek. Orientacyjne wytyczne dotyczące liczby komórek do wysiania dla średniej gęstości: dla płytek 6-dołkowych 3,5 do 4 milionów komórek; dla płytek 4-dołkowych 650 000 komórek. W przypadku płytek hodowlanych 6-dołkowych wysiewam 1,5 ml/dołek, a dla płytek 4-dołkowych 0,5 ml/dołek. Komórki utrzymuje się w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37°C. Wymień całkowicie pożywkę po 24 godzinach, a następnie co dwa do trzech dni.</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+the+cerebellar+system%3A+in+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+functions%22">Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1997).</li>
<li>Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).</li>
<li>Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHatten%2C+ME+%22in+Culturing+Nerve+Cells%22">in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Mass. 419-419 (1998).</li>
<li>Hatten, M. E. The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).</li>
<li>Carletti, B., Rossi, F. Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).</li>
<li>Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).</li>
<li>Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).</li>
<li>Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).</li>
<li>Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).</li>
<li>Palay, S. L., Chan-Palay, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalay%2C+SL+%22Cerebellar+Cortex%3A+Cytology+and+Organization%22">Cerebellar Cortex: Cytology and Organization</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1974).</li>
<li>Messer, A. Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).</li>
<li>Ruiz I Altaba, A. Development. 126, 3205-3205 (1999).</li>
<li>Wallace, V. A. Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li>
<li>Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).</li>
<li>Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).</li>
<li>Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).</li>
<li>Kenney, A. M., Rowitch, D. H. Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).</li>
<li>Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. Development. 130 (1), 15-15 (2003).</li>
<li>Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. Development. 128, 1481-1481 (2001).</li>
</ol>

Niniejszy protokół opiera się na modyfikacjach procedur opisanych w poprzednich publikacjach3,7,11. Poniżej omówiono kilka istotnych kwestii, na które należy zwrócić uwagę.
Neurony ziarniste i komórki progenitorowe przywierają w ciągu 2 godzin od wysiewania. Zdrowe komórki mają okrągłą morfologię w badaniu pod mikroskopem fazokontrastowym4. W ciągu 24 godzin od wysiewania zdrowe komórki rozprzestrzenią się równomiernie na szkiełkach podstawkowych lub plastikowej ściance ...

<table><tbody><tr><td>Sito do komórek z oczkami o średnicy 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Igła spinalna</td><td>BD Biosciences</td><td>405182</td><td>20G x 3-1/2 inches</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine masa cząsteczkowa &amp;gt;300,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>Każda nowa partia Poly-D-Lysine musi zostać przetestowana.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1644</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td>Musi być wolny od wapnia i magnezu.</td></tr><tr><td>Pożywka Neurobasal A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Suplement Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 bezsurowiczy (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe 12 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td>Produkowane w Niemczech przez firmę Deckgluder.</td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe 25 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3037</td><td>Produkowane w Niemczech przez firmę Deckgluder.</td></tr><tr><td>System dysocjacji papainą</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK 003150</td><td>Zestaw wystarcza na pięć izolacji.</td></tr><tr><td>Nożyczki Permaset</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6782</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont #5 (Dumostar)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4978</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowlana 4-dołkowa</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowlana 6-dołkowa</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140685</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

Kora móżdżku jest dobrze opisaną strukturą, która stwarza wyjątkowe możliwości badania właściwości i rozwoju neuronów1,2. Spośród typów neuronów móżdżkowych (komórek ziarnistych, komórek Purkinjego i interneuronów hamujących), neurony ziarniste są zdecydowanie najliczniejsze i stanowią najliczniejszy typ neuronów w mózgu ssaków. U gryzoni neurony ziarniste móżdżku powstają w ciągu pierwszych dwóch tygodni po urodzeniu z komórek progenitorowych w zewnętrznej warstwie kory móżdżku, czyli zewnętrznej warstwie ziarnistej (EGL). Przedstawiony tutaj protokół opisuje techniki wzbogacania i hodowania neuronów ziarnistych oraz ich komórek progenitorowych z pozarodowego móżdżku myszy. Opiszemy procedury uzyskiwania kultur o coraz wyższej czystości3,4, które mogą być wykorzystane do badania różnicowania się proliferujących komórek progenitorowych w neurony ziarniste5,6. Po zróżnicowaniu się komórek progenitorowych, kultury te zapewniają również homogeniczną populację neuronów ziarnistych do manipulacji eksperymentalnych i charakterystyki zjawisk takich jak synaptogeneza, funkcja receptorów glutaminianu7, interakcja z innymi oczyszczonymi komórkami móżdżku8,9 lub śmierć komórkowa7.

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli progenitorowych komórek ziarnistych neuronów móżdżku oraz neuronów ziarnistych móżdżku z myszy w okresie postnatalnym.

Izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

Kora móżdżku jest dobrze opisaną strukturą, która stwarza wyjątkowe możliwości badania właściwości i rozwoju neuronów1,2. Z...

Procedura rozpoczyna się od wyjęcia móżdżku z myszy w wieku od P4 do P5. Z poszczególnych móżdżków noworodków myszy usuwa się opony mózgowe oraz splot naczyniowy, a następnie zbiera je do konicznej probówki o pojemności 15 ml. Móżdżki są dysocjowane za pomocą papainy, a poprzez delikatne triturację uzyskuje się zawiesinę pojedynczych komórek.Zawiesinę tę filtruje się grawitacyjnie przez nylonową siatkę o rozmiarze porów 70 micron. Przesącz delikatnie nakłada się na nieciągły gradient Percoll i wiruje, aby oddzielić komórki ziarniste od gleju oraz neurony i neurony genu Perkin. Komórki znajdujące się na granicy faz gradientu są zbierane i wysiewane na płytki powlekane polilizyną.Aby dodatkowo usunąć komórki glejne, komórki ziarniste są zbierane, przeliczane i wysiewane z pożądaną gęstością na szklane szkiełka nakrywkowe lub plastikowe płytki hodowlane powlekane poli-D-lizyną. Cześć, nazywam się Hey Young Lee i pracuję w laboratorium dr. Lloyda Greena w Departamencie Patologii na Uniwersytecie Columbia. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i hodowli neuronów ziarnistych móżdżku z myszy postnatalnych.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania proliferacji i różnicowa

isolation-culture-post-natal-mouse-cerebellar-granule-neuron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i hodowlania komórek progenitorowych neuronów ziarnistych móżdżku myszy po urodzeniu oraz neuronów

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku myszy. Komórki są traktowane antymetabolitem w celu wyeliminowania proliferujących komórek glejowych i wytworzenia czystej kultury neuronów ziarnistych móżdżku.

Izolacja i hodowla pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku myszy

Ten film pokazuje izolację i hodowlę komórek progenitorowych móżdżku z móżdżku móżdżku. Progenitorzy neuronów ziarnistości móżdżku są izolowane i oczyszczane poprzez adhezję różnicową, skutecznie usuwając astrocyty. Ci wyhodowani przodkowie następnie różnicują się w neurony ziarniste móżdżku.

Izolowanie i hodowla mysich progenitorów neuronów ziarnistych móżdżku

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek macierzystych z móżdżku myszy po urodzeniu i różnicowania ich w komórki nerwowe. Komórki macierzyste z izolowanej zawiesiny komórkowej są oczyszczane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami i są hodowane w celu utworzenia neurosfer. Neurosfery są następnie utrzymywane w pożywce różnicującej w celu wytworzenia komórek nerwowych.

Izolacja komórek macierzystych z poporodowego móżdżku myszy i różnicowanie w komórki nerwowe

Ten film demonstruje generowanie modelu uszkodzenia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy. Przedstawiono w nim etapy związane z indukcją uszkodzenia neuronów za pomocą NMDA, agonisty receptora neuroprzekaźnika pobudzającego i glicyny, koagonisty. NMDA i glicyna wiążą się ze specyficznymi receptorami neuronalnymi, powodując ich nadmierną stymulację i powodując masowy wewnątrzkomórkowy napływ wapnia, co prowadzi do uszkodzenia i śmierci komórek neuronalnych.

Modelowanie uszkodzenia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.

Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

To badanie przedstawia technikę izolacji neuronów od noworodków myszy WT. Wymaga starannego wypreparowania rdzenia kręgowego od noworodka myszy, a następnie oddzielenia neuronów od tkanki rdzenia kręgowego poprzez mechaniczne i enzymatyczne rozszczepienie.

Izolacja i hodowla neuronów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Przeprowadzanie eksperymentów in vitro w celu jak najdokładniejszego odzwierciedlenia warunków in vivo nie jest łatwym zadaniem. Zastosowanie pierwotnych kultur komórkowych jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórki w całym organizmie. Dostarczony protokół określa, jak skutecznie hodować i hodować embrionalne neurony móżdżku myszy.

Pierwotna hodowla neuronów wyizolowanych z embrionalnego móżdżku myszy

Pokazano tutaj skuteczną i opłacalną metodę oczyszczania, hodowli i różnicowania komórek macierzystych istoty białej z pourodzeniowego móżdżku myszy.

Oczyszczanie komórek macierzystych Prominin-1+ z poporodowego móżdżku myszy

Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych oraz neuronów ziarnistych móżdżku myszy po urodzeniu. Technika ta umożliwia badanie rozwoju neuronów i ich funkcji w warunkach in vitro.

Izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

Przeglądaj więcej filmów