Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Resumo

O isolamento de alta qualidade, RNA intacto é um passo essencial para muitos protocolos laboratoriais. Aqui, demonstramos extração de RNA a partir de embriões zebrafish todo e síntese de cDNA para posterior aplicação em vários procedimentos experimentais, incluindo análise de microarray gene de expressão.

Resumo

Muitos procedimentos laboratoriais importantes e complexas exigem um trabalho de alta qualidade, RNA intacto. Uma amostra degradada ou a presença de impurezas pode levar a resultados desastrosos em downstream aplicações experimentais. É, portanto, de extrema importância o uso de técnicas sólidas com inúmeras salvaguardas e verificações de controle de qualidade para garantir uma amostra superior. Neste documento, detalhamos um protocolo para isolar RNA total a partir de embriões zebrafish inteiro usando um desnaturante químico comercialmente disponível e limpeza após a remoção de vestígios de DNA e impurezas através de um kit de isolamento comercial RNA. Como RNA é relativamente instável e facilmente propenso a clivagem pela RNAses, a maioria dos protocolos de expressão gênica de ensaio utilizando um produto que está diretamente cDNA sintetizado a partir de um modelo de RNA. Detalhamos um procedimento para converter RNA no produto mais estável cDNA usando um kit disponível comercialmente. Ao longo destes procedimentos, há inúmeros testes de qualidade de controlo para garantir que a amostra não é degradada ou contaminada. O produto final destes protocolos é cDNA que é adequado para análise de microarray, RT-PCR ou armazenamento de longo prazo.

Protocolo

Parte 1: Extração de RNA total utilizando reagente Trizol

Quando se trabalha com RNA é muito importante trabalhar em um ambiente que está livre de RNAses. Precauções simples, como ter pipetas reservados para uso apenas com os procedimentos de RNA e pulverizar a área de trabalho com um reagente descontaminante (por exemplo, RNAse Fora) antes de iniciar o procedimento são muito úteis.

1. Para atingir uma quantidade suficiente de RNA piscina de 50 embriões zebrafish em um microtubo de 1,5 ml e remover tanta água quanto possível com uma pipeta.
2. Imediatamente adicione 250 mL de reagente Trizol ¹ para o tubo de micr....

Discussão

A fragilidade da molécula de RNA é o aspecto mais crítico que deve ser lembrado ao longo deste protocolo. Equipamento estéril que é RNAse-free deve ser sempre usada em uma zona livre de RNAse do laboratório. É útil reservar uma parte do laboratório a ser utilizado para procedimentos de RNA apenas. Esta área deve ser freqüentemente pulverizados com um produto de remoção de RNAse, como RNAse Away. As amostras de RNA devem ser sempre manuseadas com luvas e mantidos em gelo para evitar a degradação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Glicogênio (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Pestles de Pellet com Tubo Microfuge	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1,5 ml	Eppendorf	2302800
Fenol, saturado com Tris	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
Conjunto de DNase Isento de RNase	Qiagen	79254
Kit RNEasy Mini	Qiagen	74104
Sistema SuperScript® de Síntese de Primeiro Filamento para RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026