Name: measuring bacterial resistance with e-tests
Uploaded: 2023-04-30T07:10:10.000Z
Duration: 13 min 39 s
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From Molecules To Organisms: Structures And Processes

HS-LS1-8

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Antibiotic Susceptibility Testing: Epsilometer Tests to Determine MIC Values of Two Antibiotics and Evaluate Antibiotic Synergy

1. Testes de epsilômetro (E-testes)
<ol><li>
Configuração
	<ol>
<li>Use luvas e um jaleco.</li>
		<li>Prepare o espaço de trabalho esterilizando-o usando 70% de etanol</li>
		<li>Coletar placas de ágar Mueller-Hinton (placas MHA)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando um padrão de turbidez McFarland nº 0,5
	<ol>
<li>Prepare uma solução de 1% de cloreto de bário (BaCl2): Adicione 1 grama de cloreto de bário anidro (BaCl2) em água destilada de 100 mL. Vórtice bem.</li>
		<li>Prepare uma solução de 1% de ácido sulfúrico (H2SO4): Adicione 1 mL de H2SO4 concentrado em 99 mL de água destilada. Vórtice bem.</li>
		<li>Prepare um padrão de turbidez mcfarland nº 0,5: Solução 50 μL BaCl2 em 5 mL de solução 1% H2SO4. Vórtice a solução bem para obter uma suspensão turva.</li>
		<li>Mantenha o padrão de turbidez mcFarland nº 0,5 em um tubo coberto de papel alumínio. Armazene a 25°C por uma máxima de 6 meses. Vórtice bem para uma solução homogênea antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando placas MHA
	<ol>
<li>Raspe as bactérias do grupo G do grupo G da placa de ágar de sangue usando um laço estéril. Misture em 1mL de soro fisiológico, e vórtice a uma suspensão da bactéria.</li>
		<li>Compare a suspensão a um McFarland padrão nº 0.5 para alcançar a mesma turbidez, a fim de ter o mesmo tamanho inóculo durante os experimentos. Ajuste a concentração usando soro fisiológico adicional ou bactérias.</li>
		<li>Inocular as placas de MHA usando um aplicador de ponta de algodão estéril. Limpe a placa suavemente para cobrir a superfície. Prossiga com um dos três métodos descritos abaixo (1.4-1.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Teste único de resistência a antibióticos. Grupo Streptococcus G, resistência à penicilina G ou gentamicina<ol>
<li>Coloque uma tira de teste E (penicilina G ou gentamicina) no centro da placa MHA(Figura 1 A,B).</li>
		<li>Incubar por 18-20 horas, 37°C.</li>
		<li>Leia os resultados. O MIC é medido como a zona de inibição que cruza a tira de teste de antibióticos classificada(Figura 1 C,D).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig1.jpg"> Figura 1: Teste único. Colocação de uma tira de teste E de A) penicilina G e B) gentamicina em uma placa de ágar Mueller Hinton coberta com colônias bacterianas de um grupo G streptococci antes(A e B) e depois(C e D) incubação durante a noite a 37°C 5% CO2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="5"><li>
Sinergia testando abordagem cruzada. Grupo Streptococcus G, resistência à penicilina G e gentamicina.<ol>
<li>Coloque duas tiras de teste E com antibióticos diferentes (por exemplo, penicilina G e gentamicina) na placa MHA inoculada em uma formação cruzada.<ol>
<li>Para obter os resultados mais precisos, o objetivo é colocar a cruz em um ângulo de aproximadamente 90° na intersecção entre as balanças em seus valores MIC, previamente determinado em um único teste de resistência a antibióticos(Figura 2 A).</li>
			<li>Note que uma vez que as tiras são colocadas na placa de ágar, elas não devem ser movidas, uma vez que alguns antibióticos já podem ter sido absorvidos pela placa. Portanto, é mais apropriado manter as tiras em um ângulo ligeiramente errado (por exemplo, 85°) e até 1-2 mm do valor mic real. É aconselhável executar o experimento em triplicado para reduzir este problema.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incubar por 18-20 horas, 37°C.</li>
		<li>Leia os resultados. O MIC é medido como a zona de inibição que cruza a tira de teste de antibióticos classificada em cada tira de teste E(Figura 2 B).</li>
		<li>Use a fórmula para concentração inibitória fracionária (FIC) (Equação 1) a fim de determinar a sinergia.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig2.jpg"> Figura 2: Detecção de sinergismo - teste cruzado. Resultados dos testes de sinergia antimicrobiana do MIC da penicilina G e gentamicina no grupo Streptococcus G antes (A) e depois (B) incubação durante a noite a 37°C 5% DE CO2. Forma-se um ângulo de 90° entre os dois valores MIC individuais (penicilina G: 0,094 μg/mL, gentamicina: 8 μg/mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="6"><li>
Sinergia testando abordagem não cruzada. Grupo Streptococcus G, resistência à penicilina G e gentamicina.<ol>
<li>Coloque a tira de teste E no centro da placa MHA(Figura 3 A,D).</li>
		<li>Marque onde o valor MIC previamente determinado estava em cada tira.</li>
		<li>Incubar por 1 hora em temperatura ambiente.</li>
		<li>Descarte a tira de teste E para cada placa MHA(Figura 3 B,E).</li>
		<li>Coloque a segunda tira de teste E (contendo um antibiótico diferente) na área da tira removida anteriormente, respectivamente, para que seus valores MIC correspondam à marca e estejam alinhados.</li>
		<li>Incubar por 18-20 horas, 37°C.</li>
		<li>Leia os resultados. O MIC é medido como a zona de inibição que cruza a tira de teste de antibióticos classificada em cada tira de teste E(Figura 3 C,F).</li>
		<li>Para determinar a sinergia, utiliza-se a fórmula de concentração inibitória fracionária (FIC)(Equação 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig3.jpg"> Figura 3: Detecção de sinergismo - teste não transversal. Resultados dos testes de sinergia antimicrobiana do MIC da penicilina G e gentamicina no grupo Streptococcus G. A) Tira de gentamicina (8 μg/mL centrada) em cima de bactérias do grupo G streptococcus, B) Remoção da tira de gentamicina, C) Tira g de gentamicina combinada / penicilina (0,094 μg/mL centrada) em cima das bactérias G do grupo Streptococcus, D) Penicilina G strip (0,094 μg/mL centrada), E) Remoção da tira G penicilina, F) Penicilina combinada G / tira de gentamicina (8 μg/mL centrada) em cima das bactérias Do grupo G de Streptococcus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Teste de caldo
<ol><li>
Configuração
	<ol>
<li>Use luvas e um jaleco.</li>
		<li>Prepare o espaço de trabalho esterilizando-o usando 70% de etanol</li>
		<li>Coletar caldo MH de 15mL com 50% de sangue de cavalo e 20 mg/mL β-NAD (MH-F)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(Opcional) Realize um teste eletrônico [Protocolo 1] para determinar o MIC em meio sólido
	<ol>
<li>Embora opcional, tal conhecimento permitirá um melhor design experimental (por exemplo, as concentrações de antibióticos adicionados podem ser projetadas para cercar o valor MIC determinado a partir da placa), melhorando as chances de um experimento bem-sucedido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando um inóculo bacteriano. Como dito acima, a concentração bacteriana pode ser estimada por medidas de OD nm ou padrões de turbidez mcFarland<ol>
<li>
Método OD600 nm
		<ol>
<li>Obtenha uma suspensão bacteriana com uma concentração bacteriana estabelecida</li>
			<li>Diluir a cultura no caldo MH-F para alcançar um OD600 de 0,003</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Método de turbidez de McFarland
		<ol>
<li>Coloque caldo MH-F de 15 mL em um tubo estéril.</li>
			<li>Inocular o caldo MH-F com bactérias (de uma placa) a um nível McFarland. Vórtice a solução vigorosamente. Despeje a solução em uma placa de Petri estéril.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando antibióticos
	<ol>
<li>Determine a concentração de antibióticos desejados<ol>
<li>Identifique o valor MIC do teste E (ex. 0,125 μg/mL para penicilina G e 8 μg/mL para gentamicina)</li>
			<li>Multiplique o valor MIC da placa de ágar por2 4-27, correspondendo a diluições seriais de quatro a sete 2x. Esta será a concentração inicial de antibióticos. (ex. para penicilina G, sete diluições seriais 2x: 0,125 μg/mL x 27 = 16 μg/mL; para gentamicina, quatro diluições seriais 2x 8 μg/mL x 24 = 128 μg/mL</li>
			<li>Multiplique o valor inicial desejado 100x para determinar a geração de uma concentração de estoque dos antibióticos (ex. estoques de 1,6 mg/mL penicilina G e 12,8 mg/mL gentamicin)</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare uma concentração de estoque de antibióticos de 100x em conformidade<ol>
<li>Dissolva os antibióticos em 10mL de água autoclavada e vórtice para gerar uma solução de estoque (ex. 16 mg penicilina G e 128 mg de gentamicina para criar os estoques acima)</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adicione bactérias a poços de microplacícios
	<ol>
<li>Aliquot 200 μl caldo MH-F contendo bactérias inóculos para os poços nas primeiras 3 fileiras de uma placa de microtiter de 96 poços para um experimento em triplicado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adicione antibióticos a poços de microplato
	<ol>
<li>Adicione 200 μL de caldo extra MH-F com bactérias à primeira coluna de poços (A1, B1, C1) para levar o volume total a 400 μL.</li>
		<li>Adicione 4 μL da concentração de estoque de antibióticos à primeira coluna de poços. Uma vez que a amostra contém 400 μL resultará em uma diluição de 100x dos antibióticos.</li>
		<li>Gerar uma diluição serial de 2x transferindo 200 bactérias/antibióticos μL de A1 para A2, até A11. Pipet vigorosamente entre as diluições. Repita o passo para linhas adicionais.</li>
		<li>Remova 200 μL da coluna 11 para que o volume final em todos os poços seja de 200 μL.</li>
		<li>Deixe a última coluna (A12, B12, C12) sem antibióticos, como controles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determine valores MIC
	<ol>
<li>Incubar a placa de microtiter de 96 poços por 24 horas a 37°C sem tremer.</li>
		<li>O valor MIC é definido como o último poço da série de diluição que não apresenta crescimento visível de bactérias(Figura 4). Esse valor, no entanto, só pode ser confiável se o tamanho original do inóculo estiver correto.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig4.jpg"> Figura 4: Determinação mic por diluição de caldo. Mic é aqui definido como o último poço que exibe clareza (sem crescimento de bactérias) antes de mudar a turbidez. Linha são duplicatas do valor MIC da penicilina G e linha são duplicatas do valor MIC da gentamicina, ambas versus um isolado do Streptococcus grupo G. A) interpretação experimental real, B) interpretação esquemática dos valores de A (cinza = sem crescimento; branco = crescimento). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig5.jpg"> Figura 5: Procedimento esquemático da série de diluição para contar a concentração original de bactérias. Diluições foram realizadas como descrito (20 μL diluídos em 180 μL para uma série de diluição de 10x), e, em seguida, 10 μL das linhas A-H são banhados em duas placas de ágar de sangue separadas, conforme indicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="8"><li>
Determinar o tamanho do inóculo original NOTA: Os ensaios de microbroth são altamente sensíveis para o tamanho original do inóculo usado. Um tamanho excessivo de inóculo dará um resultado falso positivo, uma vez que os antibióticos adicionados não serão capazes de inibir o crescimento por mais tempo nessa proporção. Portanto, é fundamental verificar quanta bactéria foi adicionada aos microwells. Embora os dados não estejam disponíveis no ponto do experimento (devido à necessidade de incubação de 24 horas), ele servirá como um controle. Se o número de bactérias adicionadas estiver dentro da faixa de concentração indicada, os valores mic podem ser confiáveis. Se o inóculo era muito alto ou muito baixo, o experimento precisa ser repetido.<ol>
<li>
Diluir seriamente as bactérias
		<ol>
<li>Prepare uma placa microtiter de 96 poços para diluir a concentração bacteriana original, a fim de determinar o tamanho do inóculo. O ideal é um volume de 200 μL com 10 bactérias5-6. Para realizar as diluições, primeiro aliquot 180 μL PBS estéril para cada poço em B-H (em triplicado 1-3).</li>
			<li>Em seguida, adicione 100 μl de solução bacteriana a A (em triplicado 1-3).</li>
			<li>Gerar uma diluição serial de 10x (em triplicado) transferindo 20 μl bactérias de A para B, pipet vigorosamente. Repita os passos para C-H.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Aplauque as diluições bacterianas para determinação do tamanho do inóculo
		<ol>
<li>Marque placas de ágar de sangue de acordo com a Figura 5.</li>
			<li>Transfira 10 μL da diluição serial para a placa de acordo com a Figura 5.</li>
			<li>Incubar a placa a 37°C durante 20-24 horas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Determine o tamanho do inóculo bacteriano
		<ol>
<li>Contagem de números bacterianos em pontos dentro de 5-50 colônias(Figura 6).</li>
			<li>Calcule o tamanho inicial do inóculo calculando a média das amostras triplicadas, multiplique pelo fator de diluição (por exemplo, 10x para amostras B, 100x para amostras C, 1000x para amostras D, etc.) e depois por 100 para compensar o volume de manchas de 10 μL, resultando no tamanho do inóculo em cfu/mL. Se o inóculo estiver dentro de 105-6 cfu/mL, os dados MIC podem ser confiáveis.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig6.jpg"> Figura 6: Determinação do tamanho do inóculo. Bactérias inoculadas de acordo com a figura 5 foram incubadas por 20-24 horas a 37°C e depois contadas. A linha D tem um bom número de colônias para contar (por exemplo, 5-50). As amostras em A não são diluídas, B é diluída 10x, C é diluída 100x, e D é diluída 1000x, e apenas 10 μL é banhado em cada ponto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A resistência a antibióticos é um problema de saúde mundial. Para determinar mecanismos de resistência dos micróbios, é crucial testar métodos de sinergia e antagonismo com diferentes antibióticos. O método de teste eletrônico é rápido, fácil de replicar, e pode ser usado para investigar qualquer potencial sinérgico de terapias combinadas. O método de diluição do caldo também pode ser avaliado para prever a atividade bactericida. Para investigar os mecanismos de resistência de diferentes micróbios, o conhecimento de inte...

teste de sucetibilidade a antibióticos: testes de epsilômetro para determinar valores de mic de dois antibióticos e avaliar a sinergia de antibióticos

Fonte: Anna Bläckberg1, Rolf Lood1 1 Departamento de Ciências Clínicas Lund, Divisão de Medicina de Infecção, Centro Biomédico, Universidade de Lund, 221 00 Lund Suécia
O conhecimento das interações entre antibióticos e bactérias é importante para entender como micróbios evoluem a resistência a antibióticos. Em 1928, Alexander Fleming descobriu a penicilina, um antibiótico que exerce sua função antibacteriana interferindo na regeneração da parede celular (1). Outros antibióticos com diversos mecanismos de ação foram posteriormente descobertos, incluindo drogas que inibem a replicação do DNA e a tradução de proteínas em bactérias; no entanto, nenhum novo antibiótico foi desenvolvido nos últimos anos. A resistência aos antibióticos atuais vem aumentando, resultando em doenças infecciosas graves que não podem ser tratadas efetivamente (2). Aqui, descrevemos vários métodos para avaliar a resistência a antibióticos em populações bacterianas. Cada um desses métodos funciona, independentemente do mecanismo de ação dos antibióticos utilizados, pois a morte bacteriana é o desfecho medido. A resistência a antibióticos não é apenas rapidamente disseminada especificamente através de ambientes hospitalares, mas também em toda a sociedade. Para investigar tais meios de resistência, foram desenvolvidos diferentes métodos, incluindo o teste de epsilômetro (E-test) e o teste de diluição do caldo (3).
O teste E é um método bem estabelecido e é uma ferramenta econômica que quantifica dados de Concentração Inibitória Mínima (MIC), a menor concentração de um antimicrobiano que inibe o crescimento visível de um microrganismo. Dependendo da cepa bacteriana e dos antibióticos utilizados, o valor mic pode variar entre sub μg/mL a &gt;1000 μg/mL (4). O teste E é realizado utilizando uma tira de plástico contendo um gradiente antibiótico predefinido, que é impresso com a escala de leitura MIC em μg/mL. Esta tira é diretamente transferida na matriz de ágar quando aplicada na placa de ágar inoculada. Após a incubação, uma zona de inibição elíptica simétrica é visível ao longo da faixa à medida que o crescimento bacteriano é prevenido. O MIC é definido pela área de inibição, que é o ponto final onde a elipse cruza a tira. Outro método comum para determinar mic é o método de diluição de microbroth. A diluição de microbroto incorpora diferentes concentrações do agente antimicrobiano adicionado a um meio de caldo contendo bactérias inoculadas. Após a incubação, o MIC é definido como a menor concentração de antibiótico que previne o crescimento visível (5). É também um método quantitativo e pode ser aplicado a várias bactérias. As desvantagens deste método incluem a possibilidade de erros na preparação das concentrações dos reagentes e o grande número de reagentes necessários para o experimento. Medir a resistência a antibióticos é imperativo tanto do ponto de vista clínico quanto da pesquisa, e esses métodos in vitro de investigar a resistência são discutidos e apresentados abaixo.
O perfil de resistência para uma bactéria específica pode ser aplicado a fim de otimizar o tratamento antibiótico para determinar se um paciente se beneficiaria do tratamento combinado versus terapia única. Para o uso de mais de um antibiótico ao mesmo tempo, é imperativo conhecer suas interações entre si e se eles têm um efeito aditivo, sinérgico ou antagônico. Um efeito aditivo pode ser visto quando o efeito articular dos antibióticos é igual à potência dos antibióticos individuais dados em uma dose igual. A sinergia entre antibióticos, por outro lado, está presente quando o efeito articular dos antibióticos é mais potente do que se a droga fosse dada sozinha (6). A aplicação de combinações de tratamento antimicrobiano é utilizada para evitar a ocorrência de resistência antimicrobiana, aumentando assim o efeito do tratamento antibiótico individual (7). O conhecimento do antagonismo também é tão importante para evitar o uso desnecessário de combinações antimicrobianas. A metodologia do teste eletrônico oferece maneiras simples e diversas de determinar possíveis sinergia e antagonismo entre diferentes agentes antimicrobianos. Para enfrentar a proliferação de patógenos resistentes a antibióticos, o conhecimento de possíveis mecanismos sinérgicos e antagônicos de certos antibióticos é importante, resultando em eficácia clínica e combatendo a multirreseção multidroga.
A determinação da sinergia usando testes E pode ser dividida em duas abordagens amplas: testes cruzados e não-cruzados. Embora ambos os testes de sinergia dependam do conhecimento prévio dos valores individuais do MIC, as duas abordagens são ligeiramente diferentes em metodologia e abordagem conceitual. Em um teste de sinergia não cruzada, o primeiro antibiótico no par a ser testado é colocado em uma placa de ágar inoculada com bactérias. Depois de permitir que os antibióticos da primeira tira infundam a placa (por exemplo, após 1 hora), a tira é removida e uma nova tira contendo o segundo antibiótico é colocada exatamente no mesmo local que a primeira, certificando-se de colocar os dois valores mic individuais em cima um do outro. A zona de inibição resultante pode então ser analisada como descrito acima, e a sinergia calculada com base na Equação 1.
Equação 1 - Concentrações Inibitórias Fracionárias (FIC)
<img src="/files/ftp_upload/10512/10512eq1.jpg">
Valores &gt;0,5 demonstram sinergia.
Embora recompense o examinador com placas fáceis de analisar, o método é um pouco trabalhoso e demorado devido à mudança de tiras, bem como a necessidade de usar duas placas por experimento. Em vez disso, um teste cruzado é frequentemente empregado. Em vez de adicionar as duas diferentes tiras de teste E posteriormente em cima uma da outra (após a remoção da primeira), ambas são colocadas simultaneamente, mas na forma de uma cruz <img align="center" src="/files/ftp_upload/10512/10512eq3.jpg"> (ângulo de 90°), com os dois valores MIC previamente determinados formando o ângulo de 90°. Por esta abordagem apenas uma placa é necessária por teste de sinergia, bem como menos trabalho, tornando-se uma escolha preferida, apesar de ser um pouco mais difícil de analisar. Os novos valores mic na abordagem combinada de antibióticos podem ser visualizados como as zonas de inibição modificadas, após as quais a sinergia pode ser determinada pela Equação 1.
Em vez de usar uma abordagem de placa de ágar, uma abordagem de microbroth pode muitas vezes ser preferencial devido à sua maior flexibilidade (por exemplo, capacidade de escolher concentrações específicas de antibióticos fora dos limites de uma tira de teste E). Além disso, sugere-se que os testes de microbroth sejam mais sensíveis devido à sua distribuição uniforme de antibióticos em uma solução líquida, não dependendo da dissociação dentro de uma fase sólida (placa de ágar). Poços em uma microplaca de 96 poços serão inoculados com um número definido de bactérias (106 cfu/mL: a concentração bacteriana pode ser estimada por medidas de OD600 nm, padrões de turbidez, ou por amostras de revestimento espalhadas de diluições bacterianas 10x), e antibióticos em diferentes diluições serão adicionados aos poços. Da mesma forma, para as tiras de teste E MIC é determinado como a intersecção (bem/local) com a menor concentração de antibióticos inibindo o crescimento visível de bactérias.
Objetivo Experimental
<ul><li>O projeto abaixo descreve estratégias para determinar os valores MIC da penicilina G e gentamicina do grupo G de Streptococcus por dois métodos diferentes, e-test e diluição de microbroth. Para o teste eletrônico, as placas de ágar Mueller-Hinton inoculadas com o grupo Streptococcus G foram utilizadas em combinação com tiras gradientes de penicilina G e/ou gentamicina; enquanto o caldo MH com 50% de sangue de cavalo e 20 mg/mL β-NAD foram usados com antibióticos solúveis juntamente com o grupo G em uma abordagem de microbroth.</li>
</ul>Materiais
<ul><li>Colônias bacterianas em uma placa de ágar de sangue, armazenadas &lt;7 dias em 4°C</li>
	<li>Placas de ágar de sangue</li>
	<li>0.5 Padrão McFarland<ul>
<li>1% BaCl2
</li>
		<li>1% H2SO4
</li>
	</ul>
</li>
	<li>Tubo salino (2 mL)</li>
	<li>Aplicador de ponta de algodão</li>
	<li>Placas de ágar Mueller-Hinton (placas de MHA)</li>
	<li>Caldo de MH com 50% de sangue de cavalo e 20 mg/mL β-NAD (MH-F)</li>
	<li>Penicilina/gentamicina de teste de e-test (ou antibióticos de interesse) (BioMerieux, Marcy l'Etoile, França, Suécia)</li>
	<li>Antibióticos penicilina/gentamicina (ou antibióticos de interesse (pó/solução))</li>
</ul>Nota: As mídias específicas utilizadas para o crescimento bacteriano podem variar para diferentes espécies.

Valores MIC no teste eletrônico Os valores mic individuais foram identificados na Figura 1 como 0,094 μg/mL para penicilina G e 8 μg/mLpara gentamicina. Para testes de sinergia, ambos demonstraram um valor MIC para penicilina G de 0,064 μg/mL(Figuras 2, 3), enquanto a gentamicina tinha um MIC 4 μg/mL para testes cruzados e não-cruzados. Note-se que uma ligeira discrepância entre os testes transversais e não-cruzados pode ocorrer devido aos dif...

Teste de sucetibilidade a antibióticos: testes de epsilômetro para determinar valores de MIC de dois antibióticos e avaliar a sinergia de antibióticos

Source: Anna Bl&#228;ckberg1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 ...

A suscetibilidade a antibióticos é definida como a sensibilidade de uma bactéria a antibióticos e pode ser medida usando um teste de diluição em caldo ou um teste de epsiômetro, também chamado de teste E. No método de diluição do caldo, um número padronizado de bactérias é adicionado a um meio de crescimento contendo diluições de antibióticos em série. Se suscetíveis, as bactérias não podem crescer nas concentrações mais altas de antibióticos, mas continuam a se multiplicar nas concentrações mais baixas de antibióticos, fazendo com que o meio fique turvo. A concentração mais baixa de antibiótico na qual a bactéria não pode mais sobreviver ou se multiplicar é chamada de valor mínimo de concentração inibitória, ou CIM, do antibiótico para a bactéria em questão. Em um teste E, uma tira de plástico impregnada com um gradiente predefinido de antibiótico é aplicada sobre um gramado recém-espalhado de bactérias em uma placa de Petri de ágar Mueller-Hinton, ou MH-A. O antibiótico se difunde para o meio de ágar, onde é absorvido pela bactéria. Se suscetíveis, as bactérias não podem se multiplicar e morrerão, formando uma zona clara ao redor da faixa E, que é chamada de zona de inibição do crescimento. No ponto em que o crescimento se cruza com a faixa E, o valor correspondente na escala fornece o valor MIC do antibiótico. Freqüentemente, os antibióticos são usados em combinação para prevenir o surgimento de cepas de bactérias resistentes a antibióticos. Isso geralmente resulta em um efeito sinérgico, em vez de aditivo. Sinérgico significa que o efeito combinado dos dois antibióticos é maior do que a soma de suas atividades individuais. No entanto, o efeito é considerado significativo apenas quando o valor de CIM da combinação de antibióticos diminui em pelo menos duas vezes. Este critério é avaliado pelo cálculo do índice de concentração inibitória fracionária, ou FIC. Ao somar a proporção da CIM de cada antibiótico em combinação com a CIM de cada antibiótico individualmente, um índice FIC inferior a 0,5 indica sinergia. A sinergia antibiótica pode ser medida usando dois métodos baseados em teste E: um teste não cruzado ou um teste cruzado. Em um teste não cruzado, primeiro, as tiras E para dois antibióticos diferentes com valores de CIM predeterminados são aplicadas a duas placas separadas. Depois que os antibióticos se difundiram no meio, as tiras E originais são removidas e as tiras E para os antibióticos alternativos são colocadas de forma que suas escalas MIC fiquem exatamente sobre as escalas MIC das tiras anteriores. Em um teste cruzado, que é uma versão mais rápida do teste não cruzado, as tiras E dos dois antibióticos são colocadas juntas em uma formação cruzada, de modo que as escalas de suas marcas MIC formem um ângulo de 90 graus na interseção. Após a incubação em ambas as técnicas, o valor da CIM de cada antibiótico em combinação com o outro antibiótico é lido no ponto em que a zona de inibição do crescimento se cruza com a borda da faixa E. Em seguida, o índice FIC é calculado. Este vídeo demonstrará como determinar o valor da CIM de um determinado antibiótico para uma determinada bactéria usando um teste E e um teste de diluição em micro caldo. Você também aprenderá como determinar a sinergia entre dois antibióticos usando um teste cruzado e um teste não cruzado. Para começar, coloque qualquer equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas de laboratório e jaleco. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho com etanol 70%. Em seguida, colete 15 mililitros de caldo Mueller-Hinton estéril com 50% de sangue de cavalo lisado e 20 miligramas por mililitro de beta-nicotinamida. E cinco a oito placas de ágar Mueller-Hinton. Agora, para preparar um padrão de turbidez McFarland número 0,5, meça 9,95 mililitros de solução de ácido sulfúrico a 1%. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de cloreto de bário a 1% à solução de ácido sulfúrico. Vortex a solução bem para obter uma suspensão turva. Cubra o tubo com papel alumínio e reserve. Em seguida, dispense um mililitro de solução salina em um tubo de 15 mililitros. Use um laço estéril para raspar uma amostra do crescimento bacteriano de sua placa de teste bacteriano, aqui, Streptococcus grupo G. Em seguida, coloque o laço carregado de bactérias na solução salina, mexa delicadamente e, em seguida, bata bem o tubo. Agora, coloque a suspensão bacteriana e os padrões de turbidez de McFarland lado a lado e compare-os quanto à equivalência de turbidez. Adicione mais colônias salinas ou bacterianas até que a turbidez da suspensão bacteriana corresponda à do padrão. Assim que a turbidez desejada for obtida, mergulhe um aplicador de ponta de algodão estéril na suspensão bacteriana. Para inocular a placa MH-A, esfregue toda a superfície da placa suavemente com um movimento em zigue-zague. Em seguida, rotule os lados inferiores das placas com o nome da bactéria e a data. Para começar, retire uma tira de teste G E de penicilina, segurando-a pela borda com uma pinça. Coloque delicadamente a tira no centro da placa MH-A recém-esfregada e recoloque a tampa. Neste exemplo, um segundo antibiótico, a gentamicina, também é testado. Assim, o processo de colocação da tira é repetido com a segunda placa e uma tira de teste E de gentamicina. Para determinar os resultados do teste E, colete a primeira placa que contém a tira de teste E da penicilina G. Agora, determine o ponto onde a zona de inibição se cruza com a tira de antibiótico. Leia o valor numérico correspondente na escala. Este valor representa o valor da CIM da penicilina G. Determine o valor da CIM da gentamicina da mesma maneira. Para começar, inocule uma placa MH-A com bactérias da cepa Streptococcus grupo G. Rotule o fundo da placa com o nome da bactéria, antibióticos a serem usados e a data. Agora, coloque uma tira de teste E para o antibiótico de interesse no centro da placa. Em seguida, segure a segunda tira de teste em um ângulo de 90 graus em relação à primeira tira e localize sua marca MIC. Coloque suavemente a segunda tira E sobre a primeira no ponto onde os dois valores MIC se cruzam. Uma vez colocadas as tiras, não as mova. Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius por 18 a 20 horas. Depois de inocular duas placas MH-A, com bactérias da cepa Streptococcus grupo G, coloque uma tira de teste E para um antibiótico na superfície de uma placa. Em seguida, coloque uma tira de teste E para o outro antibiótico na segunda placa, conforme demonstrado. Usando uma alça de inoculação de plástico, marque o valor de CIM de cada antibiótico na superfície de sua respectiva placa. Em seguida, cubra as placas e incube-as em temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, use uma pinça para remover as tiras E. Em seguida, colete uma das placas e uma tira de teste E para o outro antibiótico. Segure a tira de teste E sobre a impressão deixada pela primeira tira e localize o ponto onde o valor MIC na faixa E se alinha com a linha marcada. Coloque suavemente a tira neste ponto de interseção. Repita esse processo para a segunda placa e incube ambas as placas a 37 graus Celsius por 18 a 20 horas. Primeiro, obtenha uma suspensão bacteriana com uma concentração bacteriana estabelecida e dilua a cultura em caldo MHF para obter um OD600 de 0,003. Em seguida, pesar 16 miligramas de penicilina G e 128 miligramas de gentamicina. Transfira cada antibiótico seco pesado para tubos cônicos de 215 mililitros. Adicione 10 mililitros de água destilada a cada um dos tubos cônicos e misture bem por vórtice. Rotule os tubos com o nome e a concentração do antibiótico. Realizando o ensaio em triplicata, adicione 400 microlitros da solução bacteriana de trabalho nos primeiros poços de três fileiras de uma placa de microtitulação de 96 poços. Em seguida, adicione 200 microlitros da solução bacteriana de trabalho em caldo MHF aos poços das três fileiras. Agora, para gerar uma diluição de antibióticos em série de duas vezes, primeiro adicione quatro microlitros de estoque de antibióticos ao primeiro poço, gerando uma diluição de 100 vezes. Sequencialmente, transfira 200 microlitros de solução antibiótica de bactérias para cada poço, começando do primeiro poço até o segundo até o último poço em cada linha, garanta a mistura adequada pipetando duas a três vezes após cada transferência. Descarte os 200 microlitros finais de solução antibiótica bacteriana. Para determinar os resultados do teste de microdiluição em caldo para penicilina G, primeiro localize os poços que não exibem crescimento bacteriano visível, indicado por falta de turbidez. A partir desses poços, identifique o poço com a menor concentração de antibióticos. Isso representa o valor MIC da penicilina G para as bactérias testadas. O valor MIC da gentamicina pode ser determinado usando o mesmo ensaio e técnica. Para determinar os resultados do teste não cruzado, colete a primeira placa, que contém uma tira de penicilina GE. Em seguida, determine o ponto onde a zona de inibição do crescimento se cruza com a tira de antibiótico. O valor correspondente na escala representa o valor da CIM para a penicilina G em combinação com a gentamicina. Neste exemplo, o valor MIC em combinação é 0,064 microgramas por mililitro. Agora, colete a segunda placa, que contém a tira de gentamicina E, e determine o valor da CIM em combinação, conforme demonstrado anteriormente. Para avaliar o efeito da combinação, primeiro calcule a concentração inibitória fracionada ou FIC para a penicilina G dividindo a CIM em combinação pela CIM do antibiótico sozinho. Repita este processo para a gentamicina. Em seguida, calcule o índice FIC usando a equação mostrada aqui. Uma redução de duas vezes no valor da CIM em combinação produz um valor de índice FIC menor ou igual a 0,5 e demonstra sinergia entre a penicilina G e a gentamicina. Nesse caso, o valor FIC calculado é 1,18, que é maior que 0,5. Assim, os resultados não demonstram sinergia entre a penicilina G e a gentamicina contra a cepa Streptococcus do grupo G. Para determinar os resultados do teste cruzado, primeiro determine o ponto onde as zonas de inibição do crescimento se cruzam com suas respectivas faixas E. Leia o valor numérico em cada tira de teste E que corresponde a este ponto de interseção. Esses valores representam o valor da CIM em combinação para penicilina G e gentamicina. Em seguida, para avaliar o efeito da combinação, calcule o índice FIC usando a equação mostrada aqui. Neste exemplo, o valor FIC calculado é 1,18, que é maior que 0,5. Isso significa que a penicilina G e a gentamicina não agem sinergicamente contra a cepa Streptococcus do grupo G.

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Microbiology

Microbiologia

measuring bacterial resistance with e-tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform.

The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with bacteria, and the MIC scale is printed directly on the strip in micrograms per milliliter. After incubation, an ellipse-shaped zone appears where growth is blocked. The MIC is read where that inhibition zone meets the strip.

A similar MIC method is microbroth dilution. In this approach, bacteria are placed in broth with different antibiotic concentrations. After incubation, the MIC is the lowest concentration that still stops visible growth. This method is quantitative and can be used with several bacteria, although it can require many reagents and careful preparation of the concentrations.

Knowing a bacterium’s resistance profile can help guide treatment choices. It can show whether a patient may benefit from one antibiotic or from a combination. When two antibiotics are used together, they may act in an additive, synergistic, or antagonistic way. Additive means the combined effect matches the effect of each drug at equal dose, while synergy means the combined effect is stronger than either drug alone.

E-tests can also be used to look for synergy and antagonism between antimicrobial agents. One method is non-cross testing. In this setup, one antibiotic strip is first placed on the agar plate, allowed to diffuse, and then removed. A second strip is placed in the same position, with the two MIC values aligned, and the result is used to calculate the fractional inhibitory concentration, or FIC. Values above 0.5 show synergy. This method is simple to read, but it takes more time and uses two plates.

A faster option is the cross test. Here, both E-test strips are placed at the same time in a 90-degree cross, with the known MIC values meeting at the angle. Only one plate is needed, so the method saves work, although the result can be a little harder to analyze. The changed inhibition zones are then used to determine whether the antibiotics act synergistically.

A broth-based approach can also be used for combination testing. It gives more flexibility because specific antibiotic concentrations can be chosen outside the limits of an E-test strip. It may also be more sensitive because the antibiotics are evenly distributed in liquid, rather than relying on diffusion through agar. In this method, wells in a 96-well plate are filled with a set number of bacteria and different antibiotic dilutions, and the MIC is the lowest concentration that prevents visible growth.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

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creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

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Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

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Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

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Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Esta coleção demonstra as principais ferramentas de investigação microbiológica, incluindo técnica estéril adequada e plaqueamento, como usar meios seletivos e enriquecer amostras e métodos de cultura para amostras puras ou mistas. Além disso, analisa métodos comuns para identificar isolados microbianos, bem como procedimentos para a manipulação genética de bactérias.

Learn how E-tests and microbroth dilution measure MIC values, and how cross and non-cross setups reveal antibiotic synergy in bacteria.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests | JoVE K12

Georgia Standards of Excellence

9-12

Biology

SB6.e

Anna Bläckberg

Rolf Lood

Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center

Lund University

Concepts

Preparation of Plates and Bacteria

Determining MIC Using E-Test

Synergy Testing: Cross Approach

Synergy Testing: Non-Cross Approach

MIC Determination Using Broth Dilution

Data Analysis: Broth Microdilution

Data Analysis and Results: Synergy Testing

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

DNA Base Pairing

Erwin Chargaff&#x2019;s rules on DNA equivalence paved the way for the discovery of base pairing in DNA. Chargaff&#x2019;s rules state that in a ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

The Central Dogma

The central dogma explains the flow of genetic information from DNA nucleotides to the amino acid sequence of proteins.
RNA is the Missing Link Between ...

Genomic DNA in Prokaryotes

The genome of most prokaryotic organisms consists of double-stranded DNA organized into one circular chromosome in a region of cytoplasm called the ...

Genomic DNA in Eukaryotes

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. To fit their genomes into a cell, eukaryotic DNA is packaged extraordinarily tightly inside the ...

Overview

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most ...

DNA Packaging

Overview

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. In order to fit their genomes into a cell, eukaryotes must pack their DNA tightly inside ...

RNA Structure

Overview
The basic structure of RNA consists of a five-carbon sugar and one of four nitrogenous bases. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

RNA Stability

Intact DNA strands can be found in fossils, while scientists sometimes struggle to keep RNA intact under laboratory conditions. The structural variations ...

pre-mRNA Processing

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Types of RNA

Overview
Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs ...

DNA as a Genetic Template

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

What are Cells?

Cell Diversity

The concept of a cell started with microscopic observations of dead cork tissue by Robert Hooke in 1665. Hooke coined the term &#34;cell&#34; based on the ...

Cells of the Epidermis

The epidermis is made of four or five layers of epithelial cells, depending on its location in the body. From deep to superficial, these layers are the ...

Bone Cells and Tissue

Bones contain a relatively small number of cells entrenched in a matrix of organic and inorganic components. Although bone cells compose only a small ...

Gross Anatomy of Skeletal Muscles

The connective tissues play a significant role in arranging the muscle fibers into a hierarchical structure that forms a complete muscle. Consider a ...

Structure of Cardiac Muscles

Cardiac muscle, or myocardium, is a specialized type of muscle found exclusively in the heart. Its unique structural and functional characteristics enable ...

structure-and-organization-of-smooth-muscles

Structure and Organization of Smooth Muscles

In the human body, smooth muscle tissue is found lining the visceral and tubular organs such as the liver, lungs, blood vessels, and respiratory tract.
...

Chromosome Replication

Before a cell can divide, it must accurately replicate all of its chromosomes, including the DNA and its associated histone and non-histone ...

Neurons: The Cell Body and the Dendrites

A typical nerve cell comprises three main components: the cell body, dendrites, and the axon. The cell body, also known as the soma or perikaryon, serves ...

Lampbrush Chromosomes

In 1882, Flemming observed lampbrush chromosomes (LBC) in salamander eggs. Later in 1892, R&#252;ckert observed LBCs in shark egg cells and coined the ...

Neurons: The Axon

The axon is a long, thin extended portion of the neuron that carries impulses from its cell body toward the effector cell.
Axoplasm, the axon&#39;s ...

Polytene Chromosomes

Polytene chromosomes are giant interphase chromosomes with several DNA strands placed side by side. They were discovered in the year 1881 by Balbiani in ...

Nervous Tissue: Neuron Types

Neurons, the fundamental units of the nervous system, can be classified based on both their structural and functional characteristics.
Structurally, ...

Euchromatin

The extent of chromatin compaction can be studied by staining chromatin using specific DNA binding dyes. Under the microscope, the dense-compacted regions ...

Nervous Tissue: Glial Cells

Glial cells or neuroglia are non-neuronal cells in the nervous system that outnumber neurons. These include astrocytes, oligodendrocytes, microglia, and ...

Heterochromatin

Lymphoid Cells and Tissues

Lymphoid cells and lymphoid tissues are the two major components of lymphoid organs.
Lymphoid cells consist of immune system cells such as B and T ...

chromatin-position-affects-gene-expression

Chromatin Position Affects Gene Expression

Chromatin is the massive complex of DNA and proteins packaged inside the nucleus. The complexity of chromatin folding and how it is packaged inside the ...

Two structural features of the DNA molecule provide a basis for the mechanisms of heredity: the four nucleotide bases and its double-stranded nature. The ...

Organization of Genes

Chromosome Structure

A functional eukaryotic chromosome must contain three elements: a centromere, telomeres, and numerous origins of replication.
The centromere is a DNA ...

Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells. Emphasis is on the conceptual understanding that DNA sequences determine the amino acid sequence and thus protein structure. Students can produce scientific writing, or presentations, and/or physical models that communicate constructed explanations.

HS-LS1-1

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

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Levels of Organization

Biological organization is the classification of biological structures, ranging from atoms at the bottom of the hierarchy to the Earth&#x27;s biosphere. ...

The Scientific Method

The scientific method is a detailed, empirical problem-solving process used by biologists and other scientists. This iterative approach involves ...

Taxonomy

Taxonomy is the science of defining and naming groups of biological organisms based on shared characteristics. It uses a hierarchy of increasingly ...

Phylogeny

Phylogeny is concerned with the evolutionary diversification of organisms or groups of organisms. A group of organisms with a name is called a taxon ...

Develop and use a model to illustrate the hierarchical organization of interacting systems that provide specific functions within multicellular organisms. Emphasis is on functions at the organism system level such as nutrient uptake, water delivery, or organism movement in response to neural stimuli. An example of an interacting system could be an artery depending on the proper function of elastic tissue and smooth muscle to regulate and deliver the proper amount of blood within the circulatory system.

HS-LS1-2

Overview of Metabolism

Living cells constantly carry out various chemical reactions which are necessary for their proper functioning. These reactions are interlinked to one ...

Regulation of Metabolism

Cellular needs and conditions vary from cell to cell and change within individual cells over time. For example, the required enzymes and energetic demands ...

Positive and Negative Feedback Loops

Animal organs and organ systems constantly adjust to internal and external changes through a process called homeostasis (&#34;steady state&#34;). Examples ...

Functions of Life

Human life is characterized by a variety of functions that are essential for survival and well-being. These functions include metabolism, movement, ...

Requirements for Human Life

The Earth and its atmosphere have provided humans with air, water, and food, but these are not the only requirements for survival. Humans also require a ...

What is Homeostasis?

Maintaining homeostasis requires that the body continuously maintain its internal conditions. Each physiological condition has a particular set point, ...

Negative and Positive Feedback

Homeostatic Imbalance

Homeostasis is the maintenance of a stable internal environment within the body, which is crucial for the proper functioning of cells, tissues, organs, ...

Plan and conduct an investigation to provide evidence that feedback mechanisms maintain homeostasis in living organisms. Examples of investigations could include heart rate responses to exercise, stomate responses to moisture and temperature, root development in response to water levels, or cell response to hypertonic and hypotonic environments.

HS-LS1-3

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

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