Medição Usina Extensão parede celular (Creep) induzida pelo pH ácido e por Alpha-Expansin

Resumo

Nós demonstramos o uso de um extensômetro de força constante para medir a extensão de longo prazo (creep) de espécimes de plantas parede celular induzida por buffers ácidas e proteína expansin.

Resumo

Paredes celulares de plantas crescendo caracteristicamente apresentam uma propriedade conhecida como "crescimento ácido", pelo qual significa que elas são mais extensíveis em pH baixo (<5) ^1. O hormônio vegetal auxina rapidamente estimula o alongamento celular em caules jovens e tecidos semelhantes ao menos em parte por um mecanismo de crescimento ^{ácido-2, 3.} Auxina ativa uma bomba H ⁺ na membrana plasmática, causando a acidificação da solução da parede celular. Acidificação da parede ativa expansins, que são endógenas afrouxamento da parede ^celular-4 proteínas, fazendo com que a parede celular para produzir as tensões de parede criado por pressão de turgor celular. Como resultado, a célula começa a aumentar rapidamente. Esse fenômeno de crescimento ácido "é facilmente medido em isolada (não vivas) espécimes da parede celular. A capacidade das paredes das células se submeter induzida por ácido extensão não é simplesmente o resultado do arranjo estrutural dos polissacarídeos da parede celular (pectinas, por exemplo), mas depende da atividade de expansins ^5. Expansins não têm qualquer atividade enzimática e conhecida a única forma de ensaio para a atividade expansin é medir sua indução da extensão da parede celular. Este relatório detalha o video fontes e técnicas de preparação para a obtenção de materiais de parede adequado para ensaios expansin e passa a mostrar induzida por ácido extensão e expansin induzida extensão da parede amostras preparadas a partir de hipocótilos de pepino crescimento.

Para obter amostras de células da parede adequados, mudas de pepino são cultivados no escuro, o hipocótilo são cortadas e congeladas a -80 ° C. Hipocótilo congelados são desgastados, achatados, e depois preso na tensão constante em uma tina especial para medições extensômetro. Para medir induzida por ácido de extensão, as paredes são inicialmente tamponada em pH neutro, resultando em baixa atividade de expansins que são componentes das paredes das células nativas. Após a troca de buffer para pH ácido, expansins são ativados e as paredes celulares estender rapidamente. Nós também demonstram atividade expansin em um ensaio de reconstituição. Para esta parte, nós usamos um tratamento térmico breve a desnaturar a expansins nativas nas amostras de parede celular. Estas paredes das células inativadas não se estendem até mesmo em tampão ácido, mas além de expansins para as paredes das células rapidamente restaura a sua capacidade de estender.

Protocolo

Parte 1: Crescendo e armazenamento de material vegetal adequado

1. Em nossa experiência, hipocótilo jovens de mudas de pepino estiolados servir como uma fonte conveniente de material da parede celular para estas experiências. Sementes de pepino são semeadas em papel molhado em uma caixa à prova de luz, que é manter-se em um armário em uma sala escura temperatura constante fixada em 26 ° C. A temperatura exata não é crítica, como qualquer coisa entre 22 ° e 30 ° C deve ser fino, mas a temperatura vai determinar o quão rápido as mudas atingem um grau adequado de desenvolvimento. A temperatura mais quente, mais rápido as mudas irão se desenvolver. Normalmente us....

Discussão

Para esta demonstração foram utilizados paredes celulares de hipocótilo do pepino porque eles provaram ser uma fonte confiável de amostras de parede que são fáceis de manusear e que respondem com boa sensibilidade. Nós também tivemos um bom sucesso com paredes de mudas de outras, bem como alguns materiais do supermercado, tais como folhas de espinafre jovens e talos de aipo. Basicamente, o jovem, macio, tecidos vegetais de rápido crescimento tendem a ser facilmente medido com esta técnica, mas resistente, velho, tecidos.......