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Construção de vetor de expressão e de expressão:
O vetor de expressão pSESAME-Cre foi construído através da inserção de um fragmento de Cre-codificação em pSESAME através de sites e AvrII NheI restrição utilizando os métodos de clonagem padrão. pSESAME codifica uma proteína de fusão que consiste de uma tag histidina, TAT-domínio, a seqüência NLS e Cre, abreviado HTNCre. À manifestação de HTNCre o pSESAME-Cre foi transformado em TUNER (DE3) pLacI e usado para preparar um estoque de glicerol.
- Uma cultura de over-noite, foi inoculado com uma ponta de pipeta revestidos com bactérias transformadas a partir do estoque de glicerol. A cultura noite mais consistia em media LB suplementado com glicose 0,5% [v / v] e carbenicilina numa concentração final de 50 mcg / mL e foi autorizado a crescer a 37 ° C por 16 horas.
- Dia seguinte, a densamente cresceu durante a noite de cultura foi usada para inocular a cultura de expressão na proporção de 1 a 40 e foi colocado em uma incubadora a 37 ° C. Cultura consistia expressão dos meios de comunicação TB suplementado com glicose 0,5% [v / v] e ampicilina na concentração final de 100 mcg / mL.
- Em um OD 595 de 1,5 a cultura expressão foi induzida com IPTG 0,5 mM por 1 h.
- Posteriormente as bactérias foram coletadas por centrifugação a 5000 rpm por 10 minutos em um rotor SLA3000.
- Pellets bactérias foram armazenadas a -20 ° C até a purificação.
Purificação de proteínas de células-permeável:
- Pellets congelados bactérias foram ressuspendidas em 10 mL tampão de lise por cultura frasco litro por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Suspensão foi, então, incubadas com lisozima 1 mg / mL para o adicional de 15 minutos, enquanto a mistura em temperatura ambiente.
- 25 U / mL benzonase foi adicionado depois e incubados durante a mistura por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Depois de sonorização no gelo por 1,5 min com 0,5 pulsos s em 45% do poder, 1 mL de buffer sal fria tartárico (TSB) por mL de suspensão foi cuidadosamente adicionado durante a mistura e incubado por 5 min no gelo. SDS-PAGE da amostra da fração lisado (L) foi tirada.
- Lisado limpo foi obtida por centrifugação a 4 ° C por 30 min a 30.000 g. SDS-PAGE de amostras das frações solúvel (S) e insolúvel (I) foram tomadas.
- O sobrenadante foi transferido para novos tubos de 50 mL falcon e foi então delicadamente misturados por 1 hora a 4 ° C com 2 mL de 50% Ni-NTA suspensão por litro de cultura expressão inicial.
- A suspensão foi embalado em um fluxo de gravidade coluna EconoPac (SDS-PAGE amostra de fluxo através fração (FT) foi tomada) e lavadas duas vezes com 5 leitos volumes de tampão de lavagem. SDS-PAGE de amostras de ambas as frações de lavagem (W1 e W2) foram coletados.
- HTNCre contendo frações foram eluídas com três cama-volumes de tampão de eluição e amostra da fração eluato (E) para análise de SDS-PAGE foi tirada.
- Imidazol foi removido por diálise contra tampão de eluição fração elevada de sal duas vezes.
- A solução de proteína foi ainda mais concentrada por diálise contra tampão glicerol duas vezes. Em todas as etapas de diálise a relação de tampão para amostra foi de pelo menos 50. Este procedimento resultou em uma solução estoque contendo glicerol HTNCre na concentração usual entre 200 e 450 mM, ou seja, 1 litro de cultura expressão resultará em ~ 12 mg de proteína. Amostra de estoque de glicerol (GS) para SDS-PAGE análise foi coletado. HTNCre solução estoque pode ser armazenado a menos 20 ° C.
Figura 1: SDS-PAGE análise das amostras coletadas durante o processo de purificação da Cre recombinase. Indução da expressão do Cre é indicado por banda dominante na fração de lisado. Embora uma parte da proteína é insolúvel da proteína Cre pode ser enriquecido como visto no eluato e frações de ações glicerol. L: Lysate, I: Insolúvel, S: O sobrenadante, FT: Flow-through, W: E lavar roupa,: eluato, GS: Stock Gylcerol. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.
Transdução de proteína em camundongos-tronco embrionárias (ES) células:
- Células ES carregando uma condicional β-Galactosidase repórter construir cinco foram semeadas como células isoladas usando TrypLE ™ Express para a dissociação de células aderentes. Após 4 a 6 horas as células tinham re-inscritos e meio foi removido.
- Posteriormente as células ES foram incubadas com HTNCre meio contendo por 16 horas.
- Uma quantidade adequada de proteína HTNCre (correspondente a 10 mM) do estoque de glicerol foi diluído em meio ES e posteriormente filtrado estéril (0,22 m).
- Depois de meio de transdução de proteína foi alterado novamente para meio de crescimento normal.
- Depois de dois dias as células foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído 4% (PFA) por 10 minutos.
- Dois aditradicionais etapas de lavagem com PBS foram executados antes de X-Gal coloração foi realizada.
- Células fixadas foram cobertos com uma camada de X-Gal solução de coloração 6 e incubadas durante a noite a 37 ° C.
Resultados representativos:
No dia seguinte solução de coloração X-Gal foi aspirado e as células foram cobertos com uma camada de PBS para a análise de microscopia. 8-10% das células recombinadas pôde ser observado no interior das células ES de camundongos julgado por β-Galactosidase atividade.
