$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Antes de começar a
- Todas as culturas devem ser cultivadas a 25 ° C.
- HL3.1 tampão dissecção pode ser preparado com antecedência. Dê uma alíquota de 50 ml de HL3.1 e mantê-lo no gelo.
- Prepare 15 ml de formaldeído 3,5% fresco em HL3.1. Mantê-lo no gelo.
Dissecação das larvas
- Coloque uma gota de HL3.1 fria na placa de dissecção. Isto irá manter o animal de secagem e atordoar o animal tornando-o mais fácil de trabalhar.
- Usando a pinça longa, selecione um errante larva de terceiro instar e coloque-o na queda de HL3.1.
- Primeiro, utilize uma pinça curta para agarrar um alfinete minutien. Coloque o pino entre os espiráculos posteriores. O animal normalmente irá tentar arrastar para longe o pino estendendo-se para fora e tornando mais fácil para você colocar um pino diretamente na cabeça da larva perto os ganchos na boca. Estique o animal no sentido longitudinal. Isso irá ajudá-lo a maximizar a quantidade de parede do corpo exposto você pode conseguir durante o corte. Nota: Se você optar por fixar a cabeça primeiro, o animal pode envolver seu corpo em torno do pino ou chicote o seu corpo para trás e para frente o que dificulta a pino. Geralmente você pode contrariar esta removendo o HL3.1 e colocando uma gota limpa e fria impressionante o animal novamente. O cientista ambidestro também pode simplesmente pegar o animal e mantê-lo no lugar.
- Tesoura primavera, utilizando fazer uma incisão horizontal logo anterior ao pino posterior no lado dorsal da larva. Coloque uma lâmina da tesoura na incisão e fazer um corte vertical ao longo da linha média dorsal até o final rostral da larva. Na tribuna do animal fazer incisões horizontal para a esquerda e direita do pino. Nota: o resultado final deverá ser parecido com um I do lado dorsal da larva ao longo do eixo rostro-caudal.
- Remover os órgãos. Comece por colocar várias quedas adicionais da HL3.1 na larva. Isso permitirá que os órgãos de flutuar para fora do corpo que lhe permite removê-los muito mais facilmente. Primeiro, remova o sistema traqueal. Em segundo lugar, use a pinça para pegar o resto dos órgãos e removê-los.
- Durante a etapa 3, você fez um flap flap esquerdo e direito na parede do corpo. Pin as abas em uma ordem no sentido horário certificando-se de esticar a parede do corpo tanto horizontalmente quanto verticalmente.
Fixação
Fix cada animal em formol 3,5% em HL3.1 por 25 minutos. Lavar o animal duas vezes na HL3.1 por 5 minutos.
Armazenamento
Remova os pinos e transferir as larvas a um tubo de 1,5 ml contendo 1X PBS. Se você pretende usar a imagem do MNJ fundido etiquetas fluorescentes, você deve imagem dos animais dentro de dois dias. Você pode armazenar as larvas dissecadas por até uma semana a 4 ° C.
Resultados representativos
Existem vários componentes chave de uma larva Drosophila devidamente dissecado. Primeiro, é preciso tomar cuidado extra para não danificar os músculos, principalmente os músculos 4, 6 e 7. Estes são os músculos mais populares de estudar e se eles forem danificados descartar a prep filé e dissecar um outro animal. Em segundo lugar, é preciso se certificar de que o animal é esticado ao máximo para que cada músculo e MNJ podem ser distinguidos.