Nós descrevemos um protocolo simples para identificar proteínas cerebrais que se ligam ao terminal de todo o comprimento C da ATP-gated P2X2 receptores. A extensão e aplicação sistemática desta abordagem para todos os receptores P2X deverá levar a uma melhor compreensão da sinalização do receptor P2X.
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Artigo de método
Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation
Neste artigo
Resumo
Resumo
Canais de íon-ligante gated subjacentes comunicação sináptica no sistema nervoso 1. Nos mamíferos existem três famílias de ligante-gated canais: o laço cys, o glutamato-gated e os canais do receptor P2X 2. Em cada caso de ligação do transmissor leva à abertura de um poro através do qual os íons fluem seus gradientes eletroquímicos. Muitos ligand-gated canais também são permeáveis aos íons de cálcio 3, 4, que têm a jusante de sinalização papéis 5 (por exemplo, regulação de genes) que podem exceder a duração da abertura do canal. Assim ligand-gated canais pode sinalizar em escalas de tempo amplo que vão desde alguns milissegundos até dias. Tendo em conta estes papéis importantes é necessário entender como ligante-gated canais iônicos em si são regulados por proteínas, e como essas proteínas podem sintonizar sinalização. Estudos recentes sugerem que muitos, senão todos, os canais podem ser parte de complexos de proteínas de sinalização 6. Neste artigo vamos explicar como identificar as proteínas que se ligam aos aspectos C-terminal do domínio receptor P2X2 citosólica.
Receptores P2X são canais ATP-gated educação e composto por sete subunidades (P2X1-P2X7). Receptores P2X são amplamente expressa no cérebro, onde eles medeiam a transmissão sináptica excitatória e facilitação pré-sináptica da liberação de neurotransmissores 7. Receptores P2X são encontrados em células excitáveis e não excitáveis e mediar papéis-chave na sinalização neuronal, inflamação e função cardiovascular 8. P2X2 receptores são abundantes no sistema nervoso 9 e são o foco deste estudo. Cada subunidade P2X é pensado para dois segmentos possuem membrana estendida (TM1 e TM2) separados por uma região extracelular 7 e N intracelular e C termini (Fig 1a) 7. Subunidades P2X 10 (P2X1-P2X7) mostram homologia de seqüência de 30-50% no nível de aminoácidos 11. Receptores P2X conter somente três subunidades, que é o mais simples estequiometria entre os receptores ionotrópicos. O P2X2 C-terminal consiste de 120 aminoácidos (Fig 1b) e contém várias proteínas sites de consenso docking, apoiando a hipótese de que P2X2 receptor pode ser parte de complexos de sinalização. No entanto, embora várias funções foram atribuídas ao C-terminal de receptores P2X2 9 nenhum estudo descreveu os parceiros molecular que o casal para o lado intracelular desta proteína através do comprimento total C-terminal. Neste trabalho métodos que descrevem uma abordagem proteômica para identificar as proteínas que interagem com o comprimento total C-terminal de P2X2 receptores.
Protocolo
Procedimentos experimentais
O procedimento experimental (Fig. 2) consiste em quatro partes que são descritas em uma maneira passo a passo abaixo.
Parte 1: subclonagem e expressão do C-terminal de P2X2 receptores.
Nós expressamos o comprimento total C-terminal de receptores P2X2 em bactérias para identificar as proteínas do cérebro para que ele se liga.
- O C-terminal (resíduos 353-472) do receptor P2X2 (Fig. 1) foi amplificado por PCR, clonados em pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) e verificadas com o seqüenciamento.
- O plasmídeo recombinante foi transformado em E. Co....
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Discussão
Canais iônicos são uma classe importante de proteínas da membrana integral. Eles contêm poros cheios de água que, seletivamente, permitir o movimento de íons para baixo suas gradientes eletroquímicos através da membrana plasmática. Ion portão canais entre os estados aberto e fechado. A etapa de propagação é desencadeada por transmissores (por exemplo, ATP) em caso de ligante P2X canais iônicos fechado, ou pode ser regulada por interações com outras proteínas. A última década testemunhou um aumento na nossa compreensão d.......
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Agradecimentos
SW e TMV são suportados pelo NCRR NHLBI e no National Institutes of Health. BSK e HS são suportados pelo NINDS e NIGMS do National Institutes of Health.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Acetonitrila | Reagente | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrilamida | Reagente | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicilina | Reagente | VWR international | VW1507-01 | |
| Bicarbonato de amônio | Reagente | Fluka | 09830 | |
| Peroxissulfato de Amônio (APS) | Reagente | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosina Trifosfato (ATP) | Reagente | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| reagente de Bradford | Reagente | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Azul de bromofenol | Reagente | Fisher Scientific | B-392 | |
| Azul de Commassie R-250 | Reagente | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Reagente | EMD Millipore | 3860 | |
| Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) | Reagente | VWR international | VW1474-01 | |
| Ácido Etileno Glicol Tetraacético (EGTA) | Reagente | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Ácido fórmico | Reagente | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutatião Sepharose 4B | Reagente | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Ácido clorídrico (HCl) | Reagente | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Reagente | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamida | Reagente | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Meios Luria-Bertani (LB) | Reagente | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptina | Reagente | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lisozima | Reagente | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Sulfato de Magnésio (MgSO₄)4) | Reagente | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Cloreto de Sódio (NaCl) | Reagente | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Fluoreto de sódio (NaF) | Reagente | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Vanadato de Sódio (Na3VO4) | Reagente | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagente | Fluka | 74385 | |
| Fenilmetanosulfonilfluoreto (PMSF) | Reagente | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Comprimido de inibidor de protease | Reagente | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Padrão de proteína | Reagente | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagente | Acros Organics | 61207 | |
| Frasco com tampa rosqueável | Ferramenta | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Dodecil sulfato de sódio | Reagente | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Corante para gel de proteínas Ruby | Reagente | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,’-Tetrametiletilenodiamina (TEMED) | Reagente | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Reagente | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagente | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tripsina | Reagente | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagente | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Água | Reagente | Burdick && Jackson | 365-4 | |
| espectrômetro de massas tandem LTQ-Orbitrap | Ferramenta | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sistema de Cromatografia Líquida em Nanoescala | Ferramenta | Eksigent | ||
| B-Mercapto–etanol | Reagente | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glicerol | EMD Millipore | GX0185-6 |
Referências
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contr....
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Reimpressões e permissões
