Neste artigo iremos descrever o procedimento para medir coeficientes de difusão usando multi-fotão de recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Vamos começar pelo alinhamento do laser ao longo do caminho óptico para a amostra e determinar os parâmetros adequados experimental, em seguida, continuar gerando e, finalmente, ajuste de curvas de recuperação de fluorescência.
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Artigo de método
Medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de Recuperação Após Fotodegradação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Multi-fluorescência de recuperação após fotodegradação é uma técnica de microscopia utilizadas para medir o coeficiente de difusão (ou parâmetros de transporte análogos) de macromoléculas, e pode ser aplicado tanto
Protocolo
1. Alinhe as ópticas.
O equipamento fundamental para um experimento MP-FRAP incluem: um mode-locked fonte de laser, Cell Pockels (por feixe de modulação), gerador de pulso, dicróicas, lente objetiva, emissão de fluorescência de filtro, tubo fotomultiplicador fechado, e um sistema de gravação de dados (fóton counter e multicanal scaler).
2. Determine poderes monitorar segura.
- Atenuar o laser a um ponto baixo, mas razoável de energia, para a geração de fluorescência da amostra.
- Foco dentro da amostra.
- Definir um contador de fótons para integrar mais de uma escala de tempo muito mais ....
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Discussão
O poder da multi-fotão de recuperação de fluorescência após a fotodegradação reside na sua capacidade de sondar as amostras de espessura, com resolução em 3D. Desde seu desenvolvimento na década de 1990, MP-FRAP foi usado para determinar o coeficiente de difusão (ou parâmetros de transporte análoga) nos corpos celulares, ex vivo fatias grossas de tecido, e no tecido vivo e interstício. Neste artigo, apresentamos os equipamentos necessários para executar uma experiência MP-FRAP, bem como o proc.......
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Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por um Departamento de Defesa Era do Prêmio Acadêmico Hope (No. W81XWH-05-0396) e bolsista da Pew no Prêmio Ciências Biomédicas de Edward B. Brown III.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| laser de Ti:safira | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Célula de Pockels | Conoptics | 350-80 | |
| Microscópio a varredura a laser | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Espelho dicromático de passagem curta | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Tubo fotomultiplicador | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Contador de fótons | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Escalonador/média multicanal | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Gerador de pulsos | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
Referências
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.
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Reimpressões e permissões
