Artigo de método

Cell-ES derivadas Neuroepiteliais culturas de células

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DOI:

10.3791/118

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30 de novembro de 2006

 ,  ,  , 
1McLean Hospital, Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

Derivação de precursores de neuroepiteliais-tronco embrionárias (ES) utilizando células do estroma atividade induzir células derivadas (SDIA).

Resumo

Células-tronco embrionárias têm o potencial de se diferenciar em células de todas as camadas germinativas, o que os torna uma ferramenta atraente para o desenvolvimento de novas terapias. Em geral, a diferenciação de células-tronco embrionárias segue o conceito para a primeira geração de células progenitoras imaturas, que depois podem ser propagadas e diferenciado em fenótipos maduros celular. Isto também se aplica para o ES neurogênese células derivada, em que o desenvolvimento de células neurais segue duas etapas principais: Primeiro, a derivação ea expansão de precursores imaturos neuroepiteliais e, segundo, sua diferenciação em células maduras neural. Um método comum para a produção de progenitores neurais a partir de células ES é baseado em embrióides corpo formação (EB), que revela a diferenciação das células de todas as camadas germinativas incluindo neuroectoderma. Um método alternativo e mais eficiente para induzir o desenvolvimento de células neuroepiteliais usa actividade indutora do estroma de células derivadas (SDIA), que pode ser alcançado pelas células de cultura co-ES com o osso do crânio derivadas da medula células do estroma (1). Tanto, a formação de EB e SDIA, revelam o desenvolvimento de rosette-como estruturas, que são pensados ​​para assemelhar-se do tubo neural e / ou da crista neural, como progenitores. Os precursores neurais podem ser isoladas, expandidas e ainda mais diferenciado em neurônios e células gliais específicos usando condições de cultura definidas. Aqui, descrevemos a produção e isolamento de rosetas como em co-cultura experimentos com a linhagem de células do estroma MS5 (2-5).

Protocolo

Passo 1

  1. Placa de mitomicina-C ggrowth inibido (10 mcg / ml para 2,5 horas) MS5 células a uma densidade de 70 mil / cm2 em gelatina-revestido (0,01% por 30 minutos) 6 pratos bem em α-MEM mídia.
  2. Quando as células são inscritos e formaram uma monocamada (sobre o crescimento noite), mude para SRM.
  3. Manualmente isolar colônias de células ES de culturas de células ES usando uma seringa com uma agulha de 27 ½ G.
  4. Tritrurate as colônias cuidadosamente com uma ponta de 1 ml azul e placa em baixa densidade na MS5 células (geralmente 2-3 colônias por 6 placa bem).

Nota: As células-tronco embrionárias também podem ser tomadas a partir de propagação enzimática utilizando colagenase ou tripsina.

Passo 2

  1. Cultivar as células ES na MS5 alimentadores de 14-21 dias até roseta contendo formam colônias.


Nota: Alterar mídia com freqüência. O rosetas são geralmente nas bordas exteriores das colônias e sua formação pode ser muito maior se Noggin 300-500 ng / ml é adicionado ao SRM (3). Em alguns protocolos de diferenciação, SRM podem ser trocados com N2-A mídia e completada com o crescimento ou outros fatores para promover a especificação de células (2-5).

Passo 3

  1. Isolar e escolher o rosetas com uma agulha de 27 ½ G sob um microscópio.

Nota: Evite cortar e escolher o MS5 células do estroma. Se colônias são embalados com rosetas, também se pode isolar a colônia inteira.


Passo 4

  1. Aspirar os clusters de rosetas, tritrurate-los cuidadosamente com uma ponta de 1 ml azul, e placa-los em poli-L-ornitina (0,001%) e fibronectina (1 mg / ml) ou laminina (1 mg / ml) revestido 6 poços em N2-A mídia geralmente suplementado com bFGF (20 ng / ml). O rosetas vai reformar e expandir.

Nota: Para aumentar a sobrevivência da célula, pode-se a placa de pequenos grupos em forma de gotas para aumentar a densidade de células. Esta etapa também pode ser modificada, completando o N2-A mídia com crescimento adicional ou outros fatores para promover a especificação de células (2-5).

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Discussão

Este protocolo demonstra as diferentes etapas na geração e isolamento de células gliais a partir de células embrionárias humanas usando SDIA. A aplicação deste método é múltiplo e tem sido usado em muitos protocolos para a produção de neurônios especificado (por exemplo, 1, 2, 5-9). O rosetas são pensadas para se parecer com as células do tubo neural com um fenótipo anterior (2, 5, 10) e também contêm progenitores da crista neural (11, 12). Além disso, eles mantêm um certo nível de plasticidade, uma vez que podem ser modelado por fatores es...

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Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
L-GlutaminaGIBCO, by Life Technologies25030
alpha-MEMGIBCO, by Life Technologies12571
Penicilina/estreptomicinaGIBCO, by Life Technologies15140
Knockout-DMEMGIBCO, by Life Technologies10829
Substituto de soro KnockoutGIBCO, by Life Technologies10828
Solução de aminoácidos não essenciais MEMGIBCO, by Life Technologies12383
DMEM/F12GIBCO, by Life Technologies11330
Suplemento N2-AStem Cell Technologies07152
Mitomicina-CSigma-AldrichM0503
Gelatina tipo-ASigma-AldrichG1890
poli-L-ornitinaSigma-AldrichP4957solução a 0,01%
LamininaSigma-AldrichL-2020
FibronectinaSigma-AldrichF2006
Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)Invitrogen13256
Seringa de 1 mL com agulha 27 1/2 GBD Biosciences309623
Meio N2-AmeioDMEM/F12 + 1% suplemento N2-A
Meio com substituto de soro (SRM)meioKnockout-DMEM + 20% substituto de soro Knockout + 1% solução de aminoácidos não essenciais MEM + 2 mM L-glutamina
Meio α-MEMmeioα-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamina + 1% penicilina/estreptomicina
MS5linha celularcélulas estromais
Microscópio
Placas de 6 poçospara cultura de tecidos

Referências

  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
  6. Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
  7. Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
  8. Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
  9. Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
  10. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  11. Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
  12. Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).

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