Nós descrevemos um método para extração de DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM filtros Sterivex, seguido por centrifugação em gradiente de cloreto de césio densidade para purificação.
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Artigo de método
Extração de DNA de 0,22 mM Sterivex Filtros e Césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Este método é usado para extrair o DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM Sterivex filtros que foram tratados com armazenamento / tampão de lise e arquivados a -80 ° C, e para purificar esse DNA usando um gradiente de densidade de césio cloreto. O protocolo começa com duas etapas de uma hora de incubação para liberar o DNA das células e remover RNA. Em seguida, uma série de Fenol: Clorofórmio Clorofórmio e extrações são realizadas seguida de centrifugação para remover proteínas e componentes da membrana celular, a coleta do extrato aquoso de DNA, e as etapas de vários buffer de troca para lavar e concentrar o extrato. Parte V descreve a purificação opcional através de gradiente de cloreto de césio densidade. Recomenda-se a trabalhar com menos de 15 amostras de uma só vez para evitar confusão e reduzir o tempo de protocolo. O tempo total necessário para este protocolo depende do número de amostras a serem extraídas. Por 10-15 amostras e assumindo o equipamento de centrifugação adequada estiver disponível, este protocolo inteiro deve levar três dias. Certifique-se que os fornos de hibridação definir a temperatura no início do processo.
Protocolo
Nota: Todos os reagentes utilizados neste protocolo são extraídos das existências de laboratório em pequenos stocks de trabalho-isto é muito importante para evitar a contaminação cruzada de amostras de seu DNA e contaminação dos estoques de laboratório. Além disso, quando pipetagem, certifique-se de trocar a ponteira para cada adição para evitar a contaminação cruzada.
Part One: Lise Celular e Digestão
- Comece este protocolo por descongelamento dos filtros Sterivex que contêm biomassa planctônica anteriormente concentrada no gelo. Para simplificar, aqui descrevemos o procedimento para o processamento de....
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Discussão
Dependendo do número de amostras devem ser processadas, isso pode ser um procedimento demorada devido aos dois passos de incubação de uma hora, e as lavagens repetidas e passos de centrifugação. É melhor plano de dois dias inteiros para este procedimento para deixar bastante tempo. Se houver problemas para obter o volume extrato final no tubo Amicon para reduzir até 200 500μl durante a concentração de DNA e de lavar roupa, tentar fazer lavagens adicionais TE e centrifugações (repetir Parte III) até que o volume apropria.......
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Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. JJW foi apoiado por bolsas de NSERC e DAW foi apoiado por bolsas de NSERC, Killam ea fundação TULA Centro financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution. SL foi apoiado pelo Centro de fundação TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| seringa de 1 cc (agulha 26G5/8) | BD Biosciences | 309597 | |
| seringa de 1 ml (agulha 26G5/8) | BD Biosciences | 309597 | |
| tubos Eppendorf de 1,5 ml | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| tubos de 15 ml | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| seringa de 5 cc | BD Biosciences | 309603 | |
| Dispositivos de filtração centrífuga Amicon® Ultra-4 | EMD Millipore | UFC801096 | limite nominal de peso molecular de 10.000 |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Preparar saturado com água (butanol:água = 1:1) |
| Rotor de centrífuga, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrífuga, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cloreto de césio | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Clorofórmio:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Brometo de etídio (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetraacético diidratado | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Forno de hibridização | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Tampão de lise | sacarose 0,75 M, EDTA 40 mM, Tris 50 mM (pH 8,3) | ||
| Lisozima | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg em 1000 μl de tampão TE |
| Unidade de filtração centrífuga Microcon® Ultracel YM-30 | EMD Millipore | 42410 | limite de corte de 50 pb |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Fenol:Clorofórmio:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Protease K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Transiluminador de luz azul Safe Imager™ | Invitrogen | S37102 | |
| Dodecilsulfato de sódio (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | SDS a 20% |
| Filtros Sterivex | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Centrífuga de bancada | Eppendorf | 5415D | |
| Tampão TE, pH 8,0 | |||
| Base Trizma® | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Rotor de ultracentrífuga, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Tubo de ultracentrífuga (7X20 mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Porta-tubos de ultracentrífuga | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrífuga, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
Referências
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
