Volume grande (20L +) Filtração das amostras Seawater Coastal

Resumo

Este vídeo volume de documentos grandes (≥ L 20) de filtragem da biomassa microbiana, variando entre 0.22μm e 2.7μm de diâmetro, a partir da coluna de água.

Resumo

O fluxo de trabalho começa com a recolha de águas marinhas costeiras para a comunidade microbiana a jusante, as análises de nutrientes e gases traço. Para este método, as amostras foram coletadas a partir do convés do HMS operacional John Strickland em Inlet Saanich. Este vídeo volume de documentos grandes (≥ L 20) de filtragem da biomassa microbiana, variando entre 0.22μm e 2.7μm de diâmetro, a partir da coluna de água. Duas amostras de 20L podem ser filtrados simultaneamente usando uma unidade de bomba simples equipados com quatro cabeças rotativas. Filtração é feito no campo em viagens longas, ou imediatamente após o retorno para viagens curtas. É importante registrar a quantidade de água que passa através de cada unidade de filtro sterivex. Para evitar a formação de biofilme entre viagens de amostragem, todos os equipamentos de filtração deve ser lavado com HCl diluído e água deionizada e autoclavada imediatamente após o uso. Este procedimento levará aproximadamente cinco horas, mais uma hora adicional para a limpeza.

Protocolo

1. Instalação de aparelho de filtração
   1. Para configurar o aparelho de filtração, use uma pinça para colocar uma grade GF / D filtro na unidade de habitação pré-filtro. Vagamente apertar a habitação com a mão. Como regra geral, não aperte demais ou a unidade vai vazar uma vez que o começa a pulsar.
   2. Recoloque a tampa garrafão com a tampa autoclavada e tubos ligados com cuidado de inserir o tubo interno para o garrafão sem tocá-lo. Se necessário, use uma pinça para guiar o tubo no garrafão.
   3. Passe a tubulação externa através da bomba peristáltica.
   4. Anexar unidades habitacionais pré-filtro para o fim de ambos os tubos externos (ou seja, 2 unidades por garrafão). Aperte a conexão com um alicate.
2. Filtração da água do mar
   1. Para começar a filtrar a água do mar, ligue a bomba e definir a velocidade de fluxo para 1. Relógio para garantir que a água está sendo bombeado na direção correta.
   2. Permitir que 500 ml de água para fluir livremente através da unidade de pré-filtro e em um copo de 1 litro.
   3. Desligar a bomba, e anexar um filtro Sterivex ao encaixe macho luer na extremidade livre de configuração pré-filtro. Aperte o confortavelmente de habitação pré-filtro com a mão.
   4. Preste atenção para a habitação pré-filtro e na ligação entre a caixa pré-filtro ea tubulação que leva ao garrafão. Se ocorrer vazamentos, desligar a bomba e soltar e apertar novamente o pré-filtro de habitação em conformidade. Ligar a bomba novamente.
   5. Recolher o filtrado em 4 frascos L. Uma vez cheios, os frascos vazios em um garrafão limpo. Certifique-se de anotar o volume passou por cada filtro. Coletados filtrado pode ser processado, como filtragem de vírus.
   6. Continue até que não haja filtragem da água é deixada no garrafões. Usuais de filtração gama vezes entre 4-5 h / 20 carboy L, no entanto, isso depende de forma dramática na quantidade de biomassa dentro da água.
   7. Uma vez que a filtração é completa, ligue a bomba e desconecte os filtros Sterivex.
3. Armazenamento do filtro
   1. Para armazenar os filtros, primeiro expulsar qualquer água restante com uma seringa ml 30-60.
   2. Com uma pipeta, adicionar tampão de lise 1.8ml para o filtro, mantendo ~ ul 200 de espaço no filtro para adição posterior de reagentes.
   3. Seal parte inferior e superior do filtro Sterivex com um pequeno pedaço de parafilme, e rotular os filtros com a data ea identificação da amostra.
   4. Armazenar os filtros em 50 ml de pré-rotulados tubo falcon a -80 ° C
   5. Remover os filtros da unidade habitacional e colocá-los em tubos de 50 ml rotulados Falcon contendo 2 ml de tampão de lise. Armazenar estes a -80 ° C.
4. Limpeza
   1. Para limpeza final, coloque o tubo que estava dentro do garrafão em um frasco contendo 0,1 M HCl
   2. Direcionar o tubo que levam ao balão 4L no garrafão original.
   3. Ligue a bomba e executar a 3, coletando o fluxo através executado no garrafão original.
   4. Finalmente, lavar o tubo com água esterilizada.

Resultados Representante: O resultado final consiste em dois filtros Sterivix cada um contendo biomassa microbiana de aproximadamente 10 L de água do mar na faixa de tamanho de 0.22μm e 2.7μm. Este é armazenado em tampão de lise e pronto para a extração de DNA. Além disso, este procedimento recolhe e concentra biomassa maior do que 2,7 mM, sobre o pré-filtros GF / D. Este também é armazenado em tampão de lise e pronto para a extração de DNA. Se as etapas de processamento adicional são tomadas, a 0,22 mM de fluxo pode ser concentrada até recolher a fração viral também.

Discussão

É imperativo para limpar os bancos e as bombas com uma toalha úmida após o uso para remover qualquer vestígio remanescente de água salgada que de outra forma corroer equipamentos. Embora o procedimento é simples, o requisito de tempo pode ser extensa, dependendo da concentração de biomassa ou resíduos na amostra que está sendo filtrado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bomba peristáltica		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tubo Tygon LFL		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	Para o aparelho de filtração
Abraçadeiras de mangueira		Cole-Parmer	0683204	Para o aparelho de filtração
Adaptadores de tubo 1/4” x 3/16”		Cole-Parmer	31702-20	Para o aparelho de filtração
Corpo do pré-filtro de polipropileno		ADVANTEC	501200	Para o aparelho de filtração
Conector metálico luer (extremidade de mangueira para luer lock macho)		Cole-Parmer	31507-27	Para o aparelho de filtração
Ímãs de 2“			Para o aparelho de filtração
Tampas de garrafão com 3 entradas				Para o aparelho de filtração
Filtros GV 0,22 μm STERIVIX		EMD Millipore	SVGV01R5
Filtros GF/D de 47 mm de diâmetro e 2,7 μm		Whatman, GE Healthcare	1823047
Tampão de lise	Reagente			0,75 M de sacarose, 40 mM de EDTA, 50 mM de Tris (pH 8,3)
HCl 0,1 %	Reagente			Para enxágue pós-filtração
Água autoclavada	Reagente			Para enxágue pós-filtração