O peixe-zebra maxilar barbo é um órgão do sentido tegumentar contendo ectodérmica, mesodérmica e derivados da crista neural. Importante, o barbo adulta consegue regenerar após a amputação proximal. Este vídeo apresenta o desenvolvimento barbel maxilar e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração, seguido por incorporação de coleta, ea jusante de imagens de espécimes barbos.
Artigo de método
Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel
Neste artigo
Resumo
Resumo
Barbos são apêndices sensoriais da pele encontrados em peixes, répteis e anfíbios. O peixe-zebra, Danio rerio, desenvolve dois pares de barbos-um par de curto nasal e um par mais maxilar. Barbel tecido contém células de origem ectodérmica, mesodérmica e origem da crista neural, incluindo as células da pele, glândulas, papilas gustativas, os melanócitos, vasos circulatórios e nervos sensoriais. Diferentemente da maioria dos tecidos adultos, o barbo maxilar é opticamente clara, o que nos permite visualizar o desenvolvimento ea manutenção destes tipos de tecidos em todo o ciclo de vida.
Este vídeo mostra o desenvolvimento inicial do barbo maxilar (início cerca de um mês pós-fertilização) e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração no apêndice adultos (> 3 meses pós-fertilização). Resumidamente, o barbo maxilar esquerdo de um peixe é elevado anestesiados com pinças esterilizadas imediatamente distal à borda caudal da maxila. Uma multa, tesoura primavera estéril é posicionado contra a pinça para cortar o eixo do barbo, a este nível, estabelecendo um marco anatômico para o plano de amputação. Crescimento regenerativa pode ser medida com relação a este plano, e em comparação com o barbo contralateral. Barbel tecido se regenera rapidamente, atingindo regrowth máxima dentro de 2 semanas da lesão.
Técnicas de análise do barbo regeneradas incluem dissecar e incorporação de pares de barbos (regenerar e controle) nos poços de um gel de eletroforese de DNA padrão. Espécimes incorporados são convenientemente fotografados em um estereomicroscópio para a morfologia e morfometria bruta, e pode ser armazenado durante semanas antes de aplicações a jusante como histologia parafina, cryosectioning, e / ou imuno-histoquímica montar todo. Estes métodos estabelecer o barbo maxilar como um romance no sistema de tecido vivo para estudar a capacidade de regeneração dos vários tipos de células dentro do contexto genético de peixe-zebra.
Protocolo
Zebrafish criação
Peixe-zebra são alojados e criados de acordo com métodos padronizados 1. Passado o período tardio larval, o estágio de desenvolvimento de um peixe-zebra pode ser medido pelo seu comprimento padrão (SL), ou a distância em linha reta em milímetros do ponto anteriormost do lábio superior para a base da nadadeira caudal (placa hypural posteriormost) 2. Em aproximadamente um mês após a fertilização (10-12 mm SL), o barbos nasal e maxilar aparecer como transparente brotos epiteliais perto do pits olfativa e nos cantos posterior da maxila, respectivamente. Como o peixe-zebra amadurece, a estender-se barbos estreito, whisker-como apêndices. Porque o barbo maxilar é maior (2-3 mm) e mais fácil de manipular, nosso protocolo aplica-se somente a este apêndice particular; técnicas semelhantes, no entanto, poderia ser adaptada para o menor nasal barbos.
Clipping Barbel
- Anestesiar zebrafish adulto na fase desejada (por exemplo., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 meses pós-fertilização) por imersão em 0,015% MS-222 (3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato) tamponada a 7,0 pH em água do sistema. Observe os movimentos até parar de nadar e ventilação branquial torna-se lenta e regular. Dependendo do tamanho do peixe, anestesia completa demora cerca de 05/02 minutos.
- Usando um arrastão aquário, peixes de transferência de 1-3 em um momento de um pedaço dobrado de papel toalha molhada em uma placa de Petri. Usando uma espátula sem corte, orientar o peixe assim que são paralelos uns aos outro lado e lateral esquerdo para cima. Parte dobra da toalha de papel molhado sobre a parte caudal do peixe, cobrindo todo o corpo até o opérculo (guelra cobre) para manter a pele e as guelras úmidas durante o procedimento.
- Ver a placa de Petri sob estereomicroscópio, utilizando-se de baixo ângulo de luz incidente para iluminar a região da cabeça. Foco na base do barbo maxilar esquerdo, que se projeta a partir do canto posterior ventral da maxila (Fig. 1).
Figura 1. - Firmemente segure o eixo do barbo ligeiramente para a extremidade distal da maxila. Elevar o eixo barbo e inserir as mandíbulas de uma tesoura de ponta fina de primavera apenas proximal ao fórceps. A tesoura pode ser tocado com a pinça para a estabilidade. Deslize as mandíbulas da tesoura ao longo do eixo do barbo até que a ponta se aproxima da borda da maxila. Fechar a tesoura para cortar através do eixo barbos. O barbo amputada, ainda agarrado na pinça, pode ser removido para a fixação ou observação posterior.
- Transferir imediatamente o peixe para um pequeno tanque de água sistema limpo (~ 500 mL) contendo uma gota de azul de metileno para controlar a infecção fúngica superficial. Permitir que o peixe se recuperar durante a noite. Na manhã seguinte, devolver o peixe para o sistema de criação. Barbel regeneração é máxima após 2 semanas.
Incorporação de Agar Pares Barbel
- Coletar peixes pela técnica apropriada a eutanásia e fixar em um tubo de 50 mL de paraformaldeído 4% tampão fosfato (PBS) com agitação a 4 ° C durante a noite. O volume de fixador deve ser pelo menos dez vezes o volume do tecido. Após a fixação, descarte de resíduos paraformaldeído em um recipiente aprovado e lavar o tecido completamente em diversas mudanças de PBS.
- Prepare em um mL de vidro 250 ml frasco 150 de 2% agarose (T m ~ 37 ° C) em água destilada. Calor com um microondas ou chapa quente, agitando periodicamente até que esteja completamente dissolvido. Equilibrar a solução fundida em um banho de água 50-60 ° C.
- Montar um equipamento de eletroforese em gel padrão, colocando um molde de gel vedado pequena (10 x 10 cm; ~ 100 mL de volume gel) firmemente contra os lados da câmara de buffer. Adicionar 2-4 pequena amostra pentes de dentes (4 x 1,5 mm).
- Sobre uma superfície plana, coloque a agarose derretida no molde para cobrir apenas a base dos favos, formando poços muito superficial. Imediatamente coloque a agarose sobra volta para o banho de água morna, que será usado posteriormente para incorporar o tecido (Passos 9-12). Coloque um copo longo Pasteur pipeta no frasco para manter a pipeta para a mesma temperatura que a agarose.
- Permita que o gel para endurecer por 20-30 minutos. Remover os favos, em seguida, retire o molde gel contendo o gel endurecido da câmara de buffer. Firmemente a fita lados abertos do molde gel com fita de laboratório para que o gel não deslize para fora. Esta fita deve se estender vários milímetros sobre a superfície do agarose para que agarose adicionais podem ser adicionados mais tarde (Passo 13).
- Posicione o molde de gel no palco de um estereomicroscópio. Ampliar um poço vazio e trazer as bordas em foco.
- Sobre a superfície do agarose ao lado do bem, pipetar uma gota de água ou tampão contendo os espécimes fixos barbo (por exemplo, regenerar, e controle). Using dobrados pinos de insetos, arraste as amostras úmidas para dentro do poço e empurrá-los para o fundo. Orientar o barbo eixos paralelos um ao outro e alinhados contra oposto bordas longas do poço. Tensão superficial vai ajudar a segurar o tecido na posição.
- Quando estiver pronto para incorporar, use uma ponteira fina ou o canto de um tecido de laboratório para remover o excesso de fluido do poço. Trabalhar rapidamente para não deixar o tecido secar.
- Usando a pipeta Pasteur de vidro aquecido, gentilmente pipeta fresco agarose derretida e em torno da espécimes para selar o tecido barbo no lugar. Não encha demais. Antes da agarose endurece, fazer adaptações de última hora com os pinos de insetos.
- Coloque uma etiqueta numerada exemplar de papel ao lado do bem e prenda-o com uma pequena gota de agarose.
- Repita os passos 6 a 10 para cada poço de espécimes.
- Se desejar para a calibração da imagem, inserir um pedaço de papel com uma escala micrométrica impressos (por exemplo, http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) no fundo de um poço vazio. Achatar o papel para o fundo do poço e cobri-lo com agarose quente.
- Depois de todos os espécimes são incorporados, a superfície do gel será irregular, com gotas de agarose endurecido. Coloque o gel sobre uma superfície plana e gentilmente despeje adicionais agarose derretida até a superfície superior é uniforme. Use a menor quantidade de agarose necessário para obter uma superfície lisa; muito agarose vai obscura de luz de transmissão fotografia. Permitir que esta camada superior para endurecer.
- O gel pode agora ser fotografado no palco de um estereomicroscópio para registrar morfologia bruta para cada par de barbo. Calibração da imagem é obtida por fotografar a escala micrométrica incorporado.
- O gel inteiro pode ser armazenado envolto em toalhas de papel molhado e selado em um saco plástico a 4 ° por várias semanas.
- Para posterior análise, blocos de ágar contendo par casado de barbos podem ser cortadas do gel com uma lâmina de bisturi ou navalha e processados para exame histológico de parafina ou cryosectioning por métodos padrão 3,4. Alternativamente, barbos individuais podem ser dissecados fora da agarose com agulhas finas, lavadas em água, e processados para outras aplicações a jusante (por exemplo, imuno-histoquímica todo-mount ou microscopia confocal).
Discussão
O peixe-zebra maxilar barbo é um sistema de tecido subutilizados para estudar o crescimento, manutenção e regeneração de vários tipos de células no zebrafish. Embora o apêndice barbel não tem analógico humanos, os tipos de células que contém são altamente conservadas, tornando possível o estudo da pele, glândulas, vasos melanócitos, circulatório e os nervos em uma estrutura opticamente clara e anatomicamente simples cilíndrico. Semelhante ao fin bem estudado caudal, tecido barbel podem ser induzidas a regenerar pela amputação. Usando a fronteira da maxila como um marco anatômico, o plano de amputação pode ser colocado com precisão, facilitando a medição de barbo rebrota. Para um operador experiente, cada cirurgia leva apenas alguns segundos. A recuperação é rápida, e nós temos até agora não detectaram efeitos a curto ou a longo prazo sobre o comportamento dos peixes. Peixe-zebra com um mergulho barbel maxilar, comer e raça de forma tão eficaz como controles não-cirúrgico, e têm a sobrevivência comparável ao momento da coleta de tecido, até 6 meses após a cirurgia. O impacto fisiológico da cirurgia prevista para ser mínimo, porque 1) o paladar extraoral transportados no barbo também são encontrados em muitas outras partes do epitélio de peixes, incluindo lábios, bochechas e cabeça 5, e 2) papilas gustativas diferenciar aparecem no o barbo regeneração dentro de 72 horas (LeClair et al., dados não publicados). Isso torna o barbo maxilar um sistema minimamente invasivo para estudar a cicatrização de feridas, a revascularização e reinervação no contexto de um vertebrado adulto.
Após a indução cirúrgica de regeneração, barbos podem ser coletados em intervalos de medição morfométricas e / ou análise microscópica do tecido fixo. Convenientemente, o barbo maxilar é aproximadamente o comprimento (2-3 mm) e diâmetro (100-200 mm) de um embrião de peixe-zebra, facilitando a aplicação de muitos protocolos padrão, incluindo histologia de parafina, cryosectioning, todo-mount imuno-histoquímica, e in situ hibridização. Em conjunto, estas características tornam o barbo maxilar altamente viável em modelo in vivo para estudar reparo e regeneração tecidual.
Agradecimentos
Estes métodos foram desenvolvidos por EEL durante uma licença de pesquisa no laboratório de Apoio JT foi fornecido pela Universidade DePaul Research Council e um NIH / NIDCR R01 conceder ao JT (DE016678). Agradecemos os esforços de Hunter Caroline, técnico de cuidados de animais nas instalações do núcleo zebrafish CMRC e Pawluczuk Paulina, a nossa assistente de laboratório de graduação.
Materiais
Equipamentos microscópio
Um microscópio estéreo dissecando com transmitida e iluminação incidente de fibra óptica é necessário para barbel clipping e incorporação de agar.
Clipping Barbel
- Água do sistema de peixe
- 2 tanques de peixe-zebra cruzamento
- MS-222 (3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato; Sigma Chemical # E10521-10G)
- estéril de 120 mm placa de Petri
- toalhas de papel molhado
- espátula de metal sem corte
- Dumont # 55 Bio Inox Pinça (Ferramentas Ciência Belas # 11255-20)
- Mini-Vannas primavera tesouras (Ferramentas Ciência Belas # 15000-00)
- metileno agente antifúngico azul (Drs. Foster & Smith # CD-905781)
- pequeno aquário fishnet
Coleta de tecido e incorporação de agar
- 4% paraformaldeído em 1x tampão fosfato (PBS-PF), até aliquotado em tubos cônicos de 50 mL e armazenadas congeladas a -20 ° C use
- 1x tampão fosfato (pH 7,27-6)
- 250 mL frasco de vidro
- Agarose 2% em água destilada
- padrão pequena plataforma eletroforese em gel de agarose (gel tamanho = ~ 10 cm quadrado)
- pequeno pente de dentes amostra de eletroforese (tamanho pente 4 x 1,5 mm)
- banho de água morna (50-60 ° C)
- fita de laboratório
- preto esmaltado pinos de insetos, o tamanho 000 (Ferramentas Ciência Belas # 26000-25)
- 02/01 retentores de pinos (ferramentas de Ciência Belas # 26016-12)
- De 9 polegadas de vidro Pasteur pipeta
- pipeta lâmpada ou bomba
- tecidos de laboratório
- pequenas etiquetas de papel
- (Opcional) escala de calibração impressa
- toalhas de papel molhado
- zip encerramento saco plástico
- bisturi / lâmina de barbear (para cortar blocos de agar)
Referências
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
Reimpressões e permissões
