Name: calcium chloride dna uptake in e. coli
Uploaded: 2023-04-30T07:10:31.000Z
Duration: 10 min 54 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

Este protocolo descreve a preparação e transformação do competente E. coli DH5α utilizando uma adaptação do procedimento de cloreto de cálcio (12).
1. Configuração
<ol><li>
Equipamento
	<ul>
<li>Espectrofotômetro</li>
		<li>Centrífuga de Sorval (ou equivalente)</li>
		<li>Centrífuga benchtop</li>
		<li>Bloco de calor ou banho de água</li>
		<li>Orbital Shaker</li>
		<li>Incubadora Estacionária</li>
		<li>Bandeja de fundição de gel</li>
		<li>Bem pentes</li>
		<li>Fonte de tensão</li>
		<li>Caixa de gel</li>
		<li>Fonte de luz UV</li>
		<li>Microondas</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Soluções e reagentes
	<ul>
<li>Caldo luria-bertani (LB) (10 g de hidrolise enzimática de caixa, extrato de levedura de 5 g e cloreto de sódio de 5 g em 1000 mL de H2O)</li>
		<li>Caldo super ideal com repressão catabólica (SOC): (2% (w/v) triptona, extrato de levedura de 0,5% (w/v), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2,10 mM MgSO4e 20 mM de glicose)</li>
		<li>CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) solução.</li>
		<li>Solução M CaCl2 (se as células serão transformadas imediatamente) ou solução de 0,1M CaCl2 contendo 10% (v/v) glicerol (se as células serão congeladas para uso futuro).</li>
		<li>Placas de ágar LB</li>
		<li>Placas seletivas de ágar LB (para este experimento, uma vez que o plasmid usou resistência à ampicilina, foram utilizadas placas de ágar LB contendo ampicillin 100 μg/mL)</li>
		<li>
E. coli Tensão DH5α</li>
		<li>DNA plasmid pUC19 (100 pg/ μl)</li>
		<li>QiAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)</li>
		<li>
Hind Enzima de restrição III</li>
		<li>1 kb mais escada de DNA</li>
		<li>Ponto de fusão baixo Agarose</li>
		<li>Tampão TAE 1X (Base Tris de 40 mM, ácido acético de 20 mM e 1mM EDTA)</li>
		<li>Brometo de ethidium (10mg/mL)</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Notas gerais de segurança E. coli DH5α é classificado como Biossegurança Nível 1 (BSL1). Micróbios nesta categoria representam pouca ou nenhuma ameaça de infecção em adultos saudáveis. No entanto, é necessária uma manipulação cuidadosa do microrganismo.</li>
</ol>IMPORTANTE todas as etapas deste protocolo precisam ser realizadas utilizando técnicas assépticas e em temperaturas de gelo ou 4°C, a menos que indicado.
2. Protocolo
<ol><li>A partir de um estoque congelado de E. coli DH5α (congelado em 20% de glicerol de uma cultura durante a noite cultivada em LB) listram bactérias para isolamento em uma placa de ágar LB. Incubar a 37°C durante a noite (16-20 horas).</li>
	<li>Inocular uma única colônia em 3 mL de caldo LB em um tubo. Cresça tremendo a 210 rpm a 37°C durante a noite (16-20 horas).</li>
	<li>Meça o OD600 da cultura da noite para o dia. Use a cultura da noite para inocular 100 mL de caldo LB em um frasco de 1 litro para um OD600 =0,01. Incubar a cultura tremendo vigorosamente (210 rpm) a 37°C monitorando OD600 no espectrofotômetro a cada 15-20 min, até que a cultura atinja OD600=0,35 (aproximadamente 3 horas). NOTA: Para que a transformação seja eficiente, as células bacterianas precisam estar em fase de crescimento exponencial médio. O número máximo de células precisa ser de 108 células/mL, o que para a maioria das cepas de E. coli corresponde a OD600 =0,4. O uso do espectrômetro permite medir o OD600, que permite determinar que as células estão no estágio de crescimento adequado. Se este protocolo for usado para outras cepas de bactérias, a calibração para determinar o número de colônias formando unidades em valores específicos de OD600 será necessária para determinar essa correlação.</li>
	<li>Transfira os 50 mL da cultura para cada uma das 2 garrafas de centrífugas de polipropileno geladas. Coloque as garrafas no gelo por 20 minutos para esfriar.</li>
	<li>Recupere as células por centrifugação a 2700g (4100 rpm em um rotor Sorval GSA) por 10 min a 4°C.</li>
	<li>Remova o supernatante. Escorra os últimos traços da mídia colocando a garrafa de cabeça para baixo em um bloco ou papel toalha.</li>
	<li>Resuspenda cada pelota bacteriana em 30 mL de uma solução gelada CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) solução gelada. Primeiro adicione 5 mL da solução, gire cuidadosamente até que a pelota tenha dissolvido completamente e, em seguida, adicione os 25 mL restantes da solução.</li>
	<li>Repita o passo 2.4.</li>
	<li>Repita o passo 2.5.</li>
	<li>Se as células competentes forem diretamente transformadas, resuspenncie cada pelota bacteriana em 2 mL de uma solução gelada cacl2 (0,1 M) girando os tubos cuidadosamente. Se a pelota não ficar ressuspendida com este método, resuspend por tubos suavemente para cima e para baixo (evitando a formação de bolhas). Alternativamente, as células competentes podem ser congeladas e armazenadas para uso posterior. Para preparar estoques congelados de células competentes, resuspense a pelota em 2 ml de uma solução 0.1M CaCl2 contendo 10% (v/v) glicerol. Esta solução precisa ser gelada. Suspensão de células de aliquot em tubos de polipropileno gelado de 1,5 mL (160 μl por tubo). Congele as células competentes imediatamente em um banho seco de gelo/etanol. Transfira os tubos para um congelador de -70°C.</li>
	<li>Para transformar as células tratadas com CaCl2,transfira 50 μl de células competentes para cada um dos tubos de polipropileno de 2,5 ml. Adicione os 1 μl (100 pg) de DNA plasmídeo pUC19 a um dos tubos e deixe o segundo tubo sem DNA (controle negativo). Misture suavemente (evite a formação de bolhas). Incubar por 30 minutos no gelo. NOTA: Não mais de 50 ng de DNA em um volume de 10 μL ou menos deve ser usado na transformação.</li>
	<li>Transfira os tubos para o bloco de calor e incubar a 42°C por 45 s exatamente. NOTA: O choque térmico é um passo crítico. Não exceda a temperatura ou o tempo de incubação.</li>
	<li>Transferência prontamente de tubos para gelo. Incubar por 2 min.</li>
	<li>Adicione 950 μL de mídia SOC e incubar os tubos por 1 hora a 37°C para permitir que as bactérias se recuperem e expressem o marcador resistente a antibióticos codificado no plasmídeo.</li>
	<li>Diluir 10 μL da suspensão celular em 1000 μL em SOC (diluição de 1/100) e 100 μL da suspensão celular em 1000 μL em SOC (diluição de 1/10). Placa 100 μl das diluições, bem como o controle, em placas seletivas, e espalhar usando uma espátula. Normalmente, o revestimento de 100 μL de uma diluição de 1/100 e 1/10 produzirá número suficiente de unidades formadoras de colônias (cfu) por placa. Idealmente, esse número deve variar entre 30-300 cfu para que haja colônias suficientes, mas separadas umas das outras. No entanto, o número de cfu dependerá da eficiência de transformação (ver Seção de Análise de Dados e Resultados).</li>
	<li>Incubar as placas a 37°C. Colônias transformadas devem aparecer em 12-16 horas (essa faixa dependerá da cepa celular e método de seleção). Nenhuma colônia deve crescer no controle negativo.</li>
	<li>Conte a cfu/placa obtida para a transformação (Tabela 1).</li>
	<li>Para verificar se serão realizados os transformadores do plasmídeo pUC19, será realizada uma preparação plasmida e posterior digestão. Para isso, inocular uma única colônia em 3 ml de caldo LB em um tubo. Cresça tremendo a 210 rpm a 37°C durante a noite (16-20 horas).</li>
	<li>Prepare uma preparação plasmida usando o Kit Miniprep QIAprep Spin, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Digerir os 1 μg de pUC19 purificado com a enzima de restrição HindIII a 37°C por 1 hora. NOTA: Qualquer enzima que corte no local de clonagem múltipla pUC19 pode ser usada para esta etapa.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão de digestão de restrição de 10X</td>
			<td>2,5 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plasmid pUC19</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Hind III</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>20,5 μl (até 25 μl)</td>
		</tr>
</tbody></table><ol start="21"><li>Execute uma escada de peso molecular, DNA pUC19 digerido e a mesma quantidade de DNA pUC19 não digerido em um gel de 1% de agarose contendo 1 μg/mL brometo de etídio por 1 hora a 95 V. NOTA: o tempo e a tensão variam dependendo do equipamento utilizado.</li>
	<li>Visualize o gel sob a luz UV. Compare o tamanho do DNA pUC19 digerido e não digerido(Figura 2) (ver Seção de Análise de Dados e Resultados). Prossiga com as etapas necessárias para verificar a transformação de acordo com o objetivo de cada experimento de transformação em particular.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig2.jpg"> Figura 2: Digestão do DNA plasmídeo recuperado das células DH5α transformadas. O DNA plasmídeo foi recuperado de células DH5α transformadas, digeridas com HindIII, executadas em um gel de 1% de agarose e visualizadas com uma fonte UV (passos 2,19 a 2,22).
3. Análise e Resultados de Dados
Para calcular a eficiência da transformação, um indicador de quão bem as células ocuparam o DNA extracelular, as colônias obtidas na transformação precisam ser contadas:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Diluição</td>
			<td>Cfu</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/100</td>
			<td>34</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/10</td>
			<td>246</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Unidades formadoras de colônias (cfu) contaram a partir de experimento de transformação.
A eficiência de transformação (TE) é uma medida do número de cfu resultante da transformação de 1 μg de plasmídeo em um determinado volume de células competentes. Muitos parâmetros afetam a eficiência de transformação: tamanho plasmídeo, genótipo celular, estágio de crescimento durante a preparação de competências, métodos de transformação, etc.). Ao calcular o TE é importante considerar qual diluição (se houver) foi realizada antes do emplacamento e incorporá-la no cálculo do número total de cfu. A eficiência de transformação (TE) é calculada com a seguinte equação:
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq1.jpg">
Primeiro divida a cfu pelo μg de DNA, neste exemplo 0,0001μg. Em seguida, divida o resultado pelo fator de diluição. Neste exemplo, foi utilizada uma diluição de 1/10 e 100μL de uma solução de 1 ml (diluição: 1/10 × 100 μL /1000 μL=0,01).
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq2.jpg">

A transformação é um método poderoso para introduzir DNA exógeno em células bacterianas que é fundamental para muitas aplicações de biologia molecular em laboratório. Além disso, desempenha um papel importante na natureza ao permitir que as células bacterianas troquem material genético que poderia resultar em maior variação genética e permitir a aquisição de diferentes traços benéficos para a sobrevivência sob uma ampla gama de condições. Muitas cepas bacterianas codificam os genes necessários para a competência natural....

transformação de células de e. coli usando um protocolo adaptado de cloreto de cálcio

Fonte: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, e Victor J. DiRita1 1 Departamento de Microbiologia e Genética Molecular, Universidade Estadual de Michigan
As bactérias têm a capacidade de trocar material genético (Ácido Desoxiribonucleico, DNA) em um processo conhecido como transferência de genes horizontais. A incorporação do DNA exógeno fornece um mecanismo pelo qual as bactérias podem adquirir novos traços genéticos que lhes permitem adaptar-se às mudanças nas condições ambientais, como a presença de antibióticos ou anticorpos (1) ou moléculas encontradas em habitats naturais (2). Existem três mecanismos de transferência genética horizontal: transformação, transdução e conjugação (3). Aqui vamos focar na transformação, na capacidade das bactérias de tirar DNA livre do meio ambiente. Em laboratório, o processo de transformação tem quatro etapas gerais: 1) Preparação de células competentes, 2) Incubação de células competentes com DNA, 3) Recuperação de células e 4) Revestimento das células para crescimento dos transformadores (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig1.jpg"> Figura 1: Etapas gerais do processo de transformação. O processo de transformação tem quatro etapas gerais: 1) Preparação de células competentes, 2) Incubação com DNA, 3) Recuperação das células e 4) Células de chapeamento para crescimento dos transformadores.
Para que a transformação ocorra, a bactéria receptora deve estar em um estado conhecido como competência. Algumas bactérias têm a capacidade de se tornarem naturalmente competentes em resposta a certas condições ambientais. No entanto, muitas outras bactérias não se tornam competentes naturalmente, ou as condições para esse processo ainda são desconhecidas. A capacidade de introduzir DNA em bactérias tem uma gama de aplicações de pesquisa: gerar múltiplas cópias de uma molécula de DNA de interesse, expressar grande quantidade de proteínas, como componente em procedimentos de clonagem, entre outros. Devido ao valor da transformação para a biologia molecular, existem vários protocolos que visam tornar as células artificialmente competentes quando as condições de competência natural são desconhecidas. Dois métodos principais são utilizados para preparar células artificialmente competentes: 1) através do tratamento químico das células e 2) expondo as células a pulsos elétricos (eletroporação). O primeiro usa diferentes produtos químicos dependendo do procedimento para criar atração entre o DNA e a superfície celular, enquanto o segundo usa campos elétricos para gerar poros na membrana celular bacteriana através da qual moléculas de DNA podem entrar. A abordagem mais eficiente para a competência química é a incubação com cátions divalent, mais notavelmente cálcio (Ca2+) (4,5) Competência induzida por cálcio é o procedimento que será descrito aqui (6). Este método é usado principalmente para a transformação de bactérias Gram-negativas, e esse será o foco deste protocolo.
O procedimento de transformação química envolve uma série de etapas em que as células são expostas a ceações para induzir a competência química. Essas etapas são posteriormente seguidas por uma mudança de temperatura - choque térmico - que favorece a absorção de DNA estranho pela célula competente (7). Os envelopes de células bacterianas são carregados negativamente. Em bactérias gram-negativas como escherichia coli,a membrana externa é carregada negativamente devido à presença de lipopólise (LPS) (8). Isso resulta em repulsa das moléculas de DNA igualmente carregadas negativamente. Na indução de competência química, íons de cálcio carregados positivamente neutralizam essa repulsão de carga permitindo a absorção de DNA na superfície celular (9). O tratamento de cálcio e a incubação com DNA são feitos no gelo. Posteriormente, é realizada uma incubação a temperaturas mais altas (42°C), o choque térmico. Esse desequilíbrio de temperatura favorece ainda mais a absorção de DNA. As células bacterianas precisam estar na fase de crescimento exponencial médio para suportar o tratamento de choque térmico; em outros estágios de crescimento, as células bacterianas são muito sensíveis ao calor, resultando em perda de viabilidade, o que diminui significativamente a eficiência da transformação.
Diferentes fontes de DNA podem ser usadas para transformação. Tipicamente, plasmídeos, pequenas moléculas circulares de DNA de dupla laga, são usados para transformação na maioria dos procedimentos laboratoriais em E. coli. Para que os plasmídeos sejam mantidos na célula bacteriana após a transformação, eles precisam conter uma origem da replicação. Isso permite que eles sejam replicados na célula bacteriana independentemente do cromossomo bacteriano. Nem todas as células bacterianas são transformadas durante o procedimento de transformação. Assim, a transformação produz uma mistura de células transformadas e células não transformadas. Para distinguir entre essas duas populações, é utilizado um método de seleção para identificar as células que adquiriram o plasmídeo. Plasmídeos geralmente contêm marcadores selecionáveis, que são genes codificando um traço que confere uma vantagem para o crescimento (ou seja, resistência a um antibiótico ou químico ou resgate de uma auxotrofia de crescimento). Após a transformação, as células bacterianas são banhadas em mídias seletivas, o que só permite o crescimento das células transformadas. No caso de células transformadas com uma resistência plasmid conferenciando a um dado antibiótico, a mídia seletiva será a mídia de crescimento contendo esse antibiótico. Vários métodos diferentes podem ser usados para confirmar que as colônias cultivadas nas mídias seletivas são transformadores (ou seja, incorporaram o plasmídeo). Por exemplo, plasmídeos podem ser recuperados dessas células usando métodos de preparação plasmídeos (10) e digeridos para confirmar o tamanho plasmídeo. Alternativamente, a COLÔNIA PCR pode ser usada para confirmar a presença do plasmídeo de interesse (11).
O objetivo deste experimento é preparar células quimicamente competentes E. coli DH5α, utilizando uma adaptação do procedimento de cloreto de cálcio (12), e transformá-las com o pUC19 plasmídeo para determinar a eficiência da transformação. A cepa E. coli DH5α é uma cepa comumente usada em aplicações de biologia molecular. Devido ao seu genótipo, especificamente o recA1 e o endA1,esta cepa permite maior estabilidade da inserção e melhorar a qualidade do DNA plasmídeo nas preparações subsequentes. Uma vez que a eficiência de transformação diminui com o aumento do tamanho do DNA, o plasmídeo pUC19 foi usado neste protocolo por causa de seu pequeno tamanho (2686 bp) (ver https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html para um mapa vetorial). pUC19 confere resistência à ampicilina e, portanto, este foi o antibiótico utilizado para seleção.

Embora o TE dependa de muitos fatores, preparações celulares não comerciais e competentes, como esta, normalmente produzem de 10a 107 transformadores por micrograma de plasmídeos. Portanto, esta preparação, com um TE = 2,46 x 108 cfu/μg, rendeu um TE muito além da faixa esperada. Protocolos adicionais estão disponíveis para a fabricação de células supercompetente quando são necessárias maiores eficiências de transformação para uma determinada aplicação (<s...

Transformação de células de E. coli usando um protocolo adaptado de cloreto de cálcio

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

As bactérias são notavelmente adaptáveis e um mecanismo que facilita essa adaptação é sua capacidade de absorver moléculas externas de DNA. Um tipo de DNA que as bactérias podem absorver é chamado de plasmídeo, um pedaço circular de DNA que frequentemente contém informações úteis, como genes de resistência a antibióticos. O processo de modificação de bactérias por novas informações genéticas incorporadas de uma fonte externa é chamado de transformação. A transformação pode ser facilmente realizada em laboratório usando Escherichia coli ou E. coli. Para serem transformadas, as células de E. coli devem primeiro ser competentes, o que significa capazes de absorver moléculas de DNA de seu ambiente. O protocolo para conseguir isso é surpreendentemente simples, uma curta incubação das células em uma solução de cloreto de cálcio. Essa incubação faz com que as células se tornem permeáveis às moléculas de DNA. Depois que as células são peletizadas por centrifugação, o sobrenadante é removido. O DNA do plasmídeo agora é adicionado às células competentes. Depois de incubar as células com DNA, a mistura é brevemente aquecida a 42 graus Celsius, seguida de um rápido resfriamento no gelo. Esse choque térmico faz com que o DNA seja transferido através da parede e das membranas da célula. As células são então incubadas em meio fresco. Em seguida, as bactérias são colocadas a 37 graus para permitir que selem novamente suas membranas e expressem proteínas resistentes. As células que absorveram os plasmídeos copiarão fielmente o DNA e o passarão para sua progênie e expressarão quaisquer proteínas que possam ser codificadas por ele, incluindo mediadores de resistência a antibióticos. Esses genes de resistência podem ser usados como marcadores selecionáveis para identificar bactérias que foram transformadas com sucesso porque as células que não absorveram o plasmídeo não expressarão o produto do gene de resistência. Isso significa que quando as células são plaqueadas em um meio sólido que contém o antibiótico apropriado, apenas as células que absorveram o plasmídeo crescerão. A transformação das células em uma colônia em crescimento pode ser confirmada pela cultura dessas células em meio líquido durante a noite para aumentar o rendimento antes de extrair o DNA da amostra. Uma vez que o DNA é isolado, uma digestão diagnóstica da enzima de restrição pode ser realizada. Como as enzimas de restrição cortam o DNA em locais previsíveis, a execução dessas digestões em um gel deve mostrar um padrão previsível se o plasmídeo desejado for transformado com sucesso. Por exemplo, se pUC19 for preparado e cortado com a enzima de restrição HindIII, uma única banda de 2686 nucleotídeos deve ser vista no gel. Neste laboratório, você transformará a cepa DH-5 Alpha de E. coli com pUC19 e, em seguida, confirmará a transformação bem-sucedida por eletroforese em gel de DNA. Antes de iniciar o procedimento, coloque o equipamento de proteção individual adequado, incluindo jaleco e luvas. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho com etanol 70%. Agora, prepare células quimicamente competentes depositando uma alça cheia de bactérias em uma placa de ágar LB estéril e listrando as bactérias com uma nova alça. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, esterilize novamente a bancada com etanol a 70% e retire a placa da incubadora. Inocule uma única colônia bem isolada em 3 mililitros de caldo LB em um tubo com uma alça estéril. Em seguida, cultive a cultura a 37 graus Celsius durante a noite, com agitação a 210 RPM. No dia seguinte, medir a densidade óptica da cultura durante a noite com um espectrofotómetro. Em seguida, adicione 100 mililitros de caldo LB a um frasco de um litro e inocule-o com a cultura noturna a uma densidade óptica de 0. 01. Agora, incube a cultura a 37 graus Celsius com agitação e verifique o OD600 a cada 15 a 20 minutos até que a cultura atinja a fase de crescimento exponencial médio. Após aproximadamente três horas, transfira 50 mililitros da cultura para dois frascos de polipropileno gelados. Em seguida, coloque as garrafas de volta no gelo por 20 minutos para esfriar. Em seguida, recupere as células por centrifugação. Descarte os sobrenadantes e coloque os frascos de cabeça para baixo sobre uma toalha de papel. Em seguida, ressuspenda o pellet bacteriano em cinco mililitros de solução gelada de cloreto de cálcio e cloreto de magnésio e agite cuidadosamente até que o pellet se dissolva completamente. Em seguida, adicione mais 25 mililitros da solução ao pellet bacteriano dissolvido. Ressuspenda o outro pellet bacteriano conforme demonstrado anteriormente. Depois disso, repita a centrifugação e remova os sobrenadantes. Se as células competentes forem transformadas diretamente, ressuspenda cada pellet bacteriano em dois mililitros de uma solução gelada de cloreto de cálcio 0,1 molar, girando os tubos com cuidado. Para iniciar o procedimento de transformação, transfira 50 microlitros de células competentes para dois tubos de polipropileno de 1,5 mililitro rotulados. Em seguida, adicione um microlitro de DNA de plasmídeo pUC19 a um dos tubos. Misture delicadamente, evitando a formação de bolhas, e incube os dois tubos por 30 minutos no gelo. Após a incubação, transfira os tubos para um bloco de calor e incube a 42 graus Celsius por 45 segundos. Transfira imediatamente os tubos para o gelo e incube por dois minutos. Agora, adicione 950 microlitros de meio SOC a cada tubo e incube-os por uma hora a 37 graus Celsius para permitir que as bactérias se recuperem e expressem o marcador resistente a antibióticos codificado no plasmídeo. Para fazer uma diluição de 1 a 100, adicione 990 microlitros de meio SOC e 10 microlitros de suspensão celular a um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, faça uma diluição de 1 a 10 adicionando 900 microlitros de meio SOC e 100 microlitros de suspensão celular a um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, coloque 100 microlitros das suspensões de células diluídas e 100 microlitros do controle negativo, em placas seletivas separadas contendo ampicilina usando um espalhador e incube as placas a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Após a incubação, conte as unidades formadoras de colônias, ou UFCs, por placa, obtidas por transformação, e registre esses dados. Para verificar se os transformantes têm o plasmídeo pUC19, pegue uma única colônia bem isolada de uma placa com uma alça estéril e introduza-a em um tubo contendo 3 mililitros de caldo LB. Em seguida, incube a cultura a 37 graus Celsius com agitação, durante a noite. No dia seguinte, use um mini kit de preparação de DNA para isolar o DNA de 3 mililitros da cultura, de acordo com as instruções do fabricante. Depois de completar a mini preparação de DNA, digerir o 1 micrograma de pUC19 purificado com uma enzima de restrição a 37 graus Celsius por 1 hora. Agora, carregue 20 microlitros de uma escada de peso molecular, 1 micrograma de DNA de plasmídeo digerido e 1 micrograma de DNA de plasmídeo não digerido em poços consecutivos de um gel de agarose a 1% contendo 1 micrograma por mililitro de brometo de etídio. Em seguida, execute o gel por 1 hora a 95 volts. Por fim, visualize o gel com um iluminador UV. Neste experimento, células quimicamente competentes de E. coli DH5 Alpha foram preparadas usando uma adaptação do procedimento de cloreto de cálcio e, em seguida, transformadas com o plasmídeo pUC19 para determinar a eficiência da transformação. Para calcular a eficiência de transformação, use as contagens de UFC registradas para as diluições de 1 em 100 e 1 em 10, e quaisquer outras diluições com contagens de UFC entre 30 e 300. Primeiro, a contagem de UFC registrada, 246 neste exemplo, é dividida pela quantidade de DNA, 0,0001 microgramas aqui, que foi plaqueada. Em seguida, este número é dividido pelo factor de diluição utilizado para obter a eficiência de transformação em UFC por micrograma. Neste exemplo, uma diluição de 1 a 10 foi usada e 100 microlitros de uma solução de 1 mililitro foram plaqueados, dando um fator de diluição final de 0,01. Na faixa de plasmídeo não digerida, o DNA circular pode aparecer como duas ou três bandas diferentes de brilho variável. Isso ocorre porque o DNA circular e não cortado pode existir em vários estados de conformação diferentes, como superenrolado, círculo aberto ou mais linear, e cada um deles se move através do gel em taxas diferentes. A análise da digestão do DNA do plasmídeo recuperado indicou que o plasmídeo usado tem um tamanho esperado de DNA pUC19, 2.686 pares de bases.

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Biologia Avançada

Microbiology

Microbiologia

calcium chloride dna uptake in e. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency.

Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation. Transformation is the process in which bacteria take up free DNA from the environment. In the lab, it usually includes four steps: preparing competent cells, mixing cells with DNA, recovering the cells, and plating them so transformants can grow.

For transformation to occur, cells must be competent, which means they can take in DNA. Some bacteria become naturally competent under certain conditions. Others do not, or the conditions are not known. For that reason, scientists often make cells artificially competent. Two common approaches are chemical treatment and electroporation, which uses electric pulses to open pores in the cell membrane.

This protocol uses calcium ions, especially Ca2+, to create chemical competence. It is mainly used with Gram-negative bacteria. E. coli cells and their outer membrane carry negative charge, and DNA is also negatively charged. Calcium helps neutralize this repulsion so DNA can attach to the cell surface. The cells and DNA are kept on ice during this step, and then a heat shock at 42°C helps drive DNA into the cells.

The cells must be in mid-exponential growth phase before heat shock. At other growth stages, they are more sensitive to heat and may lose viability. That lowers transformation efficiency. The DNA used for transformation is usually a plasmid, which is a small circular double-stranded DNA molecule. To stay in the cell after transformation, the plasmid must have an origin of replication so it can copy itself independently of the bacterial chromosome.

Not every cell becomes transformed, so the result is a mix of transformed and non-transformed cells. To find the cells that received the plasmid, the procedure uses selection. Plasmids often carry selectable markers, such as antibiotic resistance genes or genes that rescue a growth need. After transformation, the cells are plated on selective media. In this case, the media contains ampicillin, which allows only the transformed cells to grow.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Esta coleção demonstra as principais ferramentas de investigação microbiológica, incluindo técnica estéril adequada e plaqueamento, como usar meios seletivos e enriquecer amostras e métodos de cultura para amostras puras ou mistas. Além disso, analisa métodos comuns para identificar isolados microbianos, bem como procedimentos para a manipulação genética de bactérias.

See how calcium chloride makes E. coli competent for DNA uptake, then use heat shock and ampicillin selection to identify transformants.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli | JoVE K12

Natalia Martin

Andrew J. Van Alst

Rhiannon M. LeVeque

Victor J. DiRita

Department of Microbiology and Molecular Genetics

Michigan State University

Concepts

Performing the Experiment

Results

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

Punnett Squares

Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

Monohybrid Crosses

Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

Mutation, Gene Flow, and Genetic Drift

In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

Explain how mutations in the DNA sequence may or may not result in phenotypic change. Explain how mutations in gametes may result in phenotypic changes in offspring.

SC.912.L.16.4

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

RNA Structure

The basic structure of RNA consists of a string of ribonucleotides attached by phosphodiester bonds. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

Types of RNA

Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

General Transcription Factors

Tissue-specific transcription factors contribute to diverse cellular functions in mammals. For example, the gene for beta globin, a major component of ...

RNA Polymerase II Accessory Proteins

Transcription Elongation Factors

pre-mrna-processing-modification-of-pre-mrna-ends

Pre-mRNA Processing: Modification of pre-mRNA Ends

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Pre-mRNA Processing: RNA Splicing

Transfer RNA Synthesis

Ribosomal RNA Synthesis

The Nucleolus

Additional Subnuclear Structures

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

Molecular Chaperones and Protein Folding

The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

Explain the basic processes of transcription and translation, and how they result in the expression of genes.

SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Bacterial Transformation

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards