Method Article

Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica

DOI:

10.3791/1387

⸱

September 23rd, 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Construção de uma biblioteca fosmid com DNA genômico ambiental isolado do contínuo de profundidade vertical de um fiorde sazonalmente hipóxica é descrito. A biblioteca clone resultante é escolhido em 384 poços pratos e arquivados para seqüenciamento e análise funcional a jusante pela aplicação de um sistema automatizado colônia colheita.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A grande maioria dos micróbios na natureza atualmente permanecem inacessíveis aos métodos tradicionais de cultivo. Durante a última década, a cultura independente de genômica ambiental (

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosmid construção da biblioteca foi dividida em quatro etapas principais e sub-dividido em várias partes (ver Fig.1 para uma visão geral).

Etapa I (ver protocolo de "extração de DNA a partir de 0,22 mM filtros Sterivex" [3])

Parte 1: Enzyme-catalisada lise celular

Parte 2: Purificação de DNA ambiental por centrifugação CsCl gradiente de densidade e recuperação de DNA

Parte 3: Controle de qualidade de DNA extraído por eletroforese em gel

Etapa II

Parte 1: etapas de modificação enzimática de DNA r....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um procedimento é descrito como mais eficiente gerar uma grande biblioteca a inserir fosmid com DNA genômico derivado de uma amostra de água costeiras. A montante extração do DNA genômico é descrito em um protocolo separado [3].

Como a produção fosmid-biblioteca é um processo de várias etapas, plano de pelo menos duas a três semanas a tempo para todo o procedimento, incluindo todos os passos quatro apresentaram. A extração de DNA genômico é o passo mais crucial e todos os fluxos de down-pass.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Não tenho nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. MT e SL foram apoiados por bolsas de estudo do Centro de fundação TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution (CMDE). MT também recebeu apoio bolsa da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

4Etapa IV

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Etapa II
CopyControl™ Kit de Produção de Biblioteca FosmidA Epicentre BiotechnologiesCCFOS110suficiente para gerar 9-10 bibliotecas fosmid
SeaPlaque AgaroseCambrex50100
placa quente de agitaçãoCorningPC-420D
1.0X TAE buffer
CHEF Mapper XA sistema de eletroforese de campo pulsado incluindo módulo de resfriamento e bombade velocidade variávelBio-Rad
λ DNA-HindIII DigestNew England BiolabsN3012S
MidRange I PFG MarkerNew England BiolabsN3551S
10,000X SYBR GoldInvitrogenS11494
filme plástico para micro-ondasSaran premium wrap
Safe Imager transiluminadorInvitrogenS37102
GELase Agarose Gel-Digesting PreparaçãoEpicentre BiotechnologiesG09100
bisturiFisher Scientific08-927-5D
Amicon Ultra-4 Unidade de Filtro Centrífugo com membrana Ultracel-10EMD MilliporeUFC801024
Microcon YM-30 EMD Millipore42410
água livre de nucleaseAmbionAM9932
Kit de ensaio Quant-iT PicoGreen dsDNA *2000 ensaios*#InvitrogenP7589
aquecedor digital de bloco secoVWR international12621-088
banho-mariaVWR international14231-854
centrífugaBeckman Coulter Inc.Avanti J-E
Beckman Coulter Inc.Centrífuga de mesa JA 5.3
Eppendorf5415D
tubos de microcentrífuga, 1,7 mL, transparenteAxygen ScientificMCT-175-C
Tubos de centrífuga de 15 mL Caldo Fisher Scientific430052
Step III
LBFisher ScientificBP 1426-2
Tampão
10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM Frascos de MgCl2
3370)
Placa de 384 poços com tampaFisher Scientific07201157(3680)
Placas de Petri 100 O.D. x 15mm HFisher Scientific08-757-12
Placas de Petri 150 Diâmetro x 15mmHFisher Scientific08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mmVWR internationalCABD351040
glicerolSigma-AldrichG5516
cloranfenicolSigma-AldrichC0378
LB caldoFisher ScientificBP 1426-2
Difco AgarBD Biosciences214530
contas de vidroFisher Scientific10-310-1
QFill3GenetixX3050
BleachJavex
EtanolSigma-AldrichE7023
Tubos de centrífuga de 15 mLFisher Scientific430052
QPix selecionador de colôniasGenetixQPix2
cabeça de coleta (E. coli) GenetixX4006
de corrida Unidade de Filtro Centrífugo Rotor de centrífuga de diluição de fagos MgSOSigma-Aldrich M2643 criogênico Fisher Scientific 43048896 placa de poço com tampa Fisher Scientific CS003370(

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Environmental Genomic LibraryFosmid Library ProductionPulsed Field Gel ElectrophoresisDNA End RepairGel ExtractionPhage PackagingAutomated Colony PickingChloramphenicol SelectionEPI300T1 Resistant CellsQpix2 Robot

Related Articles