Name: Bioensaio In-Vivo humanos para a medição de tecidos específicos de Mediadores nociceptiva e inflamatória (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a coletar fluido intersticial de pele inflamada usando microdiálise em humanos. Este método permite analisar mediadores nociceptivos e inflamatórios em amostras armazenadas a -80°C para estudos de neurociência.

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Indução da inflamação experimental: <ol><li> A queimadura de primeiro grau é induzida em não-bronzeada da pele de um coxa com auxílio de uma fonte calibrada B, ultravioleta (Saalmann multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Alemanha). A queimadura solar é induzida 24 horas antes de iniciar um experimento microdiálise através da aplicação de três vezes a quantidade de luz UVB necessária para causar vermelhidão completa de pele exposta, ou três vezes a dose mínima eritema (MED). O MED é determinado em cada disciplina antes do início do estudo. Entrega exata de energia está assegurada com uma UV-metro (12 RM, Dr. Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Alemanha). </li></ol> Colocação de cateter e coleta de amostra: <ol><li> Prepare uma área de preparação com luvas estéreis, um porta-agulha estéril, seringa ponta 1cc luer com um calibre 23 (G) da agulha, seringa com uma agulha 1cc 30G, lidocaína a 1%, o algodão, as compressas de gaze estéril 2x2, cateteres microdiálise anexado em um fim a uma agulha de 4 centímetros 23G (Diálise Dermal, Erlangen, Alemanha), e 1,5 ml tubos de coleta Microcent (E &amp; K Scientific, Santa Clara, CA.) com a solução 4μl inibidor da protease por amostra 100μl em gelo seco. solução inibidor da protease é feita por instrução do fabricante usando comprimidos inibidores da protease cocktail (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Alemanha). </li><li> Prepare uma solução de 1% de albumina humana em solução de ringer com lactato e desenhá-lo para dentro da seringa 1cc ponta luer, certificando-se não há bolhas de ar que restou na seringa. </li><li> Carregar a seringa com a 1% de albumina humana enriquecido solução de Ringer com lactato no berço (microdiálise seringa multi-rack, Harvard Apparatus, South Natick, MA) montado em uma bomba de alta precisão de infusão (Pump 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA ). Certifique-se que a barra da bomba de infusão de condução a seringa está em contato total com o êmbolo da seringa. Definir a taxa de bomba após a confirmação de que o diâmetro da seringa foi exatamente entrou na bomba. As taxas de infusão comumente utilizados variam entre 2 a 4μl/min. </li><li> Defina a área que você pretende coletar sua amostra de. Quando a amostragem de uma área criada artificialmente inflamado, como a queimadura solar descrito acima, o plano de inserção do cateter na borda da queimadura. </li><li> Limpe uma área pequena em margens opostas da lesão, ou o site que pretende coletar a amostra de, com o álcool. Estas áreas serão limpas a inserção pretendido e pontos de saída para o cateter. Injetar apenas o suficiente lidocaína intra-cutânea (evidenciado pelo branqueamento da pele no local da injecção) nesses locais para criar uma bolha muito pequenas (máximo de 2mm). Injeção de quantidade limitada de tais intra-cutânea de lidocaína na entrada e pontos de saída do cateter de microdiálise não deve alterar os resultados do bioensaio, mas faz a inserção do cateter significativamente menos doloroso para sujeitos do estudo. </li><li> Utilizando técnicas de assepsia, insira o cateter de microdiálise com auxílio de agulha de 23G conectado ao longo do comprimento da área de pele explorado. A profundidade de inserção é na interface entre a cútis e subcutâneo. Inserção em uma profundidade adequada pode ser verificado visualmente. Como a agulha eo cateter são anexados avançou a agulha deve causar um pouco de dobra da pele, bem como alguns branqueamento da pele. Sem sangramento deve ocorrer. Se o sangramento ocorre isso indica que a agulha fica mais profundo do que o pretendido e da profundidade de inserção tem que ser ajustada. Uma vez que a agulha foi empurrada através do ponto de saída da pele, lave-os cateteres com 1% de albumina enriquecido solução de Ringer lactato até ver gotas ao longo do comprimento do cateter. Isto é feito através da inserção no final de uma seringa de agulha (23G agulha) na extremidade distal do cateter de microdiálise, e, lentamente, injetando solução. </li><li> Após a lavagem do cateter puxar suavemente a agulha para alimentar o cateter conectado através da pele. Manuseio suave é necessária porque os cateteres são de pequeno diâmetro e, conseqüentemente, frágil. Puxe o cateter até que esteja completamente roscadas através da pele, ou seja, a base do tubo de plástico maior incorporação da extremidade distal do cateter toca a pele no ponto de entrada. Como mencionado acima, pouco ou nenhum sangramento no final do procedimento confirma a inserção do cateter ideal. </li><li> Anexar a extremidade distal do cateter para a ponta da agulha da seringa 23G descansando no rack da bomba de infusão. Cuidado é necessário para evitar punção da agulha através da parede do cateter, o que poderia provocar uma fuga em potencial. </li><li> Cortar a agulha fora da extremidade proximal do cateter. </li><li> Usando ¼ polegadas de fita rosa, anexar o tubo de coleta de 1,5 ml preparada Microcent na pele perto do local de saída do cateter. Coloque a ponta do cateter para dentro do tubo de coleta para permitir a coleta de microdialysate. Ligue a bomba de perfusão em r predeterminadocomeu e intermitentemente verificar que o volume entregue e recolhido igualar-se. No caso de os volumes não correspondem, fuga do local de entrada da pele deve ser excluída (às vezes pode ser resolvido, puxando a parte do cateter que é incorporado pelo tubo de plástico com mais força sobre o local de entrada da pele). Alternativamente, um cateter pode precisar de ser substituído se volumes entregues e recolhidos não combinam. </li><li> Uma vez que a amostragem é completa, as amostras são colocadas em gelo seco até o armazenamento a -80 º C. </li></ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

O uso combinado de técnicas de microdiálise e tecnologia de imunoensaio multiplex é um valioso em tempo real, bioensaio in vivo humana fornecendo informações sobre eventos bioquímicos em tecidos de interesse. Combinados com testes comportamentais, tais como testes de dor, o método permite estudar as interações complexas de produtos bioquímicos mediação dor e inflamação. O método é promissor para 1) identificar biomarcadores tecido específico mediando a dor ea inflamação, 2) proporcionando uma visão mecanicista sobre a patologia das condiçõe...

<table><tbody><tr><td>Cateter de microdiálise</td><td>Ferramenta</td><td>Dialise dérmica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bomba 22</td><td>Ferramenta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Saalmann Multitester SBB LT 400</td><td>Ferramenta</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Radiômetro RM-12 IP-65</td><td>Ferramenta</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease completo</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microcêntrifugo</td><td>Ferramenta</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>Albumina 5%</td><td>Reagente</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ringer com lactato</td><td>Reagente</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine-MPF</td><td>Outro</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

bioensaio in-vivo humanos para a medição de tecidos específicos de mediadores nociceptiva e inflamatória

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

Este bioensaio in vivo humano pode ser usado para estudar voluntários humanos e pacientes. As amostras são coletadas em sites de tecido pertinentes, tais como a pele através de cateteres inseridos assepticamente microdiálise (Diálise Dermal, Erlangen, Alemanha). Ilustrado neste exemplo é a coleção de líquido intersticial da pele inflamada experimentalmente em voluntários humanos. Coleta de amostras podem ser combinadas com outros testes experimentais. Por exemplo, a avaliação simultânea de produtos bioquímicos localmente liberados e sensibilidade subjetiva a estímulos dolorosos na pele inflamada experimentalmente fornece o link de bioquímica-comportamental fundamental para identificar biomarcadores da dor e inflamação. Ensaio apresentado no organismo humano vivo permite uma visão mecanicista em processos de tecidos específicos subjacentes a dor e / ou inflamação. O método também é adequado para examinar a eficácia das intervenções existentes ou novos - como novos fármacos - visando o tratamento de situações dolorosas e / ou inflamatória. Este artigo irá fornecer uma descrição detalhada sobre o uso de técnicas de microdiálise para coletar o líquido intersticial da lesão de pele inflamada experimentalmente dos sujeitos do estudo humano. As amostras de líquidos intersticiais são normalmente tratados com auxílio de imunoensaios multiplex talão série assaying permitindo até 100 analitos em amostras tão pequenas no volume de 50 microlitros.

A técnica é apresentada para a coleta in vivo de amostras de líquido intersticial de sites pertinentes tecido (pele aqui, experimentalmente inflamação) para a medição de produtos bioquímicos mediação dor e inflamação.

Bioensaio In-Vivo humanos para a medição de tecidos específicos de Mediadores nociceptiva e inflamatória

Este bioensaio humano in vivo pode ser utilizado para estudar voluntários e pacientes humanos. As amostras são coletadas de locais teciduais pertinentes, como a pele, por meio de ...

Este vídeo começa 24 horas após a indução de queimadura solar experimental na coxa de um paciente, utilizando uma fonte de luz UV calibrada. Após a aplicação de anestésico local, um cateter de microdiálise é inserido entre os cortes e o subcu e, em seguida, puxado através da pele. Uma seringa de perfusão é conectada à extremidade proximal do cateter, e a ativação da bomba de perfusão induzirá o fluxo e a coleta do lisado micro.Após a coleta, as amostras podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius até que a análise dos mediadores nociceptivos e inflamatórios esteja pronta para ser realizada. Olá, sou Martin Angst, do Departamento de Anestesiologia da Universidade de Stanford. E olá, sou Martha Tingle, enfermeira pesquisadora sênior e gerente do Laboratório de Dor Humana, fundado pelo Dr. Angst em 1995 aqui na Universidade de Stanford.Hoje vamos mostrar um procedimento para a colocação de cateteres de microdiálise na pele inflamada experimental de participantes humanos do estudo, com o objetivo de coletar fluido intersticial. Utilizamos essa técnica em nosso laboratório para estudar a liberação tecidual específica de substâncias bioquímicas essenciais para a mediação da dor e da inflamação. Então, vamos começar.Um modelo de inflamação cutânea experimental é a queimadura solar artificial. Uma queimadura solar de primeiro grau é induzida com auxílio de uma fonte calibrada de ultravioleta B. A administração precisa de energia é garantida com um medidor de UV.A queimadura solar é geralmente induzida pela aplicação de duas a três vezes a quantidade de luz UVB necessária para causar vermelhidão. Antes de coletar os espécimes, prepare uma área de trabalho com luvas estéreis, um porta-agulhas estéril e seringas de ponta luer de um CC com agulhas de 23 e 30 gauge. Você também precisará de cateteres de microdiálise ligados em uma das extremidades a uma agulha de 23 gauge com quatro centímetros de comprimento. As amostras serão coletadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo quatro microlitros de solução inibidora de protease por amostra de 100 microlitros. A solução inibidora de protease é preparada conforme as instruções do fabricante, utilizando comprimidos de coquetel inibidor de protease. Prepare uma solução de albúmina humana a 1% em solução de Ringer lactato e aspire-a para dentro da seringa luer de um CC, certificando-se de que não permaneçam bolhas de ar na seringa. Carregue a seringa contendo a solução de Ringer lactato enriquecida com albúmina humana a 1% na garra montada em uma bomba de infusão de alta precisão. Várias seringas podem ser carregadas para obter simultaneamente amostras de fluido intersticial de diferentes locais.Certifique-se de que a barra da bomba de infusão que aciona a seringa esteja em contato completo com o êmbolo da seringa. Ajuste a taxa da bomba após confirmar que o diâmetro da seringa foi inserido com precisão na bomba. As taxas de infusão comumente utilizadas variam entre dois e quatro microlitros por minuto.Agora você está pronto para posicionar o cateter antes da colocação do cateter. A área da qual as amostras são coletadas deve ser definida ao realizar a coleta a partir de uma área inflamada artificialmente, como uma queimadura solar induzida experimentalmente. Planeje inserir o cateter na borda da queimadura solar.Limpe uma pequena área nas bordas opostas da lesão ou local C de onde você pretende coletar sua amostra com cotonetes de álcool; essas áreas limpas serão os pontos de inserção e saída pretendidos para o cateter. Usando uma seringa de um cc com agulha de 30 graus, injete lidocaína a 1% até evidenciar o branqueamento da pele na injeção; injete apenas a quantidade suficiente de lidocaína nesses locais para criar um bleb muito pequeno, com tamanho máximo de dois milímetros. A injeção de uma pequena quantidade de lidocaína nos pontos de entrada e saída do cateter de microdiálise torna a inserção do cateter menos dolorosa para os indivíduos, mas não deve afetar os resultados dos bioensaios, utilizando técnicas assépticas.Insira os cateteres de microdiálise com a ajuda da agulha acoplada de calibre 23 ao longo da extensão da área de pele examinada. A profundidade de inserção deve ser na interface entre a derme e o tecido subcutâneo. A penetração adequada pode ser verificada visualmente enquanto a agulha e o cateter acoplado são avançados.A agulha deve causar um pequeno dobramento para cima da pele, bem como um leve branqueamento da pele. Nenhum sangramento deve ocorrer; caso ocorra, a agulha está localizada mais profundamente do que o pretendido e a profundidade de inserção precisa ser ajustada.Uma vez que a agulha tenha atravessado o ponto de saída da pele, puxe suavemente a agulha para introduzir o cateter acoplado através da pele. O manuseio delicado é essencial porque os cateteres têm diâmetro pequeno e são muito frágeis. Puxe o cateter até que esteja completamente inserido através da pele, ou seja, até a base do tubo plástico maior.O extremo distal do cateter embutido deve tocar a pele no ponto de entrada. Novamente, deve ocorrer pouca ou nenhuma hemorragia, indicando que o cateter foi posicionado corretamente. Para iniciar a coleta da amostra, primeiro lave os cateteres com solução de ringer lactato enriquecida com 1% de albúmina.Isso é feito inserindo cuidadosamente uma seringa com agulha de 23 gauge na extremidade distal do cateter de microdiálise e injetando lentamente a solução. Lave o cateter até observar gotículas ao longo de todo o seu comprimento, bem como na ponta. Após a lavagem do cateter, conecte a extremidade distal do cateter à ponta da agulha de 23 gauge da seringa que está apoiada no suporte da bomba de infusão.Evite furar a agulha através da parede do cateter, o que poderia causar vazamento usando fita rosa de um quarto de polegada. Fixe o tubo de coleta microcêntrifugo de 1,5 mililitro preparado na pele próxima ao lado de saída do cateter. Coloque a ponta do cateter dentro do tubo de coleta para permitir a coleta do lisado micro.Inicie a bomba de perfusão na taxa predeterminada e verifique periodicamente se o volume administrado e o volume coletado estão iguais, caso os volumes não coincidam. Verifique se há vazamento na entrada pela pele. Vazamentos no local podem, às vezes, ser resolvidos puxando com mais firmeza a parte do cateter que está embutida pelo tubo plástico sobre o local de entrada na pele.Alternativamente, um cateter pode precisar ser substituído se os volumes entregues e coletados não coincidirem após a conclusão da amostragem. As amostras são colocadas em gelo seco até o armazenamento a menos 80 graus Celsius.Acabamos de mostrar como coletar fluido intersticial de pele inflamada experimental usando cateteres de microdiálise. Agora estamos prontos para analisar as amostras obtidas por meio de ensaios imunológicos para marcadores bioquímicos de dor e inflamação. Ao realizar este procedimento, é importante manipular os cateteres com muito cuidado, avançar lentamente os cateteres mantendo a tubulação sem tensão, e pode ser útil lubrificar os cateteres antes da inserção com um pouco da solução estéril que você preparou para a fase de infusão do estudo.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

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Biology

Biologia

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Coleta e medição Mediadores nociceptiva e inflamatória em feridas cirúrgicas

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