Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 2 de 3.
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Artigo de método
Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 2
Neste artigo
Resumo
Protocolo
Parte 1: síntese de cDNA a partir de RNA
- Antes de usar o Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, adicionar o volume recomendado de etanol a 100% para os buffers de lavagem.
- PCR em tubo de reação, adicione entre 100ng de 5μg de RNA total e 1μl de T7 oligo primer (dT). Trazer o volume até 12μl com água livre de nuclease.
- Incubar as amostras a 70 ° C por 10 min em um termociclador.
- Remover amostras de RNA a partir de 70 ° C e centrifugar brevemente. Colocar no gelo.
- Preparar o 1 º Strand master mix Síntese e manter a temperatura ambiente (com excesso de 10% para pipetagem de erro). (Tabela 1)
- Pipeta suavemente Mix Master ou filme para misturar e então centrifugar brevemente.
- Transferência 8μl do Mix Master para cada amostra de RNA. Mix pipetando cima e para baixo 3-4 vezes.
- Incubar a 42 ° C por 2 horas no termociclador.
- Brevemente centrifugar amostras e colocar no gelo. Prosseguir imediatamente para a próxima etapa de síntese de dsDNA.
- Prepare o 2 º Strand master mix de síntese sobre gelo (com sobrecarga de 10% para pipetagem de erro). (Tabela 2)
- Pipeta suavemente Mix Master ou filme para misturar e então centrifugar brevemente.
- Transferência Pipete 80 para cada amostra e misture suavemente pipetando cima e para baixo 3-4 vezes.
- Incubar a 16 ° C por 2 horas no termociclador.
- Após a incubação de 2 horas, prosseguir com a etapa de clean-up cDNA ou congelar imediatamente a -20 ° C.
Parte 2: Double-stranded cDNA clean-up
- Remover o Pure cDNA do frigorífico e deixe-o atingir a temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar. Agitar o frasco plenamente ressuspender o cDNA magnética contas obrigatórias antes do uso.
- Alíquota de água livre de nuclease em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos durante a incubação prévia 2hr.
- Adicionar 180μl de Pure cDNA de cada amostra, e misturar completamente por pipetagem cima e para baixo. Transferir as amostras para uma placa de 96 poços de fundo redondo.
- Continue a misturar as amostras agitando a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos.
- Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixe placa no stand por aproximadamente 6 minutos, ou até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante.
- Retire a placa do suporte magnético.
- Adicionar 150μl tampão de lavagem cDNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não se dispersa nesta etapa, devido à baixa tensão superficial da solução de lavagem.
- Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante.
- Retire a placa do suporte magnético.
- Repita a lavagem de cada vez 2 º com tampão de lavagem 150μl cDNA.
- Após a lavagem 2 º, seca as contas agitando a placa por 2 minutos no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry!
- Eluir o cDNA dos grânulos adicionando 18μl da água livre de nuclease pré-aquecido a cada amostra.
- Agitar vigorosamente a placa por 3 minutos no agitador orbital, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer.
- Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas.
- Transferir cuidadosamente o cDNA eluída (~ 16μl) para uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR).
- Prosseguir diretamente para a etapa seguinte, ou congelar o cDNA a -20 ° C.
Parte 3: transcrição in vitro (IVT)
- Prepare a mistura mestre IVT à temperatura ambiente. (Tabela 3)
- Pipeta suavemente o Mix Master ou filme para misturar e centrifugar brevemente.
- Adicionar 24μl de cada amostra, e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes.
- Incubar a 37 ° C por 14 horas em um termociclador, então segure a 4 ° C até que esteja pronto para a próxima etapa.
Parte 4: ARNA clean-up após IVT
- Vortex as contas RNA ligação rapidamente para obter uma mistura mesmo antes do uso.
- Preparar a mistura ARNA Binding à temperatura ambiente (Tabela 4) Isso pode ser feito antes do tempo -. A mistura preparada ligação pode ser armazenado em temperatura ambiente por até uma semana.
- Misture bem em vórtice.
- Alíquota do tampão de eluição ARNA em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos.
- Adicionar 70μl da mistura obrigatória ARNApara cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes.
- Transferência das amostras da placa de PCR para uma placa de 96 poços de fundo redondo.
- Adicionar 50μl de isopropanol 100% a cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes.
- Agitar suavemente a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos para misturar as amostras.
- Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixar a placa no stand até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante.
- Retire a placa do suporte magnético.
- Adicionar 100μl de solução de lavagem ARNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não pode se dispersar totalmente nesta etapa.
- Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante.
- Retire a placa do suporte magnético.
- Repita a lavagem de cada vez 2 º com 100μl de solução de lavagem ARNA.
- Após a lavagem 2 º, seca as contas agitando a placa por 1 minuto no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry as amostras!
- Eluir a ARNA dos grânulos adicionando 40μl tampão de eluição ARNA pré-aquecido para cada amostra.
- Agitar vigorosamente a placa no agitador orbital por 3 minutos, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer.
- Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas. O sobrenadante contém a limpo-up amino-alil ARNA incorporadas.
- Transferir cuidadosamente o ARNA eluída a uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR).
- (Passo opcional) Verificar a concentração de RNA das amostras medindo 1.5μl em um espectrofotômetro NanoDrop.
- Imediatamente continue para a próxima etapa, ou armazenar a ARNA a -80 ° C.
Tabela 1: 1 Strand cDNA º Mix Master Síntese
| Reagente | Montante para uma reação |
| Tampão Strand 10X Primeiro | 2 l |
| dNTP Mix | 4 mL |
| Inibidor ribonuclease | 1 ml |
| Script da Matriz | 1 ml |
Tabela 2: 2 ª Strand cDNA Mix Master Síntese
| Reagente | Montante para uma reação |
| Água livre de nuclease | 63 mL |
| Tampão 10X Segundo Strand | 10 ml |
| dNTP Mix | 4 mL |
| DNA Polimerase | 2 l |
| RNase H | 1 ml |
Tabela 3: IVT Master Mix
| Reagente | Montante para uma reação |
| aaUTP solução (75 mM) | 2 l |
| ATP, CTP, GTP mix (25 mM) | 12 mL |
| T7 UTP solução (75 mM) | 2 l |
| T7 Tampão de reacção 10X | 4 mL |
| T7 Mix Enzyme | 4 mL |
Tabela 4: ARNA Mix Binding
| Reagente | Montante para uma reação |
| Beads RNA Binding * | 10 ml |
| Bead * Solução ressuspensão | 4 mL |
| Isopropanol 100% ** | 6 mL |
| ARNA Concentrado de tampão de ligação | 50 ul |
* Mix as contas RNA ligação com a solução de ressuspensão primeira conta.
** Adicione o isopropanol e misturar bem antes de adicionar o ARNA concentrado de tampão de ligação.
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Discussão
Passos crítica
A segunda etapa de amplificação não é aconselhável como preconceitos em dados de matriz foram observados. Misturando com cuidado a cada passo enzimático (1 ª e 2 ª vertente de síntese de cDNA, FPI) é fundamental para a obtenção de rendimentos de amplificação boa, como é de incubação de cada etapa enzimática na temperatura adequada. A cycler PCR com tampa aquecida ajustável é o preferido - desvios ainda tão pequeno quanto 2-3 graus durante IVT em um forno de...
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Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Whitehead Institute Fellows Fundos
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Kit de amplificação de aRNA Amino Allyl MessageAmp II | Reagente | Applied Biosystems | AM1753 | Para 20 reações |
| Kit de amplificação de aRNA Amino Allyl MessageAmp II | Reagente | Applied Biosystems | AM1821 | Para 100 reações, em formato de placa de 96 poços |
| Espectrofotômetro UV-VIS NanoDrop ND-1000 | Outro | NanoDrop | ND-1000 | Ou espectrofotômetro equivalente |
Referências
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- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
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Reimpressões e permissões
