Name: Bioensaio In-Vivo humanos para a medição de tecidos específicos de Mediadores nociceptiva e inflamatória (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a coletar fluido intersticial de pele inflamada usando microdiálise em humanos. Este método permite analisar mediadores nociceptivos e inflamatórios em amostras armazenadas a -80°C para estudos de neurociência.

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Indução da inflamação experimental: <ol><li> A queimadura de primeiro grau é induzida em não-bronzeada da pele de um coxa com auxílio de uma fonte calibrada B, ultravioleta (Saalmann multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Alemanha). A queimadura solar é induzida 24 horas antes de iniciar um experimento microdiálise através da aplicação de três vezes a quantidade de luz UVB necessária para causar vermelhidão completa de pele exposta, ou três vezes a dose mínima eritema (MED). O MED é determinado em cada disciplina antes do início do estudo. Entrega exata de energia está assegurada com uma UV-metro (12 RM, Dr. Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Alemanha). </li></ol> Colocação de cateter e coleta de amostra: <ol><li> Prepare uma área de preparação com luvas estéreis, um porta-agulha estéril, seringa ponta 1cc luer com um calibre 23 (G) da agulha, seringa com uma agulha 1cc 30G, lidocaína a 1%, o algodão, as compressas de gaze estéril 2x2, cateteres microdiálise anexado em um fim a uma agulha de 4 centímetros 23G (Diálise Dermal, Erlangen, Alemanha), e 1,5 ml tubos de coleta Microcent (E &amp; K Scientific, Santa Clara, CA.) com a solução 4μl inibidor da protease por amostra 100μl em gelo seco. solução inibidor da protease é feita por instrução do fabricante usando comprimidos inibidores da protease cocktail (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Alemanha). </li><li> Prepare uma solução de 1% de albumina humana em solução de ringer com lactato e desenhá-lo para dentro da seringa 1cc ponta luer, certificando-se não há bolhas de ar que restou na seringa. </li><li> Carregar a seringa com a 1% de albumina humana enriquecido solução de Ringer com lactato no berço (microdiálise seringa multi-rack, Harvard Apparatus, South Natick, MA) montado em uma bomba de alta precisão de infusão (Pump 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA ). Certifique-se que a barra da bomba de infusão de condução a seringa está em contato total com o êmbolo da seringa. Definir a taxa de bomba após a confirmação de que o diâmetro da seringa foi exatamente entrou na bomba. As taxas de infusão comumente utilizados variam entre 2 a 4μl/min. </li><li> Defina a área que você pretende coletar sua amostra de. Quando a amostragem de uma área criada artificialmente inflamado, como a queimadura solar descrito acima, o plano de inserção do cateter na borda da queimadura. </li><li> Limpe uma área pequena em margens opostas da lesão, ou o site que pretende coletar a amostra de, com o álcool. Estas áreas serão limpas a inserção pretendido e pontos de saída para o cateter. Injetar apenas o suficiente lidocaína intra-cutânea (evidenciado pelo branqueamento da pele no local da injecção) nesses locais para criar uma bolha muito pequenas (máximo de 2mm). Injeção de quantidade limitada de tais intra-cutânea de lidocaína na entrada e pontos de saída do cateter de microdiálise não deve alterar os resultados do bioensaio, mas faz a inserção do cateter significativamente menos doloroso para sujeitos do estudo. </li><li> Utilizando técnicas de assepsia, insira o cateter de microdiálise com auxílio de agulha de 23G conectado ao longo do comprimento da área de pele explorado. A profundidade de inserção é na interface entre a cútis e subcutâneo. Inserção em uma profundidade adequada pode ser verificado visualmente. Como a agulha eo cateter são anexados avançou a agulha deve causar um pouco de dobra da pele, bem como alguns branqueamento da pele. Sem sangramento deve ocorrer. Se o sangramento ocorre isso indica que a agulha fica mais profundo do que o pretendido e da profundidade de inserção tem que ser ajustada. Uma vez que a agulha foi empurrada através do ponto de saída da pele, lave-os cateteres com 1% de albumina enriquecido solução de Ringer lactato até ver gotas ao longo do comprimento do cateter. Isto é feito através da inserção no final de uma seringa de agulha (23G agulha) na extremidade distal do cateter de microdiálise, e, lentamente, injetando solução. </li><li> Após a lavagem do cateter puxar suavemente a agulha para alimentar o cateter conectado através da pele. Manuseio suave é necessária porque os cateteres são de pequeno diâmetro e, conseqüentemente, frágil. Puxe o cateter até que esteja completamente roscadas através da pele, ou seja, a base do tubo de plástico maior incorporação da extremidade distal do cateter toca a pele no ponto de entrada. Como mencionado acima, pouco ou nenhum sangramento no final do procedimento confirma a inserção do cateter ideal. </li><li> Anexar a extremidade distal do cateter para a ponta da agulha da seringa 23G descansando no rack da bomba de infusão. Cuidado é necessário para evitar punção da agulha através da parede do cateter, o que poderia provocar uma fuga em potencial. </li><li> Cortar a agulha fora da extremidade proximal do cateter. </li><li> Usando ¼ polegadas de fita rosa, anexar o tubo de coleta de 1,5 ml preparada Microcent na pele perto do local de saída do cateter. Coloque a ponta do cateter para dentro do tubo de coleta para permitir a coleta de microdialysate. Ligue a bomba de perfusão em r predeterminadocomeu e intermitentemente verificar que o volume entregue e recolhido igualar-se. No caso de os volumes não correspondem, fuga do local de entrada da pele deve ser excluída (às vezes pode ser resolvido, puxando a parte do cateter que é incorporado pelo tubo de plástico com mais força sobre o local de entrada da pele). Alternativamente, um cateter pode precisar de ser substituído se volumes entregues e recolhidos não combinam. </li><li> Uma vez que a amostragem é completa, as amostras são colocadas em gelo seco até o armazenamento a -80 º C. </li></ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

O uso combinado de técnicas de microdiálise e tecnologia de imunoensaio multiplex é um valioso em tempo real, bioensaio in vivo humana fornecendo informações sobre eventos bioquímicos em tecidos de interesse. Combinados com testes comportamentais, tais como testes de dor, o método permite estudar as interações complexas de produtos bioquímicos mediação dor e inflamação. O método é promissor para 1) identificar biomarcadores tecido específico mediando a dor ea inflamação, 2) proporcionando uma visão mecanicista sobre a patologia das condiçõe...

<table><tbody><tr><td>Cateter de microdiálise</td><td>Ferramenta</td><td>Dialise dérmica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bomba 22</td><td>Ferramenta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Saalmann Multitester SBB LT 400</td><td>Ferramenta</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Radiômetro RM-12 IP-65</td><td>Ferramenta</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease completo</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microcêntrifugo</td><td>Ferramenta</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>Albumina 5%</td><td>Reagente</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ringer com lactato</td><td>Reagente</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine-MPF</td><td>Outro</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

bioensaio in-vivo humanos para a medição de tecidos específicos de mediadores nociceptiva e inflamatória

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

Este bioensaio in vivo humano pode ser usado para estudar voluntários humanos e pacientes. As amostras são coletadas em sites de tecido pertinentes, tais como a pele através de cateteres inseridos assepticamente microdiálise (Diálise Dermal, Erlangen, Alemanha). Ilustrado neste exemplo é a coleção de líquido intersticial da pele inflamada experimentalmente em voluntários humanos. Coleta de amostras podem ser combinadas com outros testes experimentais. Por exemplo, a avaliação simultânea de produtos bioquímicos localmente liberados e sensibilidade subjetiva a estímulos dolorosos na pele inflamada experimentalmente fornece o link de bioquímica-comportamental fundamental para identificar biomarcadores da dor e inflamação. Ensaio apresentado no organismo humano vivo permite uma visão mecanicista em processos de tecidos específicos subjacentes a dor e / ou inflamação. O método também é adequado para examinar a eficácia das intervenções existentes ou novos - como novos fármacos - visando o tratamento de situações dolorosas e / ou inflamatória. Este artigo irá fornecer uma descrição detalhada sobre o uso de técnicas de microdiálise para coletar o líquido intersticial da lesão de pele inflamada experimentalmente dos sujeitos do estudo humano. As amostras de líquidos intersticiais são normalmente tratados com auxílio de imunoensaios multiplex talão série assaying permitindo até 100 analitos em amostras tão pequenas no volume de 50 microlitros.

A técnica é apresentada para a coleta in vivo de amostras de líquido intersticial de sites pertinentes tecido (pele aqui, experimentalmente inflamação) para a medição de produtos bioquímicos mediação dor e inflamação.

Bioensaio In-Vivo humanos para a medição de tecidos específicos de Mediadores nociceptiva e inflamatória

Este bioensaio humano in vivo pode ser utilizado para estudar voluntários e pacientes humanos. As amostras são coletadas de locais teciduais pertinentes, como a pele, por meio de ...

Este vídeo começa 24 horas após a indução de queimadura solar experimental na coxa de um paciente, utilizando uma fonte de luz UV calibrada. Após a aplicação de anestésico local, um cateter de microdiálise é inserido entre os cortes e o subcu e, em seguida, puxado através da pele. Uma seringa de perfusão é conectada à extremidade proximal do cateter, e a ativação da bomba de perfusão induzirá o fluxo e a coleta do lisado micro.Após a coleta, as amostras podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius até que a análise dos mediadores nociceptivos e inflamatórios esteja pronta para ser realizada. Olá, sou Martin Angst, do Departamento de Anestesiologia da Universidade de Stanford. E olá, sou Martha Tingle, enfermeira pesquisadora sênior e gerente do Laboratório de Dor Humana, fundado pelo Dr. Angst em 1995 aqui na Universidade de Stanford.Hoje vamos mostrar um procedimento para a colocação de cateteres de microdiálise na pele inflamada experimental de participantes humanos do estudo, com o objetivo de coletar fluido intersticial. Utilizamos essa técnica em nosso laboratório para estudar a liberação tecidual específica de substâncias bioquímicas essenciais para a mediação da dor e da i

human-vivo-bioassay-for-tissue-specific-measurement-nociceptive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma técnica para recolher e medir os mediadores bioquímicos da ferida cirúrgica em momentos específicos.

Coleta e medição Mediadores nociceptiva e inflamatória em feridas cirúrgicas

Algoritmos de avaliar o limiar da dor de calor e mecânica em pele inflamada experimentalmente humana dos sujeitos do estudo são mostradas. Os dois paradigmas testes dor independente examine processamento nociceptivo pelas duas grandes populações de fibras nervosas periféricas transmissão de dor, ou seja, as fibras não-mielinizadas C e pequenas mielinizadas A-delta fibras.

Determinar o calor e limiar de dor mecânica em pele inflamada de seres humanos

Este vídeo demonstra a quantificação de mediadores inflamatórios durante a infecção, incubando células imunes derivadas do tecido pulmonar humano com Haemophilus influenzae. A citometria de fluxo é usada para medir a fluorescência de citocinas em linfócitos marcados, correlacionando-se com a produção de citocinas pró-inflamatórias em resposta à infecção bacteriana.

Quantificação de mediadores inflamatórios em células derivadas de tecidos humanos infectados

A fim de estudar as alterações de fibras nervosas intra-epidérmica nociceptivos (IENFs) em neuropatias dolorosas (PN), protocolos que nós desenvolvemos pode examinar directamente as alterações morfológicas observadas tridimensionais em IENFs nociceptivos. Análise tridimensional de IENFs tem o potencial de avaliar as alterações morfológicas de IENF na PN.

Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

Nós descrevemos um método de imagem não-invasivo para distinguir as fases inflamatórias. Administração sistêmica de luminol revela áreas de inflamação aguda dependentes atividade da MPO em neutrófilos. Em contraste, a injeção de lucigenina permite a visualização de inflamação crônica dependente de atividade Phox em macrófagos.

No método de imagem in vivo Distinguir inflamação aguda e crônica

Nós descrevemos um protocolo para examinar o desenvolvimento da hiperalgesia e tolerância em ratos induzida por opióides. Com base na medição das respostas nociceptivas térmicas e mecânicas de animais naive e tratados com morfina, que permite quantificar o aumento da sensibilidade à dor (hiperalgesia) e diminuir na analgesia (tolerância) associada à administração de opiáceos crónica.

Avaliação da hiperalgesia induzida por morfina e analgésicos Tolerância em ratos usando térmicas e mecânicas nociceptivos Modalidades

Este documento explica a aplicação de imagem fluorescente usando uma sonda de imagiologia óptica activável para visualizar a actividade in vivo de metaloproteinases de matriz chave em dois modelos experimentais diferentes de inflamação.

Non-invasive<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescência de imagem óptico de Inflamatória MMP Atividade Usando um Agente de Imaging Activatable fluorescente

As alterações morfológicas ocorrem em células de fibroblastos imunes responsivos após a ativação e promovem alterações no recrutamento celular. Utilizando a imagem latente do Photon 2 conjuntamente com uma proteína fibroblástica-específica geneticamente projetada 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-parar-floxed (TB/TB) linha do mouse e verde cDNAs Tagged lipopolissacarídeo-FITC, podemos ilustrar a captação altamente específica de lipopolissacaríno em fibroblastos dérmicos e alterações morfológicas in...

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

Um protocolo padrão é descrito para estudar a atividade antitumoral e a toxicidade associada da IL-1α em um modelo singênico de camundongo de HNSCC.

Avaliação da Atividade Antitumoral In vivo de Nanopartículas de Polianidrido IL-1α

Métodos imunoquímicos estabelecidos para medir transmissores de peptídeos in vivo dependem de microdiálise ou desenho de fluido a granel para obter a amostra para análise offline. No entanto, estes sofrem de limitações espessotemporais. O presente protocolo descreve a fabricação e aplicação de um biosensor de imunoprobe capacitivo que supera as limitações das técnicas existentes.

Medição in vivo de neuropeptídeos por imunoprobe capacitivo no coração suíno

O protocolo descreve como medir a hiperalgesia do joelho em camundongos. Mostramos exemplos em modelos de camundongos de dor aguda no joelho, bem como em modelos de osteoartrite (OA).

Avaliação da hiperalgesia do joelho em camundongos usando medição de aplicação de pressão

Aprenda a coletar fluido intersticial de pele inflamada usando microdiálise em humanos. Este método permite analisar mediadores nociceptivos e inflamatórios em amostras armazenadas a -80°C para estudos de neurociência.

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