Nós apresentamos um método para gerar cDNA de mRNA ambiental. Em geral, o total de RNA é a primeira coletados do ambiente, rRNA é seletivamente removido, mRNA é seletivamente amplificado, e cDNA sintetizado a partir do pool de mRNA enriquecido é seqüenciado. Seqüências recuperadas podem ser anotados usando técnicas padrão de bioinformática para identificar os genes expressos.
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Artigo de método
Analisando Expressão Gênica de comunidades microbianas Marinha usando transcriptômica Ambiental
Neste artigo
Resumo
Resumo
Análogo a metagenômica, transcriptômica ambiental (metatranscriptómica) recupera e seqüências de mRNAs ambientais a partir de um assemblage microbiana sem o conhecimento prévio do que genes a comunidade pode estar expressando. Assim, ele fornece a perspectiva mais imparcial sobre a expressão gênica comunidade
Protocolo
Trabalhando com RNA
RNases porque são ubíquos e mRNAs degradam rapidamente, precauções padrão para trabalhar em um ambiente livre de ribonuclease devem ser seguidos e as amostras devem ser processados ou conservados, assim como a recolha seguintes possível.
Parte 1: Environmental RNA Collection (concebido para recolher a biomassa na fração de tamanho 0,2-3,0 mm)
Suprimentos necessários:
Tubulação Masterflex
Bomba peristáltica
3 mm de alto volume de filtro plissado cápsula
0,22 mM Supor ou policarbonato 142 milímetros filtro
142 mi....
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Discussão
A investigação da expressão gênica por comunidades microbianas naturais tem se tornado comum nos últimos anos como um meio para explorar os papéis e funções ecológicas dos microrganismos. Usado em combinação com a detecção, quantificação e caracterização de microrganismos marinhos, análises de expressão gênica pode ser usada para ligar filogenia para funcionar em comunidades microbianas naturais. Muitas técnicas para orientar a expressão do gene funcional contar com sondas específicas ou conjuntos primário projetado par.......
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Agradecimentos
O financiamento foi fornecido pela The Gordon e Betty Moore Foundation concede e da National Science Foundation conceder MCB-0702125.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Tubos de esferas PowerSoil | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| Kit RNeasy Mini | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| Kit de Isolamento de mRNA Procarionte mRNA-ONLY | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| Kit de Enriquecimento de mRNA Bacteriano MICROBExpress | kit | Ambion | AM1905 | |
| Kit MICROBEnrich | kit | Ambion | AM1901 | |
| Kit de Amplificação de RNA Bacteriano MessageAmp II | kit | Ambion | AM1790 | |
| Sistema Universal de Síntese de cDNA RiboClone | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Sistema Wizard de Purificação de DNA | kit | Promega Corp. | A7280 |
Referências
- Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsk....
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Reimpressões e permissões
