Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Resumo

O epitélio sensorial do ouvido interno zebrafish adultos é um sistema bom modelo para a compreensão dos mecanismos de regeneração das células ciliadas nos vertebrados adultos. Este protocolo demonstra a dissecção fina do epitélio, através do qual podemos obter amostras de tecido para estudar os eventos de regeneração em níveis celular e subcelular.

Resumo

Neurossensorial epitélio do ouvido interno são as estruturas cruciais para as funções de audição e equilíbrio. Portanto, é importante compreender as características celulares e moleculares do epitélio, que são compostas principalmente de dois tipos de células: células ciliadas (HC) e células de apoio (SCS). Aqui nós escolhemos estudar o epitélio sensorial do ouvido interno em zebrafish adulto não só porque as estruturas epiteliais são altamente conservada em todos os vertebrados estudados, mas também porque o peixe-zebra adulto é capaz de regenerar HCs, uma capacidade que os mamíferos perdem logo após o nascimento. Nós usamos a orelha interna do peixe-zebra adulto como um sistema modelo para estudar os mecanismos de regeneração interior HC ouvido nos vertebrados adultos que poderiam ser úteis para a terapia clínica da audição / déficits na balança humana, como resultado da perda de HC.

Aqui demonstramos como fazer dissecções bruta e multa de epitélios sensoriais do ouvido interno em peixe-zebra adulto. A dissecção macroscópica remove os tecidos ao redor do ouvido interno e é útil para preparar cortes de tecido, o que nos permite examinar a estrutura detalhada do epitélio sensorial. A dissecção fina limpa os tecidos não-sensoriais-epitelial de cada epitélio individuais e nos permite examinar a heterogeneidade do epitélio todo facilmente em todo o monte amostras epiteliais.

Protocolo

Parte 1: Preparação do tecido

1. Euthanize o peixe-zebra adulto com buffered MS-222 (Ethyl 3-aminobenzoato sal metanossulfonato, 0,03%).
2. Decapitar o peixe. Cortar o maxilar inferior, coloque a cabeça na almofada dissecção com o lado ventral para cima, e imobilizar o tecido com pinos de insetos. Remover o tecido mole ventral no crânio e se abrir a parte ventral da cápsula crânio com um par de pinças finas sob um microscópio de dissecação.
3. Fixar a cabeça de peixe em paraformaldeído (4%) a 4 ° C durante a noite.
4. Lavar a cabeça de peixe fixados em PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X) por 3 vezes, 5 minutos de cada vez.

Parte 2: Gross dissecção da orelha interna

1. Coloque o peixe cabeça na almofada dissecção com o lado ventral. Imobilizá-lo com alfinetes de insetos. Todas as etapas seguintes são realizadas no microscópio de dissecação.
2. Com um par de pinças finas, remova o osso do crânio sobre o ouvido interno e, em seguida, puxe cuidadosamente para fora dos tecidos do ouvido interno: sáculos, lagenae, e utrículos. Sáculo e lagena são fortemente anexar ao outro e, assim, retirar juntos enquanto o utrículo (anterior ao sáculo e lagena), muito provavelmente a ser destacado da outra extremidade órgãos durante a dissecção.
3. Coloque os tecidos do ouvido interno em PBS (1X). Se não houver dissecção mais fino é necessário, lave o tecido 2-3 vezes com PBS (1X) e pode ser utilizado para outros experimentos, criosecções por exemplo.

Parte 3: dissecção fina do epitélio sensorial do ouvido interno

1. A dissecção fina pode ser realizada em uma gota de PBS (1X) em uma lâmina de vidro limpa.
2. Remover o otólitos do utrículo utricular com dois pares de pinças finas, e, se desejar, corte o tecido não-sensoriais epiteliais e da inervação da epitélios com um par de pinças finas e uma lâmina de agulha.
3. Remover o otólitos lagenar antes de separar sacular e lagenar epitélio, enquanto tentar manter o sáculo toda tão intacto quanto possível. Coloque o tecido na queda PBS com até lado ventral. Use a lâmina de agulha para corte cuidadosamente entre o sáculo e lagena. Corte o tecido não-sensorial excessiva epiteliais e os innvervation com uma pinça fina e da lâmina da agulha, se desejar.

Parte 4: coloração fluorescente das células ciliadas no epitélio sensorial

1. Lavar o epitélio sensorial com PBT (1XPBS e 1% Triton X-100) por 3 vezes, 5 min de cada vez.
2. Incubar os epitélios com fluophore marcado phalloidin (por exemplo, farinha Alexa 488 faloidina, 1:1.000 diluição) por 30 min em temperatura ambiente.
3. Lavar o epitélio sensorial com PBT de 3 vezes, 10 min de cada vez.
4. Monte o epitélio sobre uma lâmina com meio de montagem e verificar o tecido manchado sob o microscópio fluorescente com filtros do comprimento de onda adequado.
5. Após a dissecção de sucesso e coloração, epitélio intacto, com forte coloração feixe capilar célula pode ser visto sob o microscópio (Fig. 1).

Figura 1. Células ciliadas do epitélio sacular sensoriais foram coradas com Farinha Alexa 488 faloidina (Green). A amostra de tecido foi dissecada e coradas como mencionado no jornal. Várias fotos foram tiradas em diferentes posições da amostra e azulejos em conjunto com o Adobe Photoshop 7.0.
Barra de escala = 150μm.

Discussão

Neste protocolo, descrevemos a dissecção grossa e fina do epitélio sensorial do ouvido interno de peixe-zebra adulto, o que nos permite preparar amostra de tecido para estudar as características celulares e subcelulares do epitélio sensorial.

, A fim de realizar uma dissecação de sucesso, o primeiro passo, a fixação, é muito importante. Certifique-se que você sempre usa solução paraformaldeído preparados na hora, porque solução antiga resultará em menos de fixação de tecidos que são difíceis...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
MS222 (sal de ácido metanosulfônico do etil 3-aminobenzoato)	Reagente	Sigma-Aldrich	A5040
PBS (salina tamponada com fosfato, 10X)	Reagente	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Paraformaldeído	Reagente	Sigma-Aldrich	P-6148
Triton X-100	Reagente	Sigma-Aldrich	T8787
Alexa Fluor 488 faloidina	Reagente	Invitrogen	A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium com DAPI	Reagente	Vector Laboratories	H-1500
Microscópio de dissecação	Microscópio	Nikon Instruments	SMZ1000
Alfinetes para dissecação	Ferramenta	Fine Science Tools	26000-40
Tesoura	Ferramenta	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Pincel	Ferramenta	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045
Lâmina de agulha	Ferramenta	Sharpoint	78-6810
Microscópio fluorescente	Microscópio	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
Almofada de dissecação	Ferramenta	eNasco	SB07840M
Peixe-zebra	Animal	Vários	n/a