Name: plasmid dna transfer in bacteria
Uploaded: 2019-01-29T11:04:45.000Z
Duration: 4 min 33 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

Bacterial Transformation

No início do século 20, um bacteriologista britânico chamado Frederick Griffith estava trabalhando com a bactéria causadora de pneumonia Streptococcus pneumoniae. Ele realizou um experimento simples usando duas cepas diferentes. Uma cepa é conhecida como cepa S por causa de uma cápsula protetora que faz com que as colônias ou aglomerados que ela forma pareçam lisas e também a torna virulenta ou prejudicial. A segunda foi a cepa R, uma versão da bactéria sem a cápsula protetora, dando às colônias uma aparência áspera e tornando-a não virulenta.

Primeiro, Griffith pegou algumas das bactérias da cepa S e as aqueceu, produzindo uma versão morta pelo calor da cepa S. Em seguida, ele reuniu alguns ratos e os dividiu em quatro grupos. Ele injetou no primeiro grupo a cepa S virulenta e o segundo com a cepa R não virulenta. Ele dosou o terceiro grupo com a cepa S morta pelo calor e, finalmente, combinou a cepa S morta pelo calor e a cepa R juntas, e injetou essa mistura no quarto grupo. Como esperado, os camundongos do primeiro grupo morreram e os do segundo e terceiro grupo sobreviveram. Mas, para surpresa de Griffith, os ratos do último grupo também morreram.

Quando ele publicou seu estudo em 1928, ele chamou esse misterioso processo de transformação, pois especulou a presença de um princípio transformador subjacente, que permitiu que a cepa anteriormente não virulenta se tornasse mortal. Mais tarde, em 1943, Avert, MacLeod e McCarty relataram que esse princípio transformador era provavelmente o ácido desoxirribonucléico, ou DNA, que agora sabemos ser o material de hereditariedade. Essencialmente, o que aconteceu no experimento de Griffith foi que, quando as bactérias foram combinadas, algum DNA vazou da cepa S morta pelo calor e para as células da cepa R, transformando essas bactérias não virulentas e passando as informações para fazer a cápsula protetora, transformando a cepa R em virulenta, agora capaz de matar os animais do quarto grupo.

Avançando para hoje, os cientistas desenvolveram uma maneira muito mais simples de estudar a transformação bacteriana, usando a bactéria E. coli e pequenos loops circulares de DNA chamados plasmídeos. Normalmente, o plasmídeo usado em experimentos de transformação inclui um gene para uma função especial, como resistência a antibióticos. E. coli são um excelente assunto para transformação porque podem exibir uma propriedade chamada competência, a capacidade de absorver DNA do ambiente. Essencialmente, isso significa que, sob certas condições ambientais, como um produto químico ou um choque elétrico ou térmico, a parede celular da E. coli pode se tornar temporariamente permeável e permitir a absorção de DNA do ambiente. Uma vez que o plasmídeo está dentro da E. coli, ele pode ficar no citoplasma de sua nova célula hospedeira e ser replicado e expresso ao longo de gerações ao lado do genoma, ou pode se incorporar totalmente ao genoma do hospedeiro. Se a bactéria perder o plasmídeo a qualquer momento, a célula também perderá sua resistência aos antibióticos e, portanto, os cientistas cultivam as bactérias em um meio contendo o antibiótico para garantir que os únicos sobreviventes sejam aqueles que contêm o plasmídeo de interesse.

Neste laboratório, você aprenderá como transformar células de E. coli com um plasmídeo contendo um gene de resistência a antibióticos, enquanto pratica técnicas microbiológicas estéreis.

transformação bacteriana

<h4>Fundo</h4>

No início doséculo 20, a pneumonia era responsável por uma grande parte das mortes por doenças infecciosas1. A fim de desenvolver uma vacina eficaz contra a pneumonia, Frederick Griffith começou a estudar duas cepas diferentes do Streptococcus pneumoniae: uma cepa não virulenta com aparência áspera (cepa R) e uma cepa virulenta com aparência lisa (cepa S) devido a uma cápsula externa de polissacarídeo2. Essa camada externa da bactéria da cepa S permitiu que elas resistissem ao sistema imunológico do hospedeiro, levando a uma doença com risco de vida. Quando Griffith injetou separadamente em camundongos bactérias mortas pelo calor de qualquer cepa, os camundongos sobreviveram. No entanto, quando ele injetou camundongos com uma combinação da cepa S morta pelo calor com a cepa R viva, os camundongos morreram2. Quando ele analisou as amostras obtidas de camundongos mortos injetados com a combinação, ele observou a presença de bactérias vivas da cepa S. Em 1928, Griffith observou que um processo de "transformação" deve ter ocorrido para transformar as bactérias não virulentas na cepa virulenta. Como a primeira descoberta conhecida da transformação bacteriana, sua descoberta abriu caminho para o desenvolvimento de uma ferramenta essencial na engenharia genética - a transformação3.

Transformação é a mudança genética em uma célula devido à ingestão de DNA do ambiente. No experimento de Griffith, o DNA que codifica o revestimento protetor de polissacarídeo das bactérias da cepa S não se decompôs com o choque térmico e foi introduzido na cepa R, permitindo que esta contornasse o sistema imunológico do camundongo. Embora esse processo ocorra constantemente na natureza entre organismos e até espécies diferentes, os cientistas transformam bactérias em ambientes de laboratório para fins de pesquisa4.

<h4>Transformação bacteriana usando plasmídeos</h4>

As bactérias são os organismos ideais para transformação, pois podem facilmente absorver material genético exógeno em seu genoma e amplificá-lo rapidamente3,5. Eles têm um cromossomo circular e vários pequenos pedaços circulares de DNA de fita dupla chamados plasmídeos dentro do citoplasma. Esses plasmídeos podem se replicar independentemente do DNA cromossômico e geralmente fornecem certos benefícios funcionais, como resistência a antibióticos6,7. Em seu ambiente natural, as bactérias sofrem "transformação bacteriana" ao absorver plasmídeos de outras bactérias em um processo chamado conjugação8. Além disso, quando se multiplicam, cada um de seus descendentes recebe uma cópia do novo plasmídeo.

Os plasmídeos usados para fins experimentais são chamados de vetores de plasmídeos. Em um ambiente de laboratório, os cientistas podem criar artificialmente "plasmídeos recombinantes" com aproximadamente 5.000 a 10.000 pares de bases de comprimento, inserindo fragmentos de DNA em um vetor de plasmídeo. Esses plasmídeos recombinantes geralmente têm certos componentes: uma origem de replicação (ORI), um gene de resistência a antibióticos, um local de clonagem múltipla, um promotor, um marcador de seleção e o gene de interesse. A origem da replicação é onde a replicação começa. O gene de resistência a antibióticos permite que as bactérias que absorvem o plasmídeo sobrevivam em placas na presença de um determinado antibiótico. Embora os plasmídeos sejam pedaços relativamente pequenos de DNA, os cientistas precisam tratar as células hospedeiras para permitir a penetração do plasmídeo através da membrana celular. Portanto, a eficiência da transformação está diretamente relacionada à porosidade da membrana hospedeira. Uma abordagem comum é dar choque térmico nas bactérias que foram tratadas com uma solução de cloreto de cálcio9. As bactérias que não incorporam o plasmídeo não se transformam e, portanto, não têm resistência para sobreviver na placa e serem visíveis. Os múltiplos locais de clonagem auxiliam na inserção do DNA, contendo locais para enzimas de restrição cortarem o plasmídeo onde o gene de interesse pode ser inserido e ligado. O promotor impulsiona a transcrição do gene de interesse. É marcado por um marcador, geralmente uma proteína fluorescente, como uma proteína fluorescente verde (GFP), ou pode ser um gene adicional de resistência a antibióticos. O gene de resistência a antibióticos e os outros marcadores de seleção nos ajudam a determinar se as bactérias coletadas contêm o plasmídeo de interesse.

<h4>Aplicativos</h4>

Métodos de transformação eficazes permitiram aos cientistas isolar e traçar o perfil de genes e produtos gênicos e levaram a muitos avanços nas ciências da vida e na medicina, como o desenvolvimento de medicamentos eficazes, geração de culturas geneticamente modificadas e ferramentas avançadas de diagnóstico10. Além disso, com os avanços tecnológicos, surgiram novos métodos de transformação. Por exemplo, a clonagem de gateway permite a inserção de vários fragmentos de DNA em diferentes vetores, bem como a transferência de sequências de DNA entre plasmídeos11. Além disso, as repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR)-Cas9 são uma técnica de edição de genes que modifica diretamente os nucleotídeos no genoma e não requer o uso de plasmídeos12. Após a transformação, os pesquisadores geralmente isolam e traçam o perfil do gene de interesse e seus produtos. Posteriormente, todo o processo de clonagem genética abriu um novo campo de manipulação genética. Graças à clonagem genética, os pesquisadores podem manipular bactérias para produzir grandes quantidades de proteínas humanas específicas, como a insulina, paratratar pacientes com diabetes. A clonagem também tem desempenhado uma grande importância na agricultura moderna. Os organismos geneticamente modificados (OGM) são resultado direto da clonagem genética e da transformação bacteriana10. Por exemplo, os cientistas estão trabalhando para gerar culturas geneticamente modificadas com genes fixadores de nitrogênio incorporados em seu genoma para aumentar a produção de alimentos e reduzir o uso de fertilizantes, diminuindo assim o impacto econômico e ambiental dos fertilizantes. Em suma, a transformação bacteriana é o primeiro passo da biotecnologia moderna e a base de futuras descobertas de pesquisa.

<h4>Referências</h4>

<ol class="referências">
	<li>GL, Armstrong, LA, Conn e RW, Pinner. Tendências na mortalidade por doenças infecciosas nos Estados Unidos durante o século 20. Jama. 1999, Vol. 281, 1 (61-66).</li>
	<li>F, Griffith. O significado dos tipos pneumocócicos. J Hyg (Londres). . 1928, 2 (113-59).</li>
	<li>Lorenz, MG e Wackernagel, F. Transferência de genes bacterianos por transformação genética natural no meio ambiente. Microbiol Rev. . Setembro de 1994, Vol. 58, 3: (563-602).</li>
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	<li>Dubnau, D. Captação de DNA em bactérias. Annu Rev Microbiol. . 1999, 53: (217-44).</li>
	<li>Solar, G del, et al. Replicação e controle de plasmídeos bacterianos circulares. Microbiol Mol Biol Rev. . 1998, Vol. 62, 2: (434-64).</li>
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	<li>Khan, S, et al. Papel da tecnologia de DNA recombinante para melhorar a vida. I. nt J Genômica. . 2016, 2016:2405954.</li>
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</ol>

Transformação bacteriana

Fundo

No início do século 20, a pneumonia era responsável por grande parte das mortes por doenças infecciosas1. A fim de desenvolver uma vacina eficaz ...

Education

JoVE Lab Manual

Biology

Biologia

Genetics

Genética

plasmid dna transfer in bacteria

Plasmid DNA transfer in bacteria helped launch modern genetic engineering. The idea traces back to Frederick Griffith’s work on pneumonia-causing Streptococcus pneumoniae in the early 20th century. He studied a rough, non-virulent R strain and a smooth, virulent S strain with a protective polysaccharide capsule. When he injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice survived. But when heat-killed S-strain bacteria were mixed with live R-strain bacteria, the mice died, and live S-strain bacteria were found in the samples. Griffith concluded that a &quot;transformation&quot; had taken place. This was the first known discovery of bacterial transformation.

Transformation means a cell changes genetically after taking in DNA from its environment. In Griffith’s experiment, DNA that encoded the S-strain’s protective capsule was not destroyed by heat. That DNA entered the R-strain and helped it evade the mouse immune system. This process can happen naturally in the environment between organisms, and even between different species. Scientists also use transformation in the lab for research.

Bacteria are useful for transformation because they can take in outside genetic material and quickly copy it. They have one circular chromosome and many smaller circular DNA molecules called plasmids. Plasmids sit in the cytoplasm and can replicate on their own. They often carry useful traits, such as antibiotic resistance. In nature, bacteria can acquire plasmids from other bacteria through conjugation, and each new cell can inherit the plasmid when the bacteria divide.

In laboratories, plasmids used for experiments are called plasmid vectors. Scientists can build recombinant plasmids by inserting DNA fragments into a vector. These plasmids are usually about 5,000 to 10,000 base pairs long and often include an origin of replication, an antibiotic resistance gene, a multiple cloning site, a promoter, a selection marker, and the gene of interest. The origin of replication is where copying begins. The antibiotic resistance gene lets transformed bacteria survive on plates that contain a specific antibiotic.

Getting plasmids into bacteria often requires treating the host cells so the DNA can cross the cell membrane. Transformation efficiency depends on how porous the membrane is. One common method uses calcium chloride followed by heat shock. Bacteria that do not take up the plasmid do not transform, so they lack resistance and cannot grow on the plate. Multiple cloning sites help scientists insert DNA because they contain restriction enzyme cut sites. The promoter turns on transcription of the gene of interest. Scientists may track the inserted gene with a marker such as green fluorescent protein (GFP) or with another antibiotic resistance gene. These selection markers help confirm which bacteria contain the desired plasmid.

Transformation methods have had major effects on science and medicine. They helped researchers isolate and study genes and gene products and supported the development of drugs, genetically modified crops, and diagnostic tools. New cloning methods also continue to appear. Gateway Cloning can insert multiple DNA fragments into different vectors and move DNA between plasmids. CRISPR-Cas9 is another gene-editing method, but it directly changes nucleotides in the genome and does not require plasmids.

After transformation, researchers often isolate the gene of interest and study its product. This cloning work opened the door to genetic manipulation. It also allows bacteria to make large amounts of human proteins, such as insulin for diabetes treatment. Genetic cloning has also affected agriculture through genetically modified organisms, or GMOs. Scientists are working to add nitrogen-fixing genes to crops to improve food production and reduce fertilizer use. Bacterial transformation remains a key first step in modern biotechnology and an important base for future discoveries.

Plasmid DNA Transfer in Bacteria

genetics of organisms

Mendelian Traits and Exceptions

Mendelian genetics explains how traits move from parents to offspring. Gregor Mendel studied pea plants in 1865 and showed that many visible traits are controlled by two alleles, or gene versions, with one inherited from each parent. He also found that some alleles are dominant and others are recessive. Mendel’s work was not widely accepted until 1900, and it took about 30 more years for Mendelian inheritance to fit into evolutionary theory. One reason for the delay was that real breeding...

dna isolation and restriction enzyme analysis

dna-isolation-and-restriction-enzyme-analysis

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

DNA extraction, quantification, and cutting are key steps in many biology labs. Scientists use these methods to study genes, prepare DNA for testing, and compare fragments for analysis. DNA isolation starts with a small sample, such as a leaf, hair follicles, or epithelial cells from the mouth collected with a saline solution. The first steps are cell harvesting, lysis, protein degradation, and DNA precipitation. Lysis breaks open the cell and nuclear membranes so the DNA can be released from...

bacterial transformation

Plasmid DNA transfer in bacteria helped launch modern genetic engineering. The idea traces back to Frederick Griffith’s work on pneumonia-causing Streptococcus pneumoniae in the early 20th century. He studied a rough, non-virulent R strain and a smooth, virulent S strain with a protective polysaccharide capsule. When he injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice survived. But when heat-killed S-strain bacteria were mixed with live R-strain bacteria, the mice died, and...

genetics

Learn how plasmid DNA transfer works in bacteria, from Griffith’s experiment to plasmids, selection markers, and biotechnology uses in high school science.

Plasmid DNA Transfer in Bacteria | JoVE K12

Prepare-se para ensinar Transformação bacteriana com este guia do instrutor de 1 minutos. Abrange as principais etapas de preparação para o laboratório Biology no JoVE Lab Manual.

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Protocolo do Estudante para Transformação bacteriana em Biology - 24K+ visualizações | JoVE Lab Manual

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

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In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

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To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

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Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

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Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

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SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

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In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

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SC.912.L.16.4

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RNA Structure

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Termination of Translation

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Nonsense-mediated mRNA Decay

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The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

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SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

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Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

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The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

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Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

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Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

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Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

What is the Cell Cycle?

The cell cycle refers to the sequence of events occurring throughout a typical cell&#8217;s life. In eukaryotic cells, the somatic cell cycle has two ...

Interphase

The cell cycle occurs over approximately 24 hours (in a typical human cell) and in two distinct stages: interphase, which includes three phases of the ...

The Cell Cycle Control System

Positive Regulator Molecules

Inhibition of CDK Activity

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Mitogens and the Cell Cycle

Replicative Cell Senescence

Abnormal Proliferation

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Cells Coordinate Growth and Proliferation

What is Cancer?

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Cancers Originate from Somatic Mutations in a Single Cell

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Loss of Tumor Suppressor Gene Functions

The Retinoblastoma Gene

Mechanisms of Retrovirus-induced Cancers

Rous Sarcoma Virus (RSV) and Cancer

The Ras Gene

Explain the relationship between mutation, cell cycle, and uncontrolled cell growth potentially resulting in cancer.

SC.912.L.16.8

The Central Dogma

The central dogma explains the flow of genetic information from DNA nucleotides to the amino acid sequence of proteins.
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Human Genetics

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Genetic Material

Within the human body, a vast network of trillions of cells functions cohesively. Typically, each cell contains a nucleus with 46 chromosomes,&#160; a ...

Explain how and why the genetic code is universal and is common to almost all organisms.

SC.912.L.16.9

Ethics and Bioethics

Ethics is a philosophical study of moral actions. Ethics attempts to determine what is valuable for individuals and society. It examines the rational ...

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Plant Breeding and Biotechnology

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This video presents synthetic biology and its role in bioengineering. Synthetic biology refers to the methods used to genetically modify organisms in ...

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SC.912.L.16.10

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Plasmid DNA Transfer in Bacteria

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