Processamento do Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Summary

O cDNA microarray PtGen2 foi desenvolvido para estudos de expressão gênica em mudas de pinus, P. taeda, E outras espécies de coníferas. Aqui, vamos mostrar pré e pós-hibridação manuseio e técnicas de lavagem que pode ser usado com esta matriz para produzir uma maior consistência, artefatos reduzida, e fundos mais baixos.

Abstract

PtGen2 é um microarray de cDNA contendo funcionalidade 26.496 ESTs pinheiros loblolly amplificada. A matriz é produzido em nosso laboratório a ser utilizado por pesquisadores que estudam a expressão gênica em espécies de coníferas de pinheiros e outras. PtGen2 foi desenvolvido como resultado de nossos esforços gene descoberta em pinheiro, e é composta de seqüências identificadas principalmente a partir de tecidos de raiz, mas também de agulha e tronco ^1,2. PtGen2 foi testado por hibridação diferentes Cy dye-rotulados cDNAs alvo de coníferas , usando tanto amplificadas e não amplificadas métodos de rotulagem indireta, e também testados com uma série de condições de hibridização e lavagem. Este vídeo enfoca a manipulação e processamento de slides antes e após a pré-hibridização, bem como após a hibridização, utilizando-se algumas modificações para os procedimentos desenvolvidos anteriormente ^3,4. Também estão incluídos, em forma de texto único, são os protocolos utilizados para a geração, rotulagem e limpeza de cDNA s alvo, bem como informações sobre o software usado para processamento de dados a jusante.

PtGen2 é impresso com um buffer de impressão proprietária que contém altas concentrações de sal que pode ser difícil de remover completamente. As lâminas são lavadas primeiro em uma solução SDS quente antes de pré-hibridização. Após a pré-hibridização, as lâminas são lavadas vigorosamente em várias mudanças de água para completar a remoção dos sais remanescentes. LifterSlips ™ são limpos e, em seguida, posicionado na slides e rotulado cDNA é cuidadosamente carregado no microarray por meio de ação capilar que prevê a distribuição uniforme da amostra em todo o slide, e reduz a chance de incorporação de espuma. Hibridação de metas para a matriz é feita a 48 ° C em condições de alta umidade. Após a hibridização, uma série de lavagens padrão são feitas a 53 ° C e temperatura ambiente por longos períodos. Processamento PtGen2 slides usando esta técnica reduz o sal ea SDS-artefatos derivados muitas vezes visto quando a matriz é processada menos rigorosa. Hibridação alvos derivado de várias fontes diferentes de coníferas RNA, este protocolo de processamento rendeu menos artefatos, fundo reduzida, e desde uma maior consistência entre os diferentes grupos experimentais de matrizes.

Protocol

(Nota Seções 1 - Não 4 demonstraram em Vídeo)

Preparando Cy-alvo identificadas cDNA

O que se segue é o protocolo que usamos para a síntese de cDNA a partir de RNA total de pinus taeda e rotulagem cDNA microarray indireta antes hibridizações. Apesar de alguns não-trivial modificações foram feitas, o protocolo abaixo é semelhante ao que no manual de instruções fornecido com o Kit Invitrogen de Etiquetagem SuperScript indireta cDNA.

Parte 1: First-Strand reação de síntese de cDNA

1. Misture e brevemente girar cada componente do kit antes de usar.
2. Prepare reacções como ....

Discussion

PtGen2 é um recentemente desenvolvido, personalizado microarray de cDNA, que foi projetado para ser usado principalmente pela comunidade de pesquisa loblolly pinho. Os resultados preliminares gerados até o momento têm demonstrado a matriz para ser uma ferramenta valiosa na avaliação de eventos transcricionais que ocorrem em resposta ao estresse hídrico, bem como no monitoramento das mudanças que ocorrem durante o desenvolvimento do embrião no pinheiro bravo, Pinus pinaster ^5,6 Temos também demonstrou.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampão			de pré-hibridização	5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA
Tampão de hibridização	30			% formamida, 5X SSC, 5X Denhardt' s, 1% de RNA PoliA (Invitrogen, POLYA. GF), 0,1% SDS
Wash Solution #1	Buffer			1X SSC, 0,2% SDS, pré-aqueça a 43° Solução de
Lavagem C #2	Tampão			0,1X SSC, Solução de Lavagem SDS 0,2%
#3	Tampão			0,1X SSC
Reagente de Álcool Isopropílico		Sigma-Aldrich	34959-2.5L
50mL Tubos Cônicos	Outros	Falcon BD	352070
15mL Tubos Cônicos	Outros	Falcon BD	352196	Use esta ou uma tampa semelhante colocada na parte inferior de cada tubo cônico de 50mL durante a centrifugação
Coplin Jar		Wheaton	900520
Prato de coloração e Rack	Outros	Wheaton	900200
Albumina de soro bovino (BSA)	Outros	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA.
Kit	de Rotulagem de cDNA Indireto GF SuperScriptTM	Invitrogen	L1014-02
Turbo DNase	Kit	Ambion	AM1907
Sistema
Cy-5	Reagente	GE Healthcare	PA25001
Cy-3 Reagente de Corante		GE Healthcare	PA23001
LifterSlips™	Outros	Equipamentos Erie Scientific	25X601
HybChambers		GeneMachines	JHYB200003