33.4: Microscopia de Imunofluorescência

Um microscópio de fluorescência usa cromóforos fluorescentes chamados fluorocromos, que podem absorver energia de uma fonte de luz e emitir essa energia como luz visível. Os fluorocromos incluem substâncias naturalmente fluorescentes (como clorofilas) e manchas fluorescentes que são adicionadas à amostra para criar contraste. Corantes como o vermelho do Texas e o FITC são exemplos de fluorocromos. Outros exemplos incluem os corantes de ácido nucleico 4′,6′-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e laranja de acridina.

O microscópio irradia a amostra com excitação de comprimento de onda curto, como luz ultravioleta ou azul. Os cromóforos absorvem a luz de excitação e emitem luz visível de comprimentos de onda mais longos. A luz de excitação é então filtrada (em parte porque a luz ultravioleta é prejudicial aos olhos) para que apenas a luz visível passe pela lente ocular, produzindo uma imagem da amostra em cores brilhantes contra um fundo escuro.

Os microscópios de fluorescência podem identificar patógenos, encontrar espécies específicas em um ambiente ou encontrar a localização de moléculas e estruturas específicas dentro de uma célula. Abordagens também foram desenvolvidas para distinguir células vivas de mortas com base no fato de elas absorverem fluorocromos específicos. Às vezes, vários fluorocromos são usados na mesma amostra para mostrar diferentes estruturas ou características.

Uma das aplicações mais importantes da microscopia de fluorescência é a imunofluorescência, que é usada para identificar certos micróbios observando se os anticorpos se ligam a eles. (Anticorpos são moléculas de proteína que o sistema imunológico produz que se ligam a patógenos específicos para matá-los ou inibi-los.) Esta técnica tem duas abordagens: ensaio de imunofluorescência direta (DFA) e ensaio de imunofluorescência indireta (IFA). No DFA, anticorpos específicos (por exemplo, aqueles que têm como alvo o vírus da raiva) são corados com um fluorocromo. Se a amostra contiver o patógeno alvo, pode-se observar os anticorpos se ligando ao patógeno sob o microscópio fluorescente. Esta é uma coloração primária de anticorpos porque os anticorpos corados se ligam diretamente ao patógeno.

Na RIFI, os anticorpos secundários são corados com um fluorocromo em vez de anticorpos primários. Os anticorpos secundários não se ligam diretamente ao organismo, mas se ligam aos anticorpos primários. Quando os anticorpos primários não corados se ligam ao patógeno, os anticorpos secundários fluorescentes podem ser observados ligando-se aos anticorpos primários. Assim, os anticorpos secundários são ligados indiretamente ao patógeno. Como vários anticorpos secundários geralmente podem se ligar a um anticorpo primário, a IFA aumenta o número de anticorpos fluorescentes ligados à amostra, facilitando a visualização de suas características.