Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Interferência de RNA (RNAi) é um sistema de silenciamento de genes em células vivas. Em RNAi, genes homólogos em seqüência de curto RNAs de interferência (siRNA) são silenciadas no estado pós-transcricional. RNAs hairpin curto, precursores de siRNA, podem ser expressas utilizando lentivírus, permitindo a RNAi em uma variedade de tipos de células. Lentivírus, como o Vírus da Imunodeficiência Humana, são capazes de infectar tanto divisão e não divisão das células. Vamos descrever um procedimento que a lentivírus pacote. Embalagem refere-se à preparação de vírus competentes de vetores de DNA. Sistemas de produção Lentivirus vector são baseados em um 'split' do sistema, onde o genoma viral naturais foi dividida em construções auxiliares individuais plasmídeo. Essa divisão dos diferentes elementos viral em quatro vetores separados diminui o risco de criar um vírus de replicação com capacidade de recombinação do genoma acidental lentiviral. Aqui, um vetor contendo os shRNA de interesse e de três vetores de embalagem (p-VSVG, PRSV, pMDL) são transitoriamente transfectadas em células humanas 293. Depois de pelo menos um período de incubação de 48 horas, o sobrenadante contendo o vírus é colhido e concentrada. Finalmente, título de vírus é determinado pelo repórter (fluorescente) expressão com um citômetro de fluxo.
Protocolo
Parte 1: Transfecção de HEK 293 células para produzir Lentivirus
* 24 horas antes de transfecção, placa de 2,5 X 10 6 células em um prato de 10 centímetros de uma confluência de 50-70% no dia seguinte.
- Iniciar este protocolo, preparando o DNA com o qual se vai depois de uma transfecção as células para fazer vírus. Primeiro, diluir FuGENE 6 Transfection reagente Roche, um reagente de lipídios que fazem as células ocupam DNA. Em um tubo de 1,5 ml, pipetar 30μl FuGENE 6 em meio isento de soro 600ul (SFDMEM). Tenha cuidado para não deixar FuGENE toque no lado do tubo quando é entregue ao meio. Deixe esta FuGENE e SFDMEM ....
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Agradecimentos
Sandler Asma Básico Research Center (SABRE)
Sandler Foundation
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM células HEK 293T Penicilina-estreptomicina Glutamina Solução salina tamponada com fosfato FBS | Invitrogen | ||
| Reagente de transfeção FuGENE 6 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche Group | ||
| Água sanitária | Clorox | ||
| Placas de cultura celular de 10 cm Placas de cultura celular de 96 poços | Falcon BD | 353003 | |
| Pipeta multicanal | Rainin | ||
| Pontas de pipeta com filtro | Rainin | ||
| Tubos Eppendorf de 1,5 ml Seringa Filtro de seringa (0,45-μm) | Eppendorf | ||
| Tubos para ultracentrifugação | Beckman Coulter Inc. | ||
| Incubadora de cultura de tecidos a 5% CO2 | Coulter | ||
| Rotor Beckman SW41T.I | |||
| Ultracentrífuga Beckman | Beckman Coulter Inc. | ||
| Microscópio fluorescente | Coulter | ||
| FACS Array | Beckman Coulter Inc. |
Referências
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
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Reimpressões e permissões
