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1. Do sangue periférico mononuclear cela de isolamento (PBMC)
- Obter uma amostra de sangue - sangue deve ser coletado em seringas ou tubos de sangue e anti-coagulado com heparina (1:50 ratio) para prevenir a coagulação. Esperar um rendimento de cerca de 1 × 10 6 PBMC por mL de sangue - cerca de 40% dos quais serão CD4 positivos (CD4 +) células T.
- Alíquota do sangue em tubos cônicos de 50 mL, 25 mL por tubo. Se o sangue tem separado, misture suavemente antes de alíquotas para distribuir o plasma
- Adicionar PBS, elevando o volume total de 40 mL e underlay através da elaboração de 11 mL de Ficoll, inserindo no tubo de sangue, e com cuidado retirar a ajuda da pipeta pipeta. O Ficoll irá drenar lentamente para o fundo do tubo. Uma vez que o nível tem empatou, lentamente, remova a pipeta do tubo de sangue e descartar.
- Cap os tubos de sangue e passar para as latas Aerosolve. Feche as vasilhas e centrifugar a 900 × g por 20 minutos - sem freio. É fundamental que nenhum freio é aplicado no final desta rodada como a força de travagem vai perturbar a camada de células.
- Após a rodada, os PBMCs devem formar uma camada distinta em branco entre o plasma amarelo (acima) e Ficoll transparente (abaixo). Suavemente escumar camada de células brancas do sangue usando uma pipeta e transferir para novo tubo. Alguns plasma e Ficoll pode ser elaborado com a PBMCs, mas evitar a elaboração de qualquer um dos camada de células vermelhas. Normalmente, dois tubos de sangue podem ser combinados em um tubo de células nesta etapa para aumentar o tamanho da pelota.
- Adicionar PBS, elevando o volume total de 50 mL e centrifugar a 500 × g por 15 minutos - de freio baixo em vasilhas aerosolve.
- Aspirar líquido utilizando uma pipeta Pasteur, tomando cuidado para não perturbar o pellet
- Tratar com tampão hemolítica adicionando 5-6 mL de cada tubo e misturar delicadamente para remover coágulos. Incubar por não mais que 5 minutos.
- Adicionar PBS, elevando o volume total de 50 mL e centrifugar a 230 × g por 10 minutos - de freio baixo. Vasilhas Aerosolve não são mais necessários para esses spins mais lento.
- Lave duas vezes: Aspirar líquido utilizando uma pipeta Pasteur, preencha tubo com PBS e centrifugar a 230 × g por 10 minutos.
- Antes da etapa de lavagem final, retire uma alíquota de re-suspensão de células, diluir com azul de tripano, e contar com um hemocitômetro. Esta contagem de células vai ditar os volumes de reagentes utilizados na etapa de separação de células T.
2. CD4 + T * separação de células
- Aspirar líquidos e adicionar tampão de corrida para trazer o volume total de até 40 uL por 10 milhões de células. Normalmente, isso requer 30 uL de tampão mais o volume de pelotas residual.
- Transferir este volume para um tubo cônico de 15 mL.
- Adicionar cocktail anticorpo do kit de isolamento CD4 - 10 uL por 10 milhões de células, tubo de tampa, e colocar no gelo por 10 minutos
- Retire o tubo do gelo, retire a tampa e adicionar 30 uL de tampão de corrida por 10 milhões de células
- Adicionar esferas magnéticas do kit de isolamento CD4 - 20 uL por 10 milhões de células, tubo de tampa, e colocar no gelo por 15 minutos
- Adicionar dez volumes de tampão de corrida para lavar e centrifugar a 230 × g por 10 minutos.
- Durante a rodada, configurar o ímã e 5 mL em tubo de polipropileno seu espaço de trabalho
- Aspirar líquido de pellet celular, adicione 2 mL de tampão execução e remover pedaços usando uma pipeta
- Usando a mesma pipeta de transferência, a transferência de células dentro do tubo de 5 mL e incubar no ímã para 15 minutos
- Decantar com precaução o CD4 + fração de células em um tubo de 15 mL marcada pelo ímã invertendo o esvaziamento e todos, mas a última gota
- Acrescentar ainda 2 ml de tampão de corrida para o tubo de 5 mL e retire do ímã
- Gentilmente lavar o CD4-células fora dos lados do tubo e transferir para um tubo de 15 mL marcada
- Adicionar 2 mL médio de células T a cada tubo, remova alíquotas para contagem de células e centrifugar a 230 × g por 10 minutos.
- Diluir alíquotas celular com azul de tripano e contar com um hemocitômetro. Estas contagens de células vai ditar o número de poços utilizados para a etapa de expansão da cultura.
* Alternativamente, MACS colunas e contas (Miltenyi Biotec), o separador de células AutoMACS (Miltenyi Biotec), ou Robosep separador de células (Cell Stem Technologies) pode ser usado de acordo com instruções fabrica no lugar de passos 2,2-2,11.
3. Cultivo in vitro de Expansão
- Aspirar o líquido do CD4 + e de células CD4 e pellets, com base na contagem de células, adicionar meios de cultura (tipicamente 3 milhões CD4 + células por mL e 10 milhões de CD4-células por mL funciona bem para criar a cultura). A cultura de expansão requer 3-5000000 CD4-células por poço e 2-3000000 CD4 + células por poço em um volume total de 1 mL da cultura em media uma placa de cultura de 48 também. Normalmente, células CD4 + estão limitando a população
- Se desejar, irradiar os CD4-células (5000 Rad s). Alíquota CD4-células para o número apropriado de poços em um prato bem, adicionando 48 mL a cada 300-500. Coloque a placa em uma incubadora de 37 ° C por 1 hora. O aderente CD4-células servirão como células apresentadoras de antígenos na cultura de expansão.
- Remova a placa da incubadora.
- Lavar os poços por adição de 500 uL de mídia fresco e cuidado pipetando para cima e para baixo 12-20 vezes usando uma pipeta de transferência e remoção de todo o líquido. Esta lavagem vai deixar para trás uma camada de células aderentes antígeno apresentando.
- Quando a lavagem estiver completa, adicione mídia apenas o suficiente para molhar a parte inferior de cada bem (cerca de 100 uL) - caso contrário, as células aderentes vai secar
- Adicionar 2-3000000 células CD4 + a cada poço. Se necessário, adicione mídia adicional para trazer o volume total em cada poço até 1 mL.
- Adicione o peptídeo desejado para cada poço. A concentração típica para a estimulação é de 10 ug / mL final.
- Colocar a placa em uma incubadora de 37 ° C por 7 dias.
- Após 7 dias, adicionar 50 uL de Hemogen IL-2 (ou equivalente, como recombinante IL-2, 10 IU / mL) a cada poço.
- Em cada dia subseqüente, monitorar o crescimento de células usando um microscópio. Alimentar poços que ainda não são confluentes, removendo metade dos media, acrescentando novas mídias e 50 uL de IL-2. Dividir poços confluentes pela ressuspensão das células, movendo-se metade das células para um poço vazio, agregando novas mídias e 50 uL de IL-2. Retorno células a incubadora.
- As células expansão estará pronto para tetrâmero após 13-15 dias de cultura.
4. Visualizando células T através da coloração tetrâmero
- Comprar ou montar tetrâmeros para combinar com as combinações de peptídeo / MHC que correspondem à CD4 + estimulou as células T (veja a discussão de fontes de reagentes tetrâmero). Tetrâmeros devem ser ~ 0,5 mg / mL.
- Retire a placa da incubadora
- Cuidadosamente a tirar metade dos meios de comunicação de cada poço
- Transferir uma alíquota de células de cada poço - geralmente 75 mL ou cerca de 50 mil células - em um tubo de poliestireno 5 mL FACS
- Adicionar tetrâmero - tipicamente mL 1 por 50 volume de mL total - e colocar em 37 ° C incubadora de 1-2 horas. Também é aconselhável a manchar uma alíquota de segundo de células de cada poço com um tetrâmero incompatíveis como controle negativo.
- Células etiqueta com anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD25 anticorpos adicionando 30-10 mL de cada anticorpo. Marcadores de anticorpos adicionais ou alternativos podem ser usados. No entanto, não use anticorpos PE rotulados desde que este canal deve ser reservado para o tetrâmeros. Neste momento, também único rótulo controles de cor ou isotipo usando células extra.
- Células anticorpo rotulado incubar por 15-30 minutos em gelo ou a 4 ° C.
- Lavar cada tubo com 0,5 a 2 mL tampão de corrida e centrifugar a 230 × g por 10 minutos.
- Cuidadosamente decantar líquidos a partir de tubos FACS. Armazenar todos os tubos em um recipiente coberto (de preferência no gelo) para análise FACS subseqüentes.
5. Aquisição e Análise de fluxo citómetro
- Calibrar O citómetro usando pérolas de referência.
- Verifique as configurações do instrumento:
- Usando células controle imaculada ou controles isotipo, ajustar a localização da porta de linfócitos viáveis (FSC versus SSC). Remover auto-fluorescência de todos os canais pela centralização da população (alterando as configurações ganho) abaixo da primeira década em cada eixo.
- Usando tubos de cor única de controle, centro de eventos dentro da quadrantes correto para cada cor (alterando as configurações de compensação).
- Fazer um ajuste fino das configurações do instrumento usando um tubo manchado com um tetrâmero irrelevante. Em configurações específicas para o canal de PE podem precisar de ajustes, porque muitas vezes tetrâmeros mancha mais brilhante do que o controle de anticorpos. O tetrâmero irrelevantes devem mancha <0,5% das células CD4 +.
- Aquisição de dados para cada tubo
- Coletar eventos para cada tubo de amostra e tubo de controle negativo
- Adquirir e salvar pelo menos 20.000 eventos para Analysys
- Analisar os dados
- Importar arquivos de dados em FACS software de análise (por exemplo, software CellQuest, WinMDI, ou programa FlowJo). Comece sua análise através de um tubo manchado usando um tetrâmero irrelevante.
- Plot FSC versus SSC e desenhar uma porta em torno dos linfócitos ao vivo (Figura 1, o painel superior esquerdo).
- CD4 trama contra CD3 (linfócitos gated para mostrar ao vivo apenas) e desenhar portas em todo o CD3 + e CD4 + populações (Figura 1 painel superior direito).
- CD4 enredo vs tetrâmero (gated para mostrar linfócitos CD3 + somente) e estabelecer os limites para que o quadrante CD4 + + tetrâmero população é menos de 0,5% (Figura 1 painel inferior esquerdo).
- Plot CD25 versus tetrâmero (gated para mostrar linfócitos CD4 + apenas) e definir os limites do quadrante de modo que o CD25 + + tetrâmero população é inferior a 0,5% (Figura 1 painel inferior direito).
- Analisar todos os tubos de amostra, sem alterar as portas.
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Figura 1. Representante controlo negativo resultados de coloração tetrâmero. O painel superior esquerdo mostra a frente scatter scatter lado versos eo portão tamanho de linfócitos (R1). O painel superior direito é fechado para R1 e mostra ant-CD4 versus anti-CD3 e CD3 + (R2) e CD4 + (R3) portões. O painel inferior esquerdo é fechado para R2 e shows anti-CD4 contra tetrâmero. O painel inferior direito é fechado para R3 e shows anti-CD25 contra tetrâmero. Os quadrantes para ambos os lotes tetrâmero foram ajustados para 0,5%.
6. Resultados representante
- As células tetrâmero positivo deve ser uma população distinta entre as células CD4 + expandido (Figura 2).
- Tetrâmero células positivas são geralmente CD25 + CD4 e, muitas vezes elevados.
- Em alguns casos, uma combinação MHC / peptídeo pode dar coloração de fundo (geralmente causadas por um peptídeo com baixa solubilidade). Coloração de fundo como pode ser diferenciado de um verdadeiro positivo porque o "falso positivo" células não são uma única população distinta em ambos os CD4 vs tetrâmero ou o CD25 versus parcelas tetrâmero (Figura 3).
Figura 2. Coloração resultados positivos Representante tetrâmero. O layout do painel e da estratégia de propagação são idênticos a Figura 1. As células tetrâmero positivos aparecem como uma população distinta CD4 elevado na CD4 anti-versus tetrâmero painel e uma distinta população CD25 + sobre o anti-CD25 contra painel de tetrâmero.
Figura 3. Representante "falsos positivos" os resultados da coloração tetrâmero. O layout do painel e da estratégia de propagação são idênticos a Figura 1. O CD4 anti-versus painel mostra um tetrâmero coloração indistinta "mounded". O anti-CD25 contra tetrâmero mostra também uma coloração "mounded", sem tendência clara em direção a ser CD25 +.