Drosophila larval Dissection MNJ

Resumo

Este protocolo demonstra como dissecar Drosophila Larvas em preparação para imuno-histoquímica e / ou imagem da junção neuromuscular.

Protocolo

Antes de começar a

1. Todas as culturas devem ser cultivadas a 25 ° C.
2. HL3.1 tampão dissecção pode ser preparado com antecedência. Dê uma alíquota de 50 ml de HL3.1 e mantê-lo no gelo.
3. Prepare 15 ml de formaldeído 3,5% fresco em HL3.1. Mantê-lo no gelo.

Dissecação das larvas

1. Coloque uma gota de HL3.1 fria na placa de dissecção. Isto irá manter o animal de secagem e atordoar o animal tornando-o mais fácil de trabalhar.
2. Usando a pinça longa, selecione um errante larva de terceiro instar e coloque-o na queda de HL3.1.
3. Primeiro, utilize uma pinça curta para agarrar um alfinete minutien. Coloque o pino entre os espiráculos posteriores. O animal normalmente irá tentar arrastar para longe o pino estendendo-se para fora e tornando mais fácil para você colocar um pino diretamente na cabeça da larva perto os ganchos na boca. Estique o animal no sentido longitudinal. Isso irá ajudá-lo a maximizar a quantidade de parede do corpo exposto você pode conseguir durante o corte. Nota: Se você optar por fixar a cabeça primeiro, o animal pode envolver seu corpo em torno do pino ou chicote o seu corpo para trás e para frente o que dificulta a pino. Geralmente você pode contrariar esta removendo o HL3.1 e colocando uma gota limpa e fria impressionante o animal novamente. O cientista ambidestro também pode simplesmente pegar o animal e mantê-lo no lugar.
4. Tesoura primavera, utilizando fazer uma incisão horizontal logo anterior ao pino posterior no lado dorsal da larva. Coloque uma lâmina da tesoura na incisão e fazer um corte vertical ao longo da linha média dorsal até o final rostral da larva. Na tribuna do animal fazer incisões horizontal para a esquerda e direita do pino. Nota: o resultado final deverá ser parecido com um I do lado dorsal da larva ao longo do eixo rostro-caudal.
5. Remover os órgãos. Comece por colocar várias quedas adicionais da HL3.1 na larva. Isso permitirá que os órgãos de flutuar para fora do corpo que lhe permite removê-los muito mais facilmente. Primeiro, remova o sistema traqueal. Em segundo lugar, use a pinça para pegar o resto dos órgãos e removê-los.
6. Durante a etapa 3, você fez um flap flap esquerdo e direito na parede do corpo. Pin as abas em uma ordem no sentido horário certificando-se de esticar a parede do corpo tanto horizontalmente quanto verticalmente.

Fixação

Fix cada animal em formol 3,5% em HL3.1 por 25 minutos. Lavar o animal duas vezes na HL3.1 por 5 minutos.

Armazenamento

Remova os pinos e transferir as larvas a um tubo de 1,5 ml contendo 1X PBS. Se você pretende usar a imagem do MNJ fundido etiquetas fluorescentes, você deve imagem dos animais dentro de dois dias. Você pode armazenar as larvas dissecadas por até uma semana a 4 ° C.

Resultados representativos

Existem vários componentes chave de uma larva Drosophila devidamente dissecado. Primeiro, é preciso tomar cuidado extra para não danificar os músculos, principalmente os músculos 4, 6 e 7. Estes são os músculos mais populares de estudar e se eles forem danificados descartar a prep filé e dissecar um outro animal. Em segundo lugar, é preciso se certificar de que o animal é esticado ao máximo para que cada músculo e MNJ podem ser distinguidos.

Discussão

A técnica de dissecação demonstrou neste vídeo pode ser usado para preparar larvas Drosophila para uma variedade de técnicas experimentais. Se as tags proteína fluorescente estão presentes, as larvas podem ser montados e representado imediatamente. Caso contrário, imunocoloração podem ser realizadas a fim de marca específica compartimentos sináptica. Além disso, eletrofisiologia pode facilmente ser executada no larvas dissecadas para avaliar o funcionamento da neurotransmissão.

O MN...

Materiais

HL3 buffer Dissection: (em mM) 70 NaCl, KCl 5, 0,2 CaCl2, MgCl2 20, 10 NaHCO3, 5 trealose, 115, sacarose e 5 HEPES, pH 7.3.
Placa Sylgard Dissecando: Misture delicadamente (para evitar bolhas) 10:01 num copo. Despeje a mistura em Placa de Petri (qualquer tamanho). Permitir Sylgard para curar durante a noite em 37C incubadora.