Este vídeo volume de documentos pequenos (~ L 1) de filtragem da biomassa microbiana da coluna de água.
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Artigo de método
Volume pequenas (1-3L) Filtragem de Amostras de Água do Mar Coastal
Neste artigo
Resumo
Resumo
O fluxo de trabalho começa com a recolha de águas marinhas costeiras para a comunidade microbiana a jusante, as análises de nutrientes e gases traço. Para amostras de demonstração de hoje foram coletados a partir do convés do HMS operacional John Strickland em Inlet Saanich. Este vídeo volume de documentos pequenos (~ L 1) de filtragem da biomassa microbiana da coluna de água. O protocolo é uma extensão do protocolo de amostragem de grande volume descrito anteriormente, com uma grande diferença: aqui, não há nenhuma etapa de pré-filtração, por isso todas as classes de tamanho de biomassa são coletados até a 0,22 mM de corte do filtro. Amostras coletadas dessa forma são ideais para análise de ácidos nucléicos. Passos que o set-up de filtração, e clean-up, cada um leva cerca de 20-30 minutos. Se usar duas bombas peristálticas, simultaneamente, até 8 amostras podem ser filtradas, ao mesmo tempo. Para evitar a formação de biofilme entre viagens de amostragem, todos os equipamentos de filtração deve ser lavado com HCl diluído e água deionizada e autoclavada imediatamente após o uso.
Protocolo
- Instalação de aparelho de filtração
- Antes de filtrar, primeiro limpe a condensação das garrafas cheias e pesá-los
- Coloque uma autoclave bin em um lado da bomba, eo frasco de resíduos no outro.
- Em seguida, coloque uma garrafa de amostra completa no lixo autoclave, no entanto, não retire a tampa da garrafa ainda.
- Passe a tubulação através da bomba peristáltica de modo que o fim luer do tubo é no frasco.
- Com uma pinça, remover o algodão de uma pipeta estéril de 25 ml, e anexar a pipeta para a outra extremidade do tubo.
- Filtração da água do mar
- Para começar a filtragem da água do mar, abrir a garrafa e inserir a pipeta. Ligue a bomba e definir a velocidade de fluxo para 1. Relógio para garantir que a água está sendo bombeado na direção correta.
- Permitir ~ 100 ml de água para passar através do tubo inteiro.
- Desligar a bomba e coloque um filtro Sterivex ao encaixe macho luer na extremidade livre do tubo.
- Continue até que não filtragem de água que resta na garrafa.
- Armazenamento do filtro
- Para armazenar os filtros, primeiro expulsar qualquer água restante com uma seringa ml 30-60.
- Vedação na parte inferior do filtro Sterivex com Parafilm. Com uma pipeta, adicionar tampão de lise 1.8ml para o filtro, mantendo ~ ul 200 de espaço no filtro para adição posterior de reagentes.
- Depois, fechar a parte superior do filtro Sterivex com um pequeno pedaço de parafilme, e rotular os filtros com a data ea identificação da amostra.
- Armazenar os filtros pré-rotulados tubos de 50 ml falcon a -80 ° C
- Limpar
- Inserir a pipeta de 25 ml em um frasco contendo 0,1% HCl, e ligar a bomba.
- Após a lavagem HCl, lavar o tubo com água esterilizada.
Finalmente, medir e registrar a massa de garrafas de 1L agora vazia, a fim de calcular o volume de água passou pelo filtro.
Resultados Representante: Cada uma amostra de água L produz um Sterivix filtro, que contém a biomassa superior a 0,22 mM. Este é armazenado em tampão de lise para extração de DNA e análise posterior. O resultado final consiste de um filtro Sterivix por 1 litro garrafa armazenados em tampão de lise e pronto para a extração de DNA. O filtro contém biomassa superior a 0,22 mM. Os filtros podem ser armazenadas a -80 ° C antes da extração Edna.
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Discussão
É imperativo para limpar os bancos e as bombas com uma toalha úmida após o uso para remover qualquer vestígio remanescente de água salgada que de outra forma corroer equipamentos. Embora o procedimento é simples, o requisito de tempo pode ser extensa, dependendo da concentração de biomassa ou resíduos na amostra que está sendo filtrado.
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Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. DAW foi apoiado por bolsas de NSERC, Killam ea fundação TULA Centro financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bomba peristáltica | Masterflex (Cole Palmer) | 77913-20, 77200-62, 77200-04 | |
| Tubo Tygon LFL | Masterflex (Cole Palmer) | 06429-24 | Para o aparelho de filtração |
| Abraçadeiras de mangueira | Cole-Parmer | 0683204 | Para o aparelho de filtração |
| Adaptadores de tubo 1/4” x 3/16” | Cole-Parmer | 31702-20 | Para o aparelho de filtração |
| Corpo do pré-filtro de polipropileno | ADVANTEC | 501200 | Para o aparelho de filtração |
| Conector metálico luer (extremidade de mangueira para luer lock macho) | Cole-Parmer | 31507-27 | Para o aparelho de filtração |
| Ímãs de 2“ | Para o aparelho de filtração | ||
| Tampas de garrafão com 3 entradas | Para o aparelho de filtração | ||
| Filtros GV 0,22 μm STERIVIX | EMD Millipore | SVGV01R5 | |
| Filtros GF/D de 47 mm de diâmetro e 2,7 μm | Whatman, GE Healthcare | 1823047 | |
| Tampão de lise | 0,75 M de sacarose, 40 mM de EDTA, 50 mM de Tris (pH 8,3) | ||
| HCl 0,1% | Para enxágue pós-filtração | ||
| Água autoclavada | Para enxágue pós-filtração |
Reimpressões e permissões
