Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Resumo

Neste vídeo, demonstramos como rotular e visualizar exocitose das vesículas sinápticas única e tráfico de células da retina goldfish bipolar usando reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF).

Resumo

Refletância interna total de fluorescência microscopia (TIRF) é uma técnica que permite o estudo dos eventos que acontecem na membrana celular, pela imagem seletiva de moléculas fluorescentes que são mais próximos a uma substância de alto índice de refração, como vidro

Protocolo

Parte 1: Dissecção e isolamento de células Bipolar

1. Preparar soluções listadas na Tabela 2; O pH de toques "(externa) de soluções deve ser ajustado para 7,4 com NaOH e do pH da solução interna deve ser ajustado para 7,2 com CsOH. Proteger a solução interna da luz com papel alumínio e mantenha-o a 4 ° C até o uso;
2. Dark-se adaptar um peixinho dourado, pelo menos, 30 minutos antes da dissecção;
3. Enquanto o animal se adapta-escuro, preparar 5 mL de hialuronidase (V tipo hialuronidase, 1100 unidades / mL em baixo Ca ^{2 +} Ringer; Sigma, St. Louis, MO) e 10 mL de L-cisteína (0,5 mg / mL em Ca ^{2 +} baixo) da campainha as soluç....

Discussão

As vantagens do objectivo do tipo de microscopia TIRF são que 1) ele fornece seccionamento óptico excelente restringindo luz de excitação a uma estreita região dentro do plano focal da objetiva, minimizando assim o fora-de-foco de luz, 2) já que a luz cai exponencialmente com a distância , o movimento em uma direção vertical pode ser monitorado como uma mudança na intensidade de fluorescência, 3) a coleta de luz eficiente através do objectivo de alta abertura numérica ^1,5.

A principal desvantagem da técnica é que ela está.......