Name: counting bacteria with dilution plates
Uploaded: 2023-04-30T07:09:34.000Z
Duration: 10 min 53 s
Channel: JoVE

1. Configuração
<ol><li>Um fluxograma listando todos os materiais, protocolo experimental stepwise e método para descartar suprimentos deve ser escrito em um caderno de laboratório e mantido perto do espaço de trabalho experimental.</li>
	<li>Os espaços de trabalho devem ser esterilizados com um antisséptico apropriado (70% de etanol) e o experimentador deve mitigar o risco de contaminação usando roupas de laboratório limpas que também os protegem de anomalias de exposição. Roupas adequadas incluem, mas não se limitam a um jaleco, luvas de látex ou nitríis, googles, respiradores e sapatos fechados. É fundamental manter a técnica asséptica o tempo todo.</li>
	<li>Prepare 90 mL de 0,45% salina. Utilizando um cilindro graduado limpo, meça 90 mL de água estéril e transfira para um frasco erlenmeyer limpo rotulado 0,45% salino. Pese 0,405 g de cloreto de sódio (Sigma-Aldrich NaCl S9888) e adicione-o ao frasco rotulado 0,45% salino. Redemoinho repetidamente até que nenhum soluto permaneça visível.</li>
	<li>Após a conclusão, o experimentador deve reestrucionar todas as superfícies e descartar quaisquer organismos indesejados, estoques diluídos, placas de petri ou laços inoculantes descartáveis de acordo com as diretrizes da OSHA. As roupas de laboratório podem ser removidas antes de lavar as mãos.</li>
</ol>2. Preparação de mídia
<ol><li>Selecione mídias apropriadas para o cultivo de um organismo desejado. Na maioria dos cenários, um caldo permitiria um crescimento bacteriano suficiente. Uma vez que organismos de um protocolo winogradsky são desejados aqui, uma coluna composta de carbonato de cálcio, enxofre, celulose e lama foi montada e deixada intacta por 7 dias. A coluna forenamed é separada em seções aeróbicas, microaerófilas e anaeróbicas.</li>
	<li>Escolha um meio apropriado para emplacamento do organismo de interesse. A suplementação de mídia líquida com ágar de grau microbiológico é tipicamente empregada como agente solidificador. O meio/ágar LB é suficiente na coleta de amostras de regiões aeróbicas, microaerófilas e anaeróbicas da coluna forenamed. Nota: As amostras da região microaerófila não foram colhidas para este procedimento. No entanto, esses organismos devem ser cultivados em frascos de velas. Introduzir uma vela nesta câmara de cultivo antes de selar cria um ambiente de baixo oxigênio adequado para a proliferação microaerófila.</li>
	<li>Já que desejamos preparar 250 mL, use frascos erlenmeyer de 500 mL (ou maiores) para evitar a fervura ao se autoclavar. Rotule um "Caldo" e o outro "Agar".</li>
	<li>Determine a quantidade de mídia necessária para criar cada solução seguindo as recomendações de concentração do fabricante. LB Agar, usado aqui, é preparado combinando 25g/L com água ultrapura. Nosso volume de 250 mL requer uma solução de 6,25 LB Agar/250 mL de água. Da mesma forma, o caldo LB é preparado combinando a mesma proporção de caldo LB e água. Como não é complementado com um agente solidificador, não endurecerá quando resfriado.</li>
	<li>Pese a mídia e misture-a com água em proporções consistentes com as recomendações do fabricante. Adicione 6,25g de LB Agar a um frasco rotulado de "Agar", e 6,25g de caldo LB a um frasco rotulado de "Caldo". Adicione 250 mL de água ultrapura a cada frasco.</li>
	<li>Enrole a folha de alumínio sobre cada frasco e use uma autoclave para esterilizar a mídia por um mínimo de 15 minutos a 121°C, 15 psi.</li>
	<li>Usando uma luva ou almofada resistente ao calor, remova os frascos da autoclave quando o ciclo estiver completo e coloque-os em um banho de água de 40-50°C.</li>
	<li>Uma vez alcançada a temperatura apropriada, despeje o conteúdo do frasco rotulado "Caldo" em um Erlenmeyer de 250 mL, ou frasco de fundo redondo. Rotule o frasco de 250 mL "solução0".</li>
	<li>Obtenha placas de petri estéreis de 10, 100mm x 15 mm e rotulá-las com a data, nome, o tipo de mídia utilizada e a zona de coluna winogradsky da qual os organismos serão colhidos.</li>
	<li>Retire o frasco rotulado de "Agar" do banho de água e comece a derramar em cada uma das 10 placas de petri. Não mais do que 15 mL deve ser adicionado a cada prato. Isso também pode ser realizado com um pipettor e uma pipeta sorológica de 25 mL para melhorar a precisão. Use uma ponta de pipeta estéril para remover as bolhas presentes e, em seguida, cubra com as tampas da placa e deixe solidificar durante a noite.</li>
</ol>3. Preparação diluída
<ol><li>Prepare dez tubos de ensaio capazes de armazenar 20 mL ou mais em um rack e rotule-os de T1-T10. Cada número de tubo é consistente com o fator de diluição a que corresponde (ou seja, T4 = 1x10-4 ou 0,0001 ou 1/10.000º da concentração de estoque).</li>
	<li>Pipet 9 mL de 0,45% salina em cada um dos 10 tubos de ensaio.</li>
	<li>Os espaços salinos estão prontos para serem esterilizados por autoclave. Use papel alumínio para cobrir cada um dos 10 tubos de ensaio e, em seguida, transfira-os para um rack de tubo de ensaio compatível com autoclave. Esterilize por um mínimo de 15 minutos a 121°C, 15 psi.</li>
	<li>Remova os espaços em branco usando luvas resistentes ao calor e deixe esfriar. Cubra e armazene a 4°C até que seja necessário quando os tubos atingirem a temperatura ambiente, ou quando esfriar ao toque.</li>
</ol>4. Cultivo de Organismo Alvo
<ol><li>Inocular "solução0"com uma única colônia de uma placa anteriormente listrada ou 50 μL de um estoque congelado. Permita que o organismo alvo se replique colocando a "solução0"inoculada em uma incubadora de 37°C durante a noite com agitação (se necessário). (Nota: O frasco deve ser coberto para evitar contaminação. Se o organismo alvo for aeróbico, use gaze estéril e tampões de algodão para evitar contaminação. Se avaliar regiões da coluna Winogradsky, basta remover 1 grama de cada zona desejada (aeróbica e anaeróbica para efeitos deste estudo) e resuspend em T1 antes de prosseguir para a etapa 5.3.</li>
</ol>5. Diluição em série
<ol><li>Obtenha o frasco rotulado de "Caldo de nutrientes" da incubadora e agite vigorosamente.</li>
	<li>Pipet 1 mL de "solução0"no tubo de ensaio rotulado T1. Vórtice T1. Se avaliar as explantas winogradsky, pese 1 grama da zona desejada e adicione-a ao T1 antes do vórtice. (Nota: 1 mL é usado aqui para a simplicidade- volumes menores ou maiores de diluente também podem ser usados).</li>
	<li>Remova 1 mL do tubo de ensaio T1 e adicione-o ao tubo de ensaio T2. Vórtice T2.</li>
	<li>Remova 1 mL do tubo de ensaio T2 e adicione-o ao tubo de ensaio T3. Vórtice T3.</li>
	<li>Remova 1 mL do tubo de ensaio T3 e adicione-o ao tubo de ensaio T4. Vórtice T4.</li>
	<li>Remova 1 mL do tubo de ensaio T4 e adicione-o ao tubo de ensaio T5. Vórtice T5.</li>
	<li>Remova 1 mL do tubo de ensaio T5 e adicione-o ao tubo de ensaio T6. Vórtice T6.</li>
	<li>Remova 1 mL do tubo de ensaio T6 e adicione-o ao tubo de ensaio T7. Vórtice T7.</li>
	<li>Remova 1 mL do tubo de ensaio T7 e adicione-o ao tubo de ensaio T8. Vórtice T8.</li>
	<li>Remova 1 mL do tubo de ensaio T8 e adicione-o ao tubo de ensaio T9. Vórtice T9.</li>
	<li>Remova 1 mL do tubo de ensaio T9 e adicione-o ao tubo de ensaio T10.</li>
</ol>6. Espalhar revestimento
<ol><li>Pipet 100 μL de uma amostra diluída de T1 diretamente em uma placa de petri. Este passo pode ser, mas não precisa ser repetido para cada tubo.</li>
	<li>Obtenha uma haste estéril e descartável ou uma chama esterilize uma haste de vidro. Em um movimento no sentido horário/anti-horário, deslize a porção horizontal da haste de propagação para distribuir igualmente a amostra dentro da placa de petri.</li>
	<li>Repita para cada região da coluna Winogradsky que deve ser avaliada.</li>
	<li>Incubar placas em uma incubadora de 37°C por 24 horas. Para organismos anaeróbicos, use uma câmara anaeróbica.</li>
</ol>7. Streaking
<ol><li>Selecione uma diluição apropriada do seu organismo alvo. Por exemplo, a solução4 produzirá uma diluição de 1/10.000 da sua concentração inicial. Normalmente, diluições de 1/1.000th (T3/Solution), 1/1.000.000th (T6/Solution6) e 1/1.000.000.000th (T9/Solution9) são avaliadas para micróbios enumerados.</li>
	<li>Usando um laço de inoculação descartável plástico ou um laço de inoculação de metal reutilizável que está sob fogo há pelo menos 10 segundos, mergulhe na solução desejada a partir do passo 5. Os loops de inoculação calibrados devem transferir 0,01 mL. (Cuidado: Não permita que o laço flamede entrar em contato com bactérias imediatamente após a remoção do calor)</li>
	<li>Levante ligeiramente a tampa da placa de petri de um lado para que apenas o laço inoculante possa acessar o ágar. Deslize o laço inoculante através do topo da mídia de uma forma em zig-zag tomando cuidado para não comprometer o ágar. Abaixe a tampa da placa de petri.</li>
	<li>Use um novo laço de inoculação descartável ou reesterirei seu loop reutilizável.</li>
	<li>Gire a placa por aproximadamente 1/3rd (~118°) e reduza a frequência do movimento zig-zag.</li>
	<li>Novamente, use um novo laço descartável ou reesterirei uma alça metálica antes de girar um tempo final e reduzir a frequência em zig-zag mais uma vez. Abaixe a tampa da placa de petri.</li>
	<li>Repetição de passos 7.2 - 7.6 até que pelo menos três placas de petri tenham sido listradas para três diluições diferentes, usando um novo laço descartável ou re-flamejando um loop reutilizável(Figura 2).</li>
	<li>Coloque pratos de petri listrados em uma incubadora de 37°C durante a noite. Para organismos anaeróbicos, use uma câmara aeróbica.</li>
</ol>8. Análise e Resultados de Dados
<ol><li>As culturas foram colhidas das zonas oxica e anoxica de uma coluna winogradsky de 7 dias. Estas zonas são adequadas para anaeróbios heterotróficos e oxidantes de ferro, respectivamente.</li>
	<li>As explantas da coluna foram diluídas em série antes de listrar ou se espalhar em placas LB Agar.</li>
	<li>Streaking revelou uma população mista de cada uma das zonas de Winogradsky avaliadas. As placas de difusão produziram resultados semelhantes.</li>
	<li>Para calcular CFU/mL ou UFC/g, é média o número de colônias contadas a partir de três placas. Multiplique o número médio de colônias pelo fator de diluição e divida pela quantidade alitada. Por exemplo, se uma média de 65 colônias fosse contada em placas inoculadas com 0,1 mL de solução6 (T6) a fórmula descrita anteriormente seria igual a 650.000.000 UFC/mL.</li>
	<li>Colônias isoladas agora podem ser escolhidas de cada placa para uso em ensaios de enriquecimento para determinar a identidade das espécies.</li>
</ol>

Enumeração bacteriana e isolamento da tensão por chapeamento requer concentrações gerenciáveis de organismos alvo. O revestimento bem sucedido depende, portanto, da diluição serial. Como tal, as técnicas supracitadas continuam a ser a pedra angular do exame microbiológico e da experimentação. Embora simples pelo design, fatores de diluição e técnica de chapeamento podem ser modificados pelo experimentador para reforçar os resultados sem comprometer a integridade de cada método. Traçar as quatro fases do crescimento bacteriano pode ser útil ao caracterizar micróbios desejados. Essas fases, lag, log, estacionárias e morte, são marcadas por mudanças na replicação bacteriana. A fase de defasagem apresenta crescimento lento devido à adaptação fisiológica, a fase de registro é o período de proliferação máxima com um aumento exponencial de células viáveis, a fase estacionária é então alcançada devido a limitações ambientais e acúmulos de toxinas, antes da fase de morte onde as contagens de células começam a cair. Isso pode ser feito diluindo em série (ou diluindo 1 passo para evitar confusão) Solução0 a cada hora por um total de 8 horas, começando no Time0 (a Solução0 deve ser devolvida a uma incubadora de agitação após cada diluição). Calcule o registro10 de CFU/ml para um único diluente do Tempo0 e plote no eixo Y. Repita este cálculo para a amostra Tempo1 (certifique-se de calcular CFU/mL usando o mesmo fator de diluição que o Tempo0). Repita até que cada vez (Hora1-Tempo8) sejam plotados no eixo X.

diluições em série e plaqueamento: enumeração microbiana

Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

Fonte: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, e Christopher P. Corbo1 1 Departamento de Ciências Biológicas, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
A avaliação quantitativa dos procariotes pode ser onerosa dada a sua abundância, propensão à proliferação exponencial, diversidade de espécies dentro de uma população e necessidades fisiológicas específicas. Compondo esse desafio, é a natureza de quatro fases em que as bactérias se replicam (lag, log, estacionário e morte). A capacidade de estimar com precisão a concentração de microrganismos é necessária para uma identificação, isolamento, cultivo e caracterização bem-sucedidas (6). Como tal, os microbiologistas têm utilizado diluição serial e várias técnicas de chapeamento por mais de um século para quantificar de forma confiável a carga bacteriana e viral em ambientes clínicos, industriais, farmacêuticos e acadêmicos (2,4,6). Descrições dessa metodologia apareceram pela primeira vez em 1883, quando o cientista e médico alemão Robert Koch publicou seu trabalho sobre agentes causadores de doenças infecciosas (2). Muitas vezes referida como o pai da bacteriologia moderna, as técnicas forenamed de Koch tornaram-se o padrão ouro para a enumeração de microrganismos, culturable ou não, em todo o mundo.
A diluição serial é uma redução sistemática de uma entidade conhecida ou desconhecida (um soluto, organismo, etc.) através da sucessiva re-suspensão de uma solução inicial (solução0) em volumes fixos de um diluente líquido (em branco). Esses espaços em branco geralmente consistem em 0,45% salino, embora a composição possa ser variada (7). Embora um experimentador possa escolher qualquer volume para cada diluído, é na maioria das vezes um múltiplo de 10, facilitando a redução logarítmica da amostra. Por exemplo, a solução0 contém um total de 100 células E. coli suspensas em 10 mL de caldo de nutrientes. Se 1 mL de solução0 for removido e adicionado a 9 mL de soro fisiológico (diluente1),a nova solução (solução1) conteria 1/10 da concentração inicial de E. coli. Neste exemplo, a nova solução (solução1) conteria 10 células E. coli. Repetir este processo removendo 1 mL da solução1 e adicionando-o a outros 9 mL de soro fisiológico (diluente2) renderia a solução 2 , contendoapenasuma única célula E. coli. Uma vez que cada nova solução (9 mL de diluente + 1 mL de solução) contém um total de 10mL, podemos concluir que o fator de diluição para essa redução é de 10 ou que esta foi uma diluição serial de 10 vezes(Figura 1). Como só começamos com 100 células neste exemplo e estamos diluindo por um fator de 10, apenas dois passos são necessários para alcançar a concentração mínima absoluta de 1 célula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig1.jpg"> Figura 1: Diluição em série de uma solução de estoque. Uma alíquota de 1 mL da solução de estoque (solução0) é adicionada ao tubo 1 que contém 9 mL de 0,45% de soro fisiológico (dilent1); o produto desta mistura é a solução1. Repita aliquoting 1 mL da solução recém-criada1 e adicioná-lo ao tubo 2. A aliquotação e a resuspensão continuam desta forma até que o tubo final seja atingido, diluindo a concentração de estoque por um fator de 10 cada um a cada etapa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A diluição serial é a técnica mais simples para obter concentrações gerenciáveis de um organismo desejado e é complementada por listras e espalhamento de placas de petri, apenas duas das muitas técnicas de chapeamento usadas por microbiologistas. Este benefício desta abordagem é que o experimentador pode colher cepas puras de uma única espécie ou separar cepas de uma população mista (7). O streaking é realizado introduzindo um organismo a um meio sólido (geralmente consistindo de agarose) que ele crescerá sobre se os nutrientes apropriados estiverem disponíveis. Varrer suavemente um laço inoculante estéril através do meio (de modo que uma raia sutil permanece) em um rígido padrão sinusoidal irá distribuir o organismo proporcionalmente à frequência da forma de onda do experimentador. Dividir a placa de Petri em terços (raia do quadrante) e diminuir a frequência de cada raia à medida que uma nova região da placa é inserida reduzirá gradualmente o número de microrganismos que podem ocupar aquela região, produzindo colônias únicas em vez de um gramado bacteriano inquantificável. O revestimento disseminador não dilui adicionalmente as amostras; um espalhador de vidro estéril é usado para distribuir uma alíquota de mídia de suspensão através de uma placa de petri inteira(Figura 2). As colônias que crescem na placa de propagação surgem de uma única célula e cada colônia no prato pode ser contada para estimar o número de unidades formadoras de colônias por mililitro (CFU) em uma determinada suspensão, representadas como CFU/mL (6)(Figura 3) Ágar macio e trinagem são variações das técnicas acima mencionadas e permitem o isolamento de bacteriófago e triagem mutante, respectivamente (1,7).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig2.jpg"> Figura 2: Listramento de placa para enumeração bacteriana e isolamento da tensão. Rotule a parte inferior de uma placa de petri com informações de identificação (nome da bactéria, data, mídia) e divida em terços. Depois de selecionar uma diluição apropriada da amostra de estoque, pegue um laço inoculante estéril (descartável ou inflamado) e submerse-o no tubo de ensaio (aqui, T3). Levante ligeiramente a tampa da placa de petri de um lado para que apenas o laço inoculante possa acessar o ágar. Deslize o laço inoculante através do topo da mídia de uma forma em zig-zag tomando cuidado para não comprometer o ágar. Gire a placa por aproximadamente 1/3rd (~118°) e reduza a frequência do movimento zig-zag. Gire um tempo final e reduza a frequência em zig-zag mais uma vez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig3.jpg"> Figura 3: Espalhe o revestimento. 1 g da zona aeróbica foi resuspended em T1 e, em seguida, diluído em série. Um vidro estéril ou vara descartável de plástico é usado para distribuir inóculo em cada prato. Isso se repetiu com 1 g da zona anaeróbica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Como acontece com as diluições seriais, uma escala logarítmica é empregada para expressar a concentração do organismo. O número de colônias cultivadas em placas de petri padrão medindo 100mm x15mm pode ser enumerado manualmente (ou automatizado com o auxílio do processamento computacional) identificando clusters isolados de crescimento. Contagem que totalizam menos de 30 ou mais de 300 devem ser definidas como muito poucos para contar (TFTC) ou muito numerosos para contar (TNTC), respectivamente. No caso deste último, uma diluição seriada deve ser realizada para reduzir a concentração antes de reestilar uma nova placa de petri. A média do número de colônias independentes identificadas a partir de três placas de petri separadas e multiplicando a média pelo fator de diluição produzirá UFC/mL; plotar o registro10 de UFC/mL contra o tempo revelará o tempo médio de geração do organismo (7).

Diluições em série e plaqueamento: enumeração microbiana

Source: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, and Christopher P. Corbo1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island ...

Às vezes, para identificar e estudar bactérias, primeiro precisamos isolá-las e enriquecê-las de uma amostra. Por exemplo, amostras obtidas de uma Coluna de Winogradsky são mistas, o que significa que contêm várias espécies ou cepas de bactérias, portanto, estudar uma bactéria individual ou enumerar os diferentes tipos presentes pode ser um desafio. Para este fim, técnicas de diluição e plaqueamento em série são normalmente empregadas para quantificar de forma confiável a carga bacteriana e isolar colônias individuais. A diluição em série é um processo pelo qual a concentração de um organismo, bactéria neste exemplo, é sistematicamente reduzida por meio de ressuspensão sucessiva em volumes fixos de diluente líquido. Normalmente, o volume do diluente é um múltiplo de 10 para facilitar a redução logarítmica do organismo da amostra. Por exemplo, um grama de sedimento é primeiro removido da zona de interesse de Winogradsky e adicionado a 10 mililitros de um meio líquido apropriado. Em seguida, um mililitro desta primeira diluição é adicionado a outro tubo contendo nove mililitros de meio. O processo pode ser repetido até que várias concentrações diferentes de bactérias tenham sido preparadas. A diluição em série é a chave para a enumeração de bactérias neste exemplo, uma vez que amostras mistas de uma coluna de Winogradsky contêm um número desconhecido, geralmente grande, de bactérias. Em seguida, o revestimento estriado e o revestimento espalhado permitem o isolamento e a enumeração de bactérias dentro de uma amostra, respectivamente. A estria é realizada introduzindo uma amostra diluída em uma seção do meio sólido suplementado com nutriente, que é dividido em terços. Este inóculo é então espalhado por cada terço da placa em zigue-zague. À medida que diferentes seções da placa são listradas, cruzando a amostra anterior apenas uma vez, a amostra é espalhada mais finamente. Isso significa que você só pode precisar passar de uma diluição para obter colônias individuais nas seções posteriores. Após a incubação, as placas listradas permitem observações da morfologia da colônia, informações que podem ajudar a diferenciar entre diferentes espécies bacterianas. Alternativamente, se o objetivo principal for a enumeração das bactérias na amostra, o plaqueamento pode ser usado. No chapeamento espalhado, uma alíquota de uma única amostra é espalhada uniformemente por toda a superfície do meio sólido. Normalmente, como não sabemos o número de bactérias na amostra mista, uma placa de propagação é feita para cada uma das diluições ou uma amostra representativa delas. Após a incubação, a enumeração pode ser realizada usando essas placas espalhadas. Quaisquer placas com contagens de colônias inferiores a 30 devem ser descartadas, pois contagens pequenas estão sujeitas a erros maiores. Da mesma forma, qualquer contagem acima de 300 deve ser descartada porque a aglomeração e sobreposição de colônias podem levar à subestimação da contagem de colônias. Se a contagem de colônias de cada um desses pratos restantes for registrada e multiplicada pelo fator de diluição e, em seguida, dividida pelo volume banhado, isso produz as unidades formadoras de colônias, ou UFCs, por mililitro de suspensão. Neste vídeo, você aprenderá como avaliar qualitativa e quantitativamente uma amostra contendo uma bactéria conhecida e as comunidades microbianas contidas em várias regiões de uma coluna de Winogradsky por meio de diluição em série, espalhamento e estrias. Primeiro, coloque qualquer equipamento de proteção individual apropriado, incluindo jaleco, luvas e óculos de proteção. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho com etanol 70% e limpe a superfície. Em seguida, reúna dois frascos de Erlenmeyer de 500 mililitros e rotule um caldo e o outro ágar. Para preparar a solução de ágar LB, misture aproximadamente 6,25 gramas de ágar LB, três gramas de ágar técnico e 250 mililitros de água destilada no frasco rotulado como ágar. Em seguida, prepare o caldo LB combinando 2. 5 gramas de meio LB e 100 mililitros de água destilada no caldo rotulado com frasco. Após a autoclavagem dos frascos, use uma luva resistente ao calor para remover os frascos da autoclave e coloque-os em banho-maria de 40 a 50 graus Celsius. Quando os frascos estiverem a 50 graus Celsius, prepare cuidadosamente três alíquotas de 100 mililitros da solução de caldo e rotule cada solução de alíquota como zero. Em seguida, reúna 10 placas de Petri estéreis e rotule-as com a data, nome, tipo de meio usado e a zona da Coluna Winogradsky da qual os organismos serão colhidos. Pipetar 15 mililitros de ágar-ágar do balão de ágar para cada placa de Petri. Em seguida, use a ponta da pipeta para remover quaisquer bolhas, recoloque as tampas das placas e deixe-as solidificar na bancada durante a noite. No dia seguinte, limpe a bancada com etanol 70%. Em seguida, rotule 10 tubos de ensaio de 20 mililitros T1 a T10 e coloque-os em um rack. Pipete nove mililitros de solução salina de 0,45% em cada tubo. Agora, cubra cada um dos 10 tubos de ensaio frouxamente com suas tampas e transfira-os para um suporte de tubo de ensaio compatível com autoclave. Após a conclusão do ciclo, remova os espaços em branco com luvas resistentes ao calor e deixe-os esfriar. Armazene os tubos em temperatura ambiente até que atinjam aproximadamente 22 graus Celsius. Para cultivar um organismo-alvo conhecido, E. coli neste exemplo, inocule 100 mililitros de solução zero com uma única colônia de uma placa previamente listrada. Em seguida, cubra o tubo e incube-o durante a noite a 37 graus Celsius. Para avaliar as regiões de uma coluna de Winogradsky, adicione aproximadamente um grama de material da zona aeróbica a T1 e ressuspenda por vórtice. Em seguida, repita esse processo com um grama de material da zona anaeróbica. Remova o tubo contendo a solução zero inoculada com E. coli da incubadora e agite-o. Em seguida, pipete um mililitro da solução em um tubo de ensaio T1 e vórtice para misturar. Remova um mililitro de solução de T1 e transfira-o para T2, vórtice para misturar. Repita este processo através do tubo T10. Para avaliar as zonas aeróbicas e anaeróbicas da coluna de Winogradsky, remova um mililitro de solução de cada um dos tubos T1 previamente preparados e transfira-o para os tubos T2 apropriados. Em seguida, continue as diluições seriadas através dos tubos T10 conforme demonstrado anteriormente. Para espalhar a placa, pipetar 100 microlitros da amostra diluída de cada tubo T3 para a placa de Petri correspondente. Em seguida, use uma haste de espalhamento estéril para distribuir suavemente a amostra na placa de Petri e recoloque a tampa da placa. Repita este processo para as diluições T6 e T9, conforme demonstrado anteriormente. Incube as placas contendo organismos aeróbicos em uma incubadora de 37 graus Celsius por 24 horas. Incubar as placas contendo organismos anaeróbicos em uma câmara anaeróbica ajustada para 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, remova as placas de diluição T3, T6 e T9 da incubadora e da câmara anaeróbica e transfira-as para a bancada. Trabalhando com uma placa de cada vez, deslize uma alça de inoculação estéril pela parte superior da mídia em zigue-zague. Em seguida, recoloque a tampa da placa de Petri. Em seguida, gire a placa em 1/3 e esterilize o laço para reduzir a frequência do padrão em zigue-zague feito anteriormente. Novamente, depois de esterilizar o laço, gire a placa em 1/3, reduza a frequência do padrão em zigue-zague uma última vez e recoloque a tampa. Repita este método de listras para as placas restantes, conforme mostrado anteriormente. Em seguida, coloque as placas listradas contendo organismos aeróbicos em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite e as placas listradas contendo organismos anaeróbicos em uma câmara anaeróbica ajustada para 37 graus Celsius durante a noite. As culturas foram colhidas nas zonas aeróbicas e anaeróbicas de uma coluna de Winogradsky de sete dias. Em seguida, as culturas foram diluídas em série antes de estriar e espalhar em placas de ágar LB. As listras revelaram uma população mista de cada uma das zonas de Winogradsky avaliadas, e as placas espalhadas produziram resultados semelhantes. Um prato listrado de uma população mista resultará em colônias bacterianas de diferentes formas, tamanhos, texturas e cores. Em contraste, as placas listradas e espalhadas contendo o organismo conhecido, E. coli, demonstraram uma população homóloga. Geralmente, é melhor calcular as UFC por mililitro usando a contagem média de colônias de três placas espalhadas com a mesma amostra e fator de diluição. Multiplique o número médio de colônias pelo fator de diluição e divida pela quantidade alíquota. Finalmente, colônias isoladas escolhidas de cada placa podem ser usadas em ensaios de enriquecimento adicionais para determinar a identidade da espécie.

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JoVE Science Education

Advanced Biology

Biologia Avançada

Microbiology

Microbiologia

counting bacteria with dilution plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs.

Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed volume of diluent, or blank, such as 0.45% saline. When 1 mL is transferred into 9 mL of saline, the sample is diluted 10-fold. Repeating that step again lowers the concentration even more, and only two steps are needed in the example of 100 E. coli cells to reach a single cell.

Plating methods help separate microorganisms and make colonies visible. Streaking uses a sterile inoculating loop on agar, a solid growth medium, to spread cells across the plate. In a quadrant streak, the plate is divided into thirds or fourths, and each new area is streaked less often so fewer cells land there. This can produce single colonies instead of a bacterial lawn and can help isolate a pure strain from a mixed sample.

Spread plating uses a sterile glass spreader to distribute an aliquot over the whole petri dish. This method does not add another dilution step. The colonies that grow are counted as colony forming units, or CFU, which are reported as CFU/mL. Soft agar and replica plating are related methods. They can be used for bacteriophage isolation and mutant screening.

Colony counts are usually done on standard 100 mm by 15 mm petri dishes. Isolated colonies can be counted by hand or with computer tools. Plates with fewer than 30 colonies are too few to count, or TFTC. Plates with more than 300 colonies are too numerous to count, or TNTC. If a plate is TNTC, another serial dilution should be done before restreaking a new plate.

To estimate CFU/mL, scientists average the number of colonies from three separate plates and multiply by the dilution factor. The same log scale used in dilution work also helps show how organism concentration changes over time. Plotting log10 CFU/mL against time can reveal the mean generation time of the organism.

Counting Bacteria with Dilution Plates

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

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Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

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Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

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Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

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Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

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Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

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Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Esta coleção demonstra as principais ferramentas de investigação microbiológica, incluindo técnica estéril adequada e plaqueamento, como usar meios seletivos e enriquecer amostras e métodos de cultura para amostras puras ou mistas. Além disso, analisa métodos comuns para identificar isolados microbianos, bem como procedimentos para a manipulação genética de bactérias.

Learn how serial dilution, streaking, and spread plating help scientists count bacteria, isolate colonies, and estimate CFU/mL in lab samples.

Counting Bacteria with Dilution Plates

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