32.10: Imunoprecipitação

A imunoprecipitação, ou IP, é uma técnica amplamente utilizada que emprega interações proteína-anticorpo para isolar proteínas ou complexos proteicos em seu estado nativo para estudar interações proteína-proteína, estruturas quaternárias ou complexos supramoleculares. Várias modificações da técnica, incluindo cromatina IP, IP de reticulação e IP de fluorescência, são comumente usadas.

Imunoprecipitação da cromatina

A imunoprecipitação da cromatina, também conhecida como ChIP, é usada para estudar as interações proteína-DNA ou proteína-RNA. É uma técnica importante para estudar processos celulares cruciais, como transcrição de genes, replicação de DNA, recombinação e reparo, progressão do ciclo celular e epigenética. Também é útil identificar a localização in vivo dos locais de ligação de vários fatores de transcrição, histonas e outras proteínas reguladoras.

As principais etapas do ChIP incluem fixação, sonicação, imunoprecipitação e análise. Envolve a reticulação da proteína-alvo com o DNA usando um agente fixador, como o formaldeído, seguido de sonicação ou hidrólise enzimática para obter fragmentos menores de cromatina. A técnica então utiliza anticorpos de alta afinidade específicos contra a proteína de interesse para capturar o DNA ligado à proteína em uma reação de imunoprecipitação. A reticulação é então revertida usando alta temperatura, alta concentração de sal e proteinase K para liberar o DNA das proteínas associadas. O DNA é ainda mais purificado para prepará-lo para análise.

Imunoprecipitação de reticulação

A imunoprecipitação de reticulação, ou CLIP, identifica as regiões dos locais de ligação às proteínas no RNA endógeno, precipitando-as na fase de transcrição ativa. As moléculas de RNA são reticuladas com proteínas para mantê-las juntas e evitar sua degradação. O procedimento para a quebra e isolamento dos complexos é semelhante ao ChIP. Esta técnica é usada para estudar a interação do RNA com proteínas de ligação ao RNA e suas modificações em vários sistemas biológicos.

Limitações do IP

Embora as técnicas de imunoprecipitação tendam a reduzir o número de etapas de purificação, elas têm certas limitações. Os anticorpos que ligam as proteínas bacterianas recombinantes, as proteínas A ou G, conjugadas aos grânulos de agarose, e os anticorpos utilizados no método podem sofrer uma ligação não específica, introduzindo contaminantes na preparação de proteínas purificadas. Além disso, a imobilização de anticorpos nos grânulos requer otimização e é demorada. A lavagem das esferas após o complexo antígeno-anticorpo é crítica, mas há uma chance de perder a proteína-alvo nesta etapa.