Divisão Celular

1. Observando o ciclo celular em uma ponta de raiz Expand
   • Hipóteses: A hipótese experimental é que em fatias de pontas de raiz que foram tratadas com nocodazol, um produto químico que interfere na polimerização microtubular, todas as células serão presas no mesmo estágio do ciclo celular e que em fatias de ponta de cebola não tratadas todos os diferentes estágios do ciclo celular serão visualizados. A hipótese nula é que não haverá diferenças na mitose entre os dois grupos e que diferentes estágios do ciclo celular serão visualizados.
   • Para se preparar para este experimento, você usará uma cebola que foi colocada na água por vários dias até que novas pontas de raízes brancas comecem a brotar. Use uma lâmina de barbear para cortar um pedaço de 1 cm da ponta de uma das pontas da raiz.
   • Coloque a fatia de cebola em um tubo de microcentrífuga rotulado como "N" para a condição de nocodazol.
   • Em seguida, corte um segundo pedaço de 1 cm de ponta de raiz de cebola e coloque em um tubo de microcentrífuga rotulado como "C" para a condição de controle.
   • Adicione 2 μL de nocodazol de 5 mg/mL a 1 mL de água no tubo da microcentrífuga rotulado como N e 1 mL de água apenas no tubo rotulado como C.
   • Deixe os tubos contendo as pontas das raízes incubarem por 12 horas e limpe o espaço de trabalho com etanol a 70%.
   • Quando a incubação estiver concluída, defina um bloco de calor para 60 ºC.
   • Lave as pontas tratadas com nocodazol com água e aspire o líquido.
   • Repita esta lavagem mais duas vezes, para um total de três lavagens.
   • Encha ambos os tubos com 1 mL de um ácido clorídrico normal. Incubar os tubos em um bloco de calor a 60 ºC por 12 a 15 minutos e, em seguida, descartar o ácido em um frasco de resíduos.
   • Agora, adicione 1 mL de gota de água destilada aos tubos pelo menos três vezes para enxaguar as amostras.
   • Agora adicione um microlitro de coloração DAPI a 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   • Em seguida, coloque 50 μL deste corante DAPI diluído em cada tubo e deixe-os em temperatura ambiente para incubar por 12 min.
   • Depois disso, faça três lavagens com água destilada como na etapa 10.
   • Rotule uma lâmina de microscópio como 'Controle' e outra como 'Nocodazol'.
   • Transfira as raízes coradas para suas respectivas lâminas de microscópio e adicione uma gota de água à lâmina de controle e uma gota de nocodazol à lâmina de nocodazol.
   • Use a lâmina de barbear para remover as partes não manchadas de cada ponta da raiz e coloque uma lamínula de vidro sobre cada amostra.
   • Pressione cuidadosamente cada lamínula com a ponta do dedo enluvado e deixe as lâminas descansarem por 10 min.
   • Por fim, visualize as lâminas sob a objetiva de 40X de um microscópio de fluorescência e capture imagens de suas preparações de células da ponta da raiz.
2. Entendendo a perda do controle do ciclo celular Expand
   • NOTA: Antes que as células possam passar por todos os estágios do ciclo celular, há vários pontos de verificação pelos quais elas devem passar. Esses pontos de verificação são regulados por ciclina e proteínas quinase dependentes de ciclina, ou CDKs. Se as ciclinas e CDKs determinarem que os eventos celulares anteriores não foram adequadamente concluídos, eles prenderão as células nesta etapa e impedirão que elas proliferem. Nas células cancerígenas, uma ou várias dessas restrições moleculares para regular a divisão celular são perdidas e isso permite que as células danificadas escapem do controle da proliferação celular. Essas células anormais se desenvolvem em tumores que são massas de células em proliferação descontrolada que interferem nas funções normais do corpo. Observe como, antes de se dividir, essa célula cancerosa arredonda e refrata a luz com muita força sob o microscópio de luz. Isso ocorre porque nem todas as células cancerígenas se dividem com sucesso em células-filhas após cada rodada de mitose. Isso significa que eles geralmente contêm um excesso de organelas e DNA e esse aumento no conteúdo celular significa que eles refratarão a luz mais intensamente do que as células normais.
3. Resultados Expand
   • Examine as imagens coletadas e registre na Tabela 1 as diferentes estruturas e estágios celulares que puderam ser identificados na fatia de ponta de cebola que foi tratada com nocodazol. Clique aqui para baixar a Tabela 1
   • Se houver células em mitose, observe quais estágios de divisão celular você vê.
   • Registre a porcentagem de células em cada estágio da mitose na Tabela 1.
   • Em seguida, examine as imagens da fatia de ponta de cebola não tratada e registre quais estruturas celulares você pode identificar.
   • Se houver células em mitose, considere quais estágios de divisão celular você vê e registre as porcentagens de células em cada estágio de mitose na Tabela 1.

A hipótese experimental é que em fatias de pontas de raiz que foram tratadas com nocodazol, um produto químico que interfere na polimerização microtubular, todas as células serão presas no mesmo estágio do ciclo celular e que em fatias de ponta de cebola não tratadas todos os diferentes estágios do ciclo celular serão visualizados. A hipótese nula é que não haverá diferenças na mitose entre os dois grupos e que diferentes estágios do ciclo celular serão visualizados. Para se preparar para este experimento, você usará uma cebola que foi colocada na água por vários dias até que novas pontas brancas das raízes comecem a brotar.

Use uma lâmina de barbear para cortar um pedaço de um centímetro da ponta de uma das pontas da raiz. Coloque a fatia de cebola em um tubo de microcentrífuga rotulado como N para a condição de nocodazol. Em seguida, corte um segundo pedaço de um centímetro da ponta da raiz da cebola e coloque em um tubo de microcentrífuga rotulado como C para a condição de controle.

Adicione dois microlitros de cinco miligramas por mililitro de nocodazol a um mililitro de água no tubo de microcentrífuga rotulado como N e um mililitro de água ao tubo rotulado como C. Deixe os tubos contendo as pontas das raízes incubarem por 12 horas e limpe o espaço de trabalho com 70% de etanol. Quando a incubação estiver concluída, defina um bloco de calor para 60 graus Celsius. Lave as pontas tratadas com nocodazol com água e aspire o líquido.

Repita esta lavagem duas vezes para um total de três lavagens. Encha os dois tubos com um mililitro de ácido clorídrico normal. Incube os tubos em um bloco de calor de 60 graus Celsius por 12 a 15 minutos, depois descarte o ácido em um frasco de resíduos e adicione um mililitro de gota de água destilada aos tubos pelo menos três vezes para enxaguar as amostras.

Agora adicione um microlitro de coloração DAPI a 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, coloque 50 microlitros da coloração DAPI diluída em cada tubo e deixe-os em temperatura ambiente para incubar por 12 minutos. Após esta pré-forma, três lavagens com água destilada, como acabamos de demonstrar.

Rotule uma lâmina de microscópio como Controle e outra como Nocodazol. Transfira as raízes coradas para suas respectivas lâminas de microscópio e adicione uma gota de água à lâmina de controle e uma gota de nocodazol à lâmina de nocodazol. Use a lâmina de barbear para remover as partes não manchadas de cada ponta da raiz e coloque uma lamínula de vidro sobre cada amostra.

Pressione cuidadosamente cada lamínula com a ponta do dedo enluvado e deixe as lâminas descansarem por 10 minutos. Por fim, visualize as lâminas sob a objetiva de 40x de um microscópio de luz ou fluorescente e capture imagens de suas preparações de células da ponta da raiz. Antes que as células possam passar por todos os estágios do ciclo celular, existem vários pontos de verificação pelos quais elas devem passar.

Esses pontos de verificação são regulados por ciclina e proteínas quinase dependentes de ciclina, ou CDKs. Se as ciclinas e CDKs determinarem que os eventos celulares anteriores não foram adequadamente concluídos, eles prenderão as células nesta etapa e impedirão que elas proliferem. Nas células cancerígenas, uma ou várias dessas restrições moleculares para regular a divisão celular são perdidas e isso permite que as células danificadas escapem do controle da proliferação celular.

Essas células anormais se desenvolvem em tumores que são massas de células em proliferação descontrolada que interferem nas funções normais do corpo. Observe como, antes de se dividir, essa célula cancerosa arredonda e refrata a luz com muita força sob o microscópio de luz. Isso ocorre porque nem todas as células cancerígenas se dividem com sucesso em células-filhas após cada rodada de mitose.

Isso significa que eles geralmente contêm um excesso de organelas e DNA e esse aumento no conteúdo celular significa que eles refratarão a luz mais intensamente do que as células normais. Agora que todos os dados foram coletados, vamos dar uma olhada em nossos resultados. Quais estruturas celulares podem ser identificadas na fatia de ponta de cebola que foi tratada com nocodazol?

Alguma célula está passando por mitose? Quais estágios da divisão celular você vê? Registre a porcentagem de células em cada estágio da mitose na tabela.

Em seguida, observe a fatia de ponta de cebola não tratada. Quais estruturas celulares você pode identificar? Alguma célula está passando por mitose?

Quais estágios da divisão celular você vê? Registre as porcentagens de células em cada estágio da mitose na tabela. Você deve ter notado que a maioria das células na fatia de cebola tratada com nocodazol está no mesmo estágio de mitose devido às propriedades de interrupção dos microtúbulos do reagente que impedem a formação das fibras do fuso e subsequente segregação cromossômica e divisão celular.

Muitos estágios diferentes de mitose são visíveis nas células da fatia não tratada, no entanto, como a mitose é um processo contínuo em organismos saudáveis.