Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Resumo

Para muitos estudos científicos que requerem uma análise biológica e química de populações de células as células devem estar em um alto estado de pureza. Separação de células ativadas por fluorescência (FACS) é um método superior para a obtenção de populações celulares puras.

Resumo

Estudos experimentais e clínicos muitas vezes exigem altamente purificada populações de células. FACS é uma técnica de escolha para purificar populações de células de fenótipo conhecido. Métodos granel outras de purificação incluem esgotamento complemento panning, e separação grânulo magnético. No entanto, FACS tem várias vantagens sobre outros métodos disponíveis. FACS é o método preferido quando a pureza muito elevada da população desejada é necessário, quando a população de células-alvo expressa um nível muito baixo do marcador de identificação ou quando as populações de células requerem a separação com base na densidade marcador diferencial. Além disso, FACS é a única técnica de purificação disponíveis para isolar as células com base na coloração interna ou a expressão da proteína intracelular, como um marcador de proteína geneticamente modificados fluorescentes. FACS permite a purificação de células individuais com base na granularidade tamanho, e fluorescência. A fim de purificar as células de interesse, são marcadas com fluorescência primeiro-tagged anticorpos monoclonais (mAb), que reconhecem marcadores de superfície específicos sobre a população de células desejado (1). Seleção negativa das células imaculada também é possível. Purificação FACS requer um citômetro de fluxo com a classificação da capacidade e do software apropriado. Para FACS, células em suspensão são passados ​​como um fluxo em gotas com cada uma contendo uma única célula na frente de um laser. O sistema de detecção de fluorescência detecta células de interesse com base em parâmetros pré-determinados fluorescentes das células. O instrumento aplica uma carga para a gota contendo uma célula de interesse e um sistema de deflexão eletrostática facilita a coleta das gotas cobrados em tubos de recolha apropriado (2). O sucesso da coloração e, assim, a classificação depende muito da seleção dos marcadores identificação e escolha de mAb. Parâmetros de classificação pode ser ajustada dependendo da exigência de pureza e rendimento. Embora FACS requer equipamento especializado e treinamento de pessoal, é o método de escolha para o isolamento de populações de células altamente purificado.

Protocolo

1. Antes de iniciar o processo, os seguintes itens precisam ser coletados e preparados:
   1. Gelo
   2. 15 ml tubos cônicos para as células de coloração e 12 x 75 mm para tubos de fluxo coloração controles de cor única.
   3. Coloração buffer: tampão fosfato (PBS) + 3% de soro fetal bovino (FCS)
   4. Pipetas
   5. Fc bloco (se necessário) e anticorpos coloração. Anticorpos devem ser titulada para a coloração ideal.
   6. Esferas de compensação
   7. Buffer de suspensão: Solução de Hank salina balanceada (HBSS) + 25 mM HEPES + FCS 3%
   8. Trypan azul e hemocitômetro
   9. Célula filtro (40 Nylon mm)
   10. Tubos de coleta: Dois tipos de tubos de coleta pode ser usado a) 12 x 75 mm tubos de poliestireno (contendo 300 mL FCS e 25 mM HEPES) ou b) 15 ml tubos cônicos (contendo 1 ml + 25 FCS HEPES mM). Qualquer meio rico com concentração sérica elevada pode ser utilizado para a coleta de células classificadas.
2. Gerar uma suspensão única célula da população celular de partida.
3. Opcional: Enriqueça para a população de célula desejada por um método de purificação a granel, tais como o esgotamento de complemento ou de triagem magnética. A principal vantagem da etapa de enriquecimento é que ele reduz o tempo de classificação.
4. Lave as células uma vez com coloração buffer.
5. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em coloração tampão com uma concentração até 50 x 10 ⁶ para a coloração eficiente.
6. Opcional: Para as células expressando altos níveis de FcR, bloqueiam os receptores usando um método apropriado de bloqueio. Um método de escolha é o uso de um mAb que se liga a FcγR no gelo por 10-15 min. Estes anticorpos são disponíveis comercialmente.
7. Adicione o mAb apropriado (em uma concentração predeterminada) para manchar a população de células desejada e incubar por 20-30 min no gelo, no escuro, seguido de duas lavagens com tampão de coloração. Opcional: coloração com um corante vital, como o iodeto de propídio, podem ser incluídos para discernir as células mortas (5). Se multi-cor coloração é para ser usado, controles de cor única são obrigatórios. Usamos CompBeads BD para preparar controles única cor usando o protocolo do fabricante.
8. Se não estiver usando anticorpos conjugados diretamente, repita o passo 7 utilizando o anticorpo secundário apropriado ou o conjugado estreptavidina.
9. Após a lavagem, ressuspender as células em meio de cultura e determinar a concentração celular utilizando um corante vital, como Trypan azul.
10. Ajustar a concentração de células de 15-20 x 10 ⁶ / ml. Para as populações de células que formam grupos, que podem entupir o instrumento durante a classificação, filtro as células através de um filtro.
11. Configurar e otimizar o classificador de celular. O processo de criação de um citômetro de fluxo é variado, dependendo da produção e deve ser realizada por pessoal devidamente treinado.
    As recomendações gerais são as seguintes:
    1. Selecione o bico apropriado, dependendo do tipo de célula a ser classificado.
    2. Para os tipos estéril, esterilizar o instrumento.
    3. Executar o controle de instrumento de qualidade com contas para verificar lasers estão funcionando, e é classificar com precisão.
    4. Instalar o dispositivo de coleta necessárias e configurar os fluxos lado.
    5. Olhe para o instrumento a laser e detector constituída para apurar as etiquetas fluorescentes que podem ser usados ​​(o nosso BD FACS Aria tem três lasers e pode detectar até nove cores).
    6. Uma vez que é determinado o que etiquetas fluorescentes serão usados ​​no classificador de celular, a compensação pode ser realizada (conforme explicado abaixo).
12. Efetuar a compensação usando a amostra de controle negativo e os controles único positivo. Compensação é necessário remover a sobreposição de espectro entre dois detectores. É pertinente observar que a compensação não é infalível e é prejudicada pela forma como brilhantemente certos marcadores mancha, e por fluorescência das células que têm autofluorescência baixa, o que pode levar à baixa resolução entre as populações dim e negativos.
    Para melhores resultados, o projeto experimental deve incluir o uso de fluorocromos brilhante com marcadores que têm baixa expressão ou que não têm um padrão de coloração conhecidas. Marcadores que proporcionam uma boa separação entre as populações de células e são altamente expressa deve ser usado com fluorocromos dímero como aqueles animado com lasers vermelho ou violeta.
    1. Compensação pode ser realizada com esferas de compensação, que são micropartículas de poliestireno que foram acopladas a um anticorpo específico para a cadeia leve Kappa de Ig de camundongo, rato, ou o rato / hamster. As contas são fáceis de manchar, tem um sinal robusto e fornecer uma maneira fácil de preparar único controles que têm manchado o fluoróforo mesmo que as amostras experimentais.
    2. Criar um modelo que inclui uma trama bivariada para mostrar dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC), e um histograma paracada fluorocromo que será usado.
    3. Executar o tubo de controle negativo e ajustar a dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) para colocar a população de interesse na escala.
    4. Ajustar as configurações PMT fluorescência para colocar a população negativa ou autofluorescência na parte de mão à esquerda do histograma.
    5. Registro do tubo de controle negativo.
    6. Execute o único tubos de controle positivo e gravar os dados de cada tubo.
    7. Desenhe um portão de intervalo em torno da parte positiva dos dados no histograma, e outro portão intervalo na parte negativa do histograma.
    8. Compensação manual é feito através do ajuste da mediana (mediana é uma melhor estimativa de tendência central que a média em uma escala logarítmica) dos aspectos positivos até que seja igual à mediana dos negativos. Isso deve ser feito para cada um dos rótulos fluorocromo utilizado no experimento.
    9. Para ajustar a mediana, ajustar os valores espectrais de sobreposição maior ou menor até que as medianas para cada jogo parâmetro fluorescente, tanto quanto possível.
    10. Compensação também pode ser feito automaticamente com o software de análise. Compensação automática utiliza os dados gravados a partir de controles de compensação para calcular uma matriz algébrica para todos os fluoróforos usados ​​no experimento. Estes valores são usados ​​para subtrair as contribuições das cores não primárias que estão sangrando no detector uma cor primária.
13. Registro da amostra experimental a ser classificada e utilizar ferramentas e métodos de propagação subsetting para definir as populações de interesse.
    1. Configurar o modelo experimental com um gráfico de pontos que exibe FSC versus SSC e usar uma ferramenta de propagação, polígono, retângulo intervalo, ou quadrante ao portão da população de interesse. O gráfico de dispersão mostra as propriedades físicas da célula que é diferente para o tipo de célula.
    2. A melhor maneira de determinar a estratégia de propagação de fluorescência é a utilização de fluorescência menos um (FMO) controles. Em um tubo de controle de FMO todos os reagentes que são usados ​​no experimento estão incluídos, exceto para o de interesse. A FMO ajuda a discriminar entre populações vagamente manchada e ampla populações negativas.
    3. Use os dados gravados a partir de tubos FMO para determinar onde colocar portas no interior do tubo experimental.
14. Uma vez que portões foram determinados, os portões podem ser selecionados para a classificação em tubos de coleta externa. Até quatro portas (ou populações) podem ser classificados de uma só vez, dependendo da instrumentação disponível.
15. Executar o tubo de amostra experimental a 4 ° C, ligar placas de deflexão, e classificar a amostra. 5 x 10 ⁵ -1,5 x 10 ⁶ células podem ser classificadas em um tubo de 12 mm x 75 e 1,5 x 10 ⁶ - 4.5 x 10 ⁶ células podem ser classificadas em a 15 ml.
16. Uma vez que o número necessário de células foi obtida, manualmente parar de classificação.
17. Realizar uma análise pós-classificação para determinar a pureza das populações de células classificadas.

Resultados representativos

Nós temos mostrado aqui resultados para B do mouse esplênica e classificação de células CD4 T (Figura 1). Esplenócitos foram coradas com PE Texas Red-conjugado anti-rato-B220, FITC-conjugado TCRβ anti-rato e Alexafluor-700-conjugado anti-CD4 do mouse para identificar as células B (B220 + TCRβ) e CD4 células T (CD4 + + TCRβ ). A classificação foi realizada com instrumento Aria BD FACS. Após a triagem a pureza de células B foi> 97% e as células T CD4 pureza foi> 98%.

Figura 1. Pureza de células B do baço e os linfócitos T CD4 células após FACS. Esplenócitos de camundongos foram corados com anti-rato B220, TCRβ e anticorpos CD4. FACS para as células B foi realizada utilizando uma BD FACS Aria pela passagem em B220 + TCRβ células (Fig. 1A, painel esquerdo, quadrante inferior direito). Uma análise pós espécie foi realizada para determinar a pureza das células B (Fig. 1A, painel direito). Coloração B220 é mostrado no eixo-x e coloração TCRβ sobre o eixo-y. FACS para as células T CD4 foi realizada utilizando o citômetro de fluxo mesmo pela passagem em TCRβ + células CD4 + (Figura 1B, painel esquerdo, no quadrante superior direito). Uma análise pós espécie foi realizada para determinar a pureza das células CD4 T (Fig. 1B, painel direito). Coloração TCRβ é mostrado no eixo-x e CD4 coloração no eixo-y. As células positivas por cento em cada quadrante é mostrado.

Discussão

FACS é uma técnica altamente sofisticada para purificar populações celulares de interesse, em que uma pureza muito alta (95-100%) da população classificada pode ser obtida. Portanto, essa técnica é particularmente importante para os experimentos, onde de alta pureza é um requisito essencial (análise de microarray, por exemplo). FACS é particularmente vantajoso em relação a outros métodos disponíveis de purificação, quando uma população de células precisa ser purificada com base em um marcador de superfície semanal expressa ou quando duas ou mais populações precisam ser purificados, que têm diferentes níveis de expressão do marcador mesma superfície. Por exemplo, a purificação da zona marginal células B (B220 ⁺ CD21 ^oi CD23 ^{int / baixo)} e B folicular de células (B220 ⁺ CD21 ^{int / baixa} CD23 ^oi) com base em níveis de expressão de CD21 e CD23. Outra aplicação crescente de classificação FACS é única célula permitindo a análise de células individuais (3, 4). FACS também é comumente usado para classificar as células que expressam proteínas fluorescentes que são geneticamente expressa, como o verde proteínas proteína fluorescente etiquetados (5). Se uma espécie estéril é realizada as células podem ser cultivadas. No entanto, a viabilidade celular ea produção pode ser comprometida durante a classificação. Viabilidade pode ser melhorada usando uma temperatura da célula-dependente ideal para a classificação e processamento de tubos de coleta imediatamente após atingir a capacidade. Recuperação pode ser aumentado usando tubos de coleta de polipropileno, coletando células classificadas no soro de mídia rica e tubos de coleta invertendo de forma intermitente, mantendo-se tubos de coleta a uma temperatura ideal e centrifugação células classificadas para ~ 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm).

O desenvolvimento de ultra-alta velocidade classificadores ampliou a possibilidade da aplicação da filtragem de fluidos em ambientes clínicos. As aplicações potenciais incluem FACS clínica de purificação de células-tronco do sangue do sangue humano para fins terapêuticos, as aplicações na terapia do câncer, a reposição de amniocentese, a classificação do esperma humano e detecções precoce da doença (6, 7).

Para a coloração multicolor, a seleção de anticorpos é uma etapa crítica e fluorocromos são escolhidos com base no sistema de detecção para cada instrumento particular. Há um número de empresas que vendem celulares e classificadores a configuração do laser varia de acordo com as necessidades do usuário. Assim não se pode simplesmente usar os anticorpos exatamente o mesmo utilizado em estudos publicados sem confirmar a compatibilidade. Para seleção de anticorpos ideal, deve-se considerar o nível de expressão da proteína que está sendo examinado. Em geral, o mais brilhante disponíveis anticorpos fluorocromo-tag deve ser usado para manchar marcadores de superfície vagamente expressos, enquanto fluorocromos dim pode ser usado para a coloração de marcadores de superfície altamente expresso (8). Além disso, os anticorpos devem ser selecionados de tal forma que se sobrepõem entre seus espectros de emissão é mínima. Para a coloração multicolor, é extremamente difícil escolher fluorocromo que não têm sobreposição espectral. Nesta situação, a compensação é realizada.

Compensação é necessário matematicamente eliminar a sobreposição entre o espectro de fluorescência emissões dos vários fluorocromos que é mensurável pelos detectores (8-10). Em outras palavras, a sobreposição de fluorescência de um fluorocromo é subtraído do espectro de emissão de outro fluorocromo. O cálculo da compensação requer um controle sem mácula e única controles positivos para cada fluorocromo usado para uma coloração multicolor (9, 10). Compensação pode ser realizada utilizando células ou grânulos. As contas são fáceis de manchar, tem um sinal robusto e fornecer uma maneira fácil de preparar único controles que têm manchado a fluoróforos mesmo que as amostras experimentais. Contas de compensação são particularmente vantajoso quando a proteína de superfície de células de interesse é expressa em um nível baixo e quando a população de células de interesse é limitante na população de células iniciais de partida.

Uma vez que os anticorpos foram escolhidos, sua atividade deve ser otimizado através da realização de uma análise de titulação. Isto é particularmente importante se a máquina tem FACS lasers altamente poderoso. O uso de concentrações de anticorpos suboptimal coloração pode resultar na separação pobres da população de células desejado a partir da população celular total. O uso da concentração dos anticorpos alta aumenta a chance para a coloração de antígenos não-específicas. Portanto, a titulação de anticorpos permitirá a seleção da concentração de anticorpos que dá o brilho máximo da população positiva e coloração de fundo mínima (8).

FACS é agora uma técnica padrão para a purificação de subpopulações de células. Ela pode ser usada para separar qualquer tipo de célula em que uma suspensão única célula pode ser gerado e anticorpos estão disponíveis para identificar a população de células desejado. FACS é o método de escolha quando highly populações celulares puras são obrigatórios.