Summary
In vivo ağrı ve inflamasyon aracılık biyokimyasalın ölçümü için ilgili doku siteleri (deneysel iltihaplı cilt) interstisyel sıvı örneklerinin toplanması için bir teknik sunulmuştur.
Abstract
Bu in vivo insan biyoassay insan gönüllüler ve hastalar çalışma için kullanılabilir. Örnekler aseptik takılı mikrodiyaliz kateterler (Dermal Diyaliz, Erlangen, Almanya) ile deri gibi yerinde doku sitelerinden toplanır. Bu örnekte gösterildiği insan gönüllüler üzerinde yapılan deneysel iltihaplı cilt interstisyel sıvı toplanması. Numune toplama diğer deneysel testler ile kombine edilebilir. Örneğin, aynı anda değerlendirme yerel piyasaya biyokimyasalın ve deneysel iltihaplı deride ağrılı uyaranlara subjektif hassasiyet, ağrı ve inflamasyon biyobelirteçleri tanımlamak için kritik biyokimyasal-davranışçı bağlantı sağlar. Sunan yaşayan insan organizması testi doku ağrısı ve / veya inflamasyon altında yatan spesifik süreçlere mekanistik anlayış sağlar. Bu yeni ilaç adaylarının - ağrılı ve / veya inflamatuvar koşulları tedavi hedeflemesi Bu yöntem aynı zamanda mevcut veya yeni müdahalelerin etkinliğini incelemek için uygundur. Bu makale, insan deneklerin deneysel iltihaplı cilt lezyonu interstisyel sıvı toplanması için mikrodiyaliz tekniklerinin kullanımı ile ilgili ayrıntılı bir açıklama sağlayacaktır. İnterstisyel sıvı numuneleri, genellikle multipleks boncuk dizisi immunoassay 50 mikrolitre hacmi gibi küçük numunelerin 100 analitler assaying izin yardımı ile işlenir.
Protocol
Deneysel inflamasyon İndüksiyon:
- Birinci derece güneş yanığı, kalibre, ultraviyole B kaynağı (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Almanya) yardımı ile uyluk olmayan tabaklanmış deri indüklenir. Güneş yanığı, tam maruz kalan deride kızarıklık ya da üç kez minimal eritemal doz (MED) neden UVB ışık miktarını gerekli üç kez uygulayarak mikrodiyaliz deney başlamadan 24 saat önce meydana gelir. MED, çalışmaya başlamadan önce her konuda belirlenir. Doğru enerji teslimat ile güvence altına alınmıştır UV-metre (RM 12, Dr. Grobel UV-Elektronik GmbH, Ettlingen, Almanya).
Kateter yerleştirme ve örnek toplama:
- Steril eldiven, 1 adet 23 gauge (G) iğne, 1 cc şırınga 30G iğne ile,% 1 lidokain steril iğne tutucu, 1cc döner ucu şırınga ile bir hazırlama alanı hazırlayın, alkol çubuklar, 2x2 steril gazlı bez, mikrodiyaliz kateterler ekli 4cm 23G iğne (Dermal Diyaliz, Erlangen, Almanya), ve kuru buz üzerinde 100μl örnek başına 4μl proteaz inhibitörü çözümü ile 1,5 ml Microcent toplama tüpleri (E ve K Bilimsel, Santa Clara, CA.) sonunda. proteaz inhibitörü çözüm üreticinin talimat başına proteaz inhibitörü kokteyl tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Almanya) kullanılarak yapılır.
- Laktat ringer solüsyonu% 1 human albumin solüsyonu hazırlayın ve 1cc döner ucu şırınganın içine çekmek, şırınga içinde kalan NO hava kabarcıkları vardır emin olun.
- Şırıngaya bir yüksek hassasiyetli infüzyon pompası (Pompa 22, Harvard Apparatus, Güney Natick, MA üzerine monte beşiği (mikrodiyaliz multi-şırınga Rack, Harvard Apparatus, Güney Natick, MA) içine% 1 insan albumin-zenginleştirilmiş ringer laktat çözüm yükleyin .) Şırınga sürüş infüzyon pompası bar şırınga pistonu ile tam temas olduğundan emin olun. Şırınga çapı doğru pompa girmiş olduğunu onayladıktan sonra pompa hızını ayarlayın. Yaygın olarak kullanılan infüzyon oranları 2 4μl/min arasında değişmektedir.
- Numune planı alan tanımlayın. Yukarıda açıklanan güneş yanığı, güneş yanığı kenarında kateter takmadan planı gibi, yapay olarak oluşturulmuş iltihaplı alan, örnekleme.
- Alkol, örnek toplamak niyetinde küçük bir lezyon ters kenarlarında alan, veya site temizleyin. Bu silinen alanları için amaçlanan kateterin yerleştirilmesi ve çıkış noktaları olacaktır. Yeterli intra-kutanöz lidokain enjekte (enjeksiyon cilt beyazlaşma tarafından kanıtlandığı) bu sitelerin çok küçük bir bleb (maksimum 2 mm) oluşturmak için. Mikrodiyaliz kateter giriş ve çıkış noktaları cilt içi lidokain gibi sınırlı miktarda enjeksiyon biyoassay sonuçları değiştirmez, ancak çalışma konuları için önemli ölçüde daha az ağrılı kateterin yerleştirilmesi yapar.
- Aseptik teknikleri kullanarak, keşfedilmeyi cilt alanının uzunluğu boyunca bağlı 23G iğne yardımı ile mikrodiyaliz kateter yerleştirin. Yerleştirme derinliği kutis ve subkutiste arasında arayüz. Yeterli bir derinliğe yerleştirilmesi optik kontrol edilebilir. Iğne, iğne ve ekli kateter ileri taşınır cilt gibi bazı cilt beyazlaşma biraz yukarı katlanır neden olmalıdır. Kanama meydana gelmelidir. Kanama meydana gelirse bu iğne istenenden daha derin bulunan ve yerleştirme derinliği ayarlanabilir olduğunu gösterir. Iğne derinin çıkış noktası üzerinden itilmiş sonra kateter uzunluğu boyunca damlacıkları görene kadar,% 1 albümin zenginleştirilmiş ringer laktat solüsyonu ile kateter yıkayın. Bu dikkatle mikrodiyaliz kateterin distal ucunu bir şırınga (23G iğne) iğne sonuna ekleme ve yavaş yavaş solüsyon enjekte yapılır.
- Yıkamadan sonra kateter deri yoluyla ekli kateter beslemek için iğne hafifçe çekin. Kateterler, küçük çaplı, ve dolayısıyla kırılgan çünkü hassas davranılması gereklidir. Kateter çekin tamamen deri yoluyla dişli kadar, yani, kateterin distal ucu gömme büyük plastik boru tabanına giriş noktasında cilt dokunur. Yukarıda belirtildiği gibi, prosedürün sonunda kanama çok az optimal kateter onaylar.
- Infüzyon pompası rafa dinlenme şırınga 23G iğne ucu kateterin distal ucu takın. Bakım kateter duvarın üzerinden iğne batırmak önlemek için gereklidir, potansiyel kaçak neden olur.
- Kateterin proksimal ucundan iğne kesin.
- ¼-inç pembe bant kullanımı, kateter çıkış yeri yakın cilt hazırlanan 1.5ml Microcent toplama tüpü takın. Microdialysate toplama izin için toplama tüpüne kateterin ucu yerleştirin. Önceden belirlenmiş r perfüzyon pompası Başlatyedik ve aralıklı bu teslim edilir ve toplanan hacmi kadar maçı kontrol. Miktarlar halinde, cilt giriş yeri kaçağı (bazen daha sıkı bir cilt giriş yeri üzerine plastik boru gömülü kateter parçası çekerek çözülebilir) ekarte edilmelidir kadar maç yok. Teslim edilir ve ciltlik eşleşmiyor Alternatif olarak, eğer bir kateter değiştirilmesi gerekebilir.
- Örnekleme tam sonra, numuneler -80 ° C'de depolama kadar kuru buz konur
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrodiyaliz teknikleri ve multipleks immunoassay teknoloji kombine kullanımının ilgi doku biyokimyasal olaylar içgörü sağlayan değerli bir gerçek zamanlı, in vivo insan biyoassay. Ağrı testleri gibi davranış testleri ile birlikte, yöntem, ağrı ve iltihaplanma aracılık biyokimyasalın karmaşık etkileşimleri inceleyerek sağlar. Periferik dokularda patoloji ile kronik enflamatuar ve ağrı koşulları patoloji mekanistik bir kavrayış sağlayan ağrı ve iltihaplanma, 2) arabuluculuk doku spesifik biyobelirteçleri belirlenmesi yöntemi 1) umut verici ve 3) analjezik / anti-hyperalgesic ve anti-inflamatuar etkileri keşfetmek. yeni ilaç adaylarının ve girişimsel tedaviler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis catheter | Tool | Dermal Dialysis | NA | |
| Pump 22 | Tool | Harvard Apparatus | 552219 | |
| Saalmann Multitester SBB LT 400 | Tool | Saalmann GmbH | NA | |
| RM-12 IP-65 Radiometer | Tool | Dr. Grobel UV Elektronik GmbH | 82120000/81112100 | |
| Complete Proteinase Inhibitor | Reagent | Roche Group | 11836145001 | |
| Microcent tube | Tool | E&K Scientific | 380150-X | |
| Albumin 5% | Reagent | ZLB Behring | NA | |
| Lactated Ringer | Reagent | Hospira Inc. | NA | |
| Xylocaine-MPF | Other | AstraZeneca | NA | |
| Syringe 1mL | Tool | BD Biosciences | 309602 |
References
- Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study. Pain. 139, 15-27 (2008).
