SC1 funções através da inibição dual de Ras-GAP e ERK1. Testamos a função de SC1 no apoio célula do rato ES auto-renovação, na ausência de LIF e mostrou que SC1 é capaz de manter a auto-renovação de culturas de células de rato ES.
Artigo de método
O uso de SC1 (Pluripotin) para Suporte MESC auto-renovação na ausência de LIF
Neste artigo
Resumo
Resumo
Rato-tronco embrionárias (ES), as células são convencionalmente cultivados com fator inibitório de leucemia (LIF) para manter a auto-renovação.
Protocolo
1. Preparação das placas de alimentação MEF
- Um dia antes de as células ES de cultura, frasco de descongelar um dos irradiados E14.5 CF-1 células alimentadoras MEF (veja nosso procedimento para descongelar células ES).
- A placa de células alimentadoras MEF a uma densidade de 10.000 células / poço em uma placa de 12 poços. Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% CO 2. MEF célula mídia: DMEM suplementado com 10% ES-PBS, 1X e 1X glutamina não-aminoácidos essenciais.
2. Manutenção da auto-renovação das células ES rato
- Separar as células ES usando tripsina. Semente as células a uma densidade de 50.000 células / poço sobre as placas MEF previamente preparado alimentador em meios de crescimento (MEM suplementado com Knockout KSR 15%, 4 mM L-glutamina, 0,1 mM não-aminoácidos essenciais e 1X BME) suplementado com SC1 na concentração desejada (usamos 100 nM, 300 nM e 1 mM). Nós também adicionamos um controle positivo bem que foi complementado com 1000 μ / ml de LIF. Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% CO 2.
- Cultura das células a 37 ° C e 5% CO 2 por 3-4 dias em cada passagem. Atualizar media a cada 48 horas.
- Células passagem 1:10 - 01:15 com tripsina para manter uma densidade semelhante como a densidade de semeadura inicial. Depois de cinco passagens, as células podem ser examinados para a expressão de marcadores de pluripotência típico usando imunocitoquímica.
3. Exame imunocitoquímico de marcadores pluripotência
- Lave suavemente as células três vezes com PBS.
- Fixar as células com 500 mL de fixador por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Lave suavemente as células três vezes com PBS.
- Bloco de ligação não específica com 500 mL de buffer de bloqueio para uma hora em temperatura ambiente.
- Incubar as células com 250 mL do anticorpo primário específico (usamos Nanog, Sox2, SSEA1 e Oct4 nas seguintes diluições: 1:500, 1:2000, 1:500 e 1:500)
- Lave suavemente as células três vezes com PBS.
- Incubar as células com 250 mL de anticorpo secundário por duas horas à temperatura ambiente, mantendo-se longe da luz (usamos burro anti-rato conjugada com Alexa Fluor ® 555 a 1:2000 e anti-burro coelho conjugados com Alexa Fluor ® 488 em 1 : 2000).
- Lave suavemente as células três vezes com PBS.
- Adicionar DAPI (concentração final de 1 mg / ml) para a última lavagem e incubar 5 minutos para visualizar núcleos.
- Analisar as células em um microscópio fluorescente.
4. Resultados representativos:
1. Morfologia resultados:
Células de camundongo ES (ESC R1) foram cultivadas em células alimentadoras MEF na presença de qualquer LIF ou SC1 para sustentar a auto-renovação em um estado indiferenciado. Após a segunda passagem, a diferenciação pode ser observada em células sem LIF ou SC1 (controle negativo) e depois de 5 passagens essencialmente nenhuma colônias indiferenciado foram observados. LIF (controle positivo) colónias tratadas permaneceu em um estado indiferenciado, durante o 5 passagens celular. Células tratadas com SC1 em concentrações de 300 nm ou 100 nM também permaneceu indiferenciado após 5 passagens, no entanto, as células tratadas com 1 mM morte celular SC1 experimentado após a quarta passagem. (Fig. 2 de nota app) A Tabela 1 resume as observações morfológicas.
2. Expressão de marcadores pluripotência
Células-tronco embrionárias de rato mantidos por 5 passagens foram fixados e analisados por imunocitoquímica para SSEA1, Oct4, Sox2 e Nanog. Expressão do marcador foi semelhante às células mantidas em LIF. (Fig. 3 e 4 de nota app)
Figura 1: comparação Morfologia de células mantidas em LIF ou SC1. Nenhuma diferença na morfologia foi observada.
Figura 2 e Figura 3: Nanog, SSEA1, Sox2 e Oct4 coloração de células ES mantido com SC1 ou LIF (fig. 4 de nota app). Células mantidas em SC1 mostram expressão do marcador semelhante pluripotência das células mantidas em LIF.
Tabela 1
| Controle negativo | LIF Controle Positivo | SC1 1um | SC1 300 nM | SC1 100 nM | |
| 1 Passagem | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES |
| Passagem 2 | Alguns morfologia diferenciada | E normaisS morfologia celular | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES |
| Passage 3 | Maioria das células diferenciadas | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES |
| Passagem 4 | Não colônias ESC | Morfologia das células normais ES | Morte celular observado | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES |
| Passagem 5 | diferenciado | Morfologia das células normais ES | Morte celular observado | Morfologia das células normais ES | Morfologia das células normais ES |
Discussão
O SC1 pequena molécula pode ser usada para manter a auto-renovação, com um estado indiferenciado em células ES mouse. Antes de usar em uma linhagem de células não testados, no entanto, deve ser titulada para determinar a concentração ideal. Por exemplo, testamos três concentrações no ES célula do rato linha ESC R1. 100 nM e 300 nM concentrações foram capazes de sustentar as células ES mouse, no entanto, uma concentração de 1 mM era tóxico.
SC1 também pode ser usado sob alimentação livre de condições.
Divulgações
Os autores deste artigo são empregados por Stemgent que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Sheng Ding do The Scripps Research Institute e Dr. Deng Hongkui da Universidade de Pequim por sua assistência e direção.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| SC1 | Stemgent | 04-0011 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| anticorpo SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 21702 | |
| anticorpo Nanog | Abcam | ab21603 | |
| anticorpo Sox2 | Chemicon International | Ab5603 | |
| anticorpo Oct4 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-5279 |
Referências
- Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).
Reimpressões e permissões
