Summary
Bu yazıda, photobleaching sonra çok foton floresan kurtarma kullanarak difüzyon katsayıları ölçmek için prosedür anlatacağız. Biz örnek optik yol boyunca lazer hizalayarak ve uygun deneysel parametrelerin belirlenmesi ile başlayacak, daha sonra devam üreten ve nihayet uydurma floresan kurtarma eğrileri.
Abstract
Photobleaching sonra çok floresan kurtarma makromoleküllerin difüzyon katsayısı (ya da analog ulaşım parametreleri) ölçmek için kullanılan bir mikroskopi tekniği ve hem de uygulanabilir
Protocol
1. Optik hizalayın.
MP-sıkı bağlamak deney için önemli ekipman şunlardır: mod-kilitli bir lazer kaynağı, Pockel Hücre (ışın modülasyon), nabız jeneratör, renk değişikliği, objektif lens, floresan emisyon filtresi, kapılı photomultiplier tüp, ve bir veri kayıt sistemi (foton sayacı ve çok kanallı ölçekleyici).
2. Güvenli monitör yetkilerini belirler.
- Örnek içinde floresan üretmek için düşük, ama makul, güç lazer zayıflatır.
- Örnek içinde odaklanın.
- Beklenen floresan kurtarma daha çok uzun bir zaman ölçeği üzerinde entegre bir foton sayacı ayarlayın. Mikroskop yazılım odak hacmi (bu bir nokta tarama ile elde edilir) numune içinde sabit tutulan makul bir sayıda foton sayımı verileri kaydeder.
- Gücünü artırmak ve foton sayımı verileri başka bir dizi çekmek. Foton sayılarında artış gücünü artırmak açısından önemli ölçüde azaltmak için görünene kadar tekrarlayın.
- Arsa log (güç) bir fonksiyonu olarak log (foton sayısı). Monitör sırasında beyazlatma iki yamacında bir sapma gösterir. Monitörün güç olarak bu cut off bir güç seçin, ancak makul bir sinyal gürültü oranı sağlar.
3. Pulse jeneratör ve çok kanallı ölçekleyici giriş parametreleri belirleyin.
- Belirleyin geri-of-the-zarf edebiyat ve / veya Stokes-Einstein denklemi, difüzyon denklemi dayalı difüzyon katsayısı ve iyileşme süresi tahminleri.
- Darbe jeneratörü ve ölçekleyici gerekli parametre değerleri ayarlayın.
- Darbe jeneratörü, önceden çamaşır suyu ve ağartıcı kez ayarlayın. Başparmak kuralları iyi bir ön-beyazlatıcı beklenen yarısında iyileşme süresi daha 1-2 kat daha büyük olması gerektiğini ve çamaşır suyu beklenen yarısında iyileşme süresi onda biri olmalıdır.
- Ölçekleyici, yaklaşık bir yarım çamaşır suyu süresi bin genişliği ve kayıt başına kutularının sayısını ayarlamak seçtiğiniz bin genişliği ve kayıt başına kutuları ürün beklenen tam iyileşme artı ön yaklaşık eşit veya daha büyük olduğu gibi -Çamaşır suyu ve ağartıcı kez.
- Darbe jeneratörü dönün ve sadece bin genişliği kez kayıt başına kutuların sayısı ürünü ters daha küçük bir değere eşit pre-bleach/bleach/monitor dizisi frekansını ayarlamak. *
- Son olarak, kayıtların sayısını ayarlamak / seçtiğiniz monitör güçte sinyal yoğunluğuna göre ölçekleyici tarama.
* Darbe jeneratör tam bir pre-bleach/bleach/monitor dizisi (1/frequency) için zaman ölçekleyici veri toplama süresi (bin genişlik x kutuları / kayıt) daha fazla olduğu çok önemlidir. Bu kriterleri yerine değilse, birden fazla ağartıcı tetikler ölçekleyici tek bir kayıt içinde görünebilir.
- Monitörün güç, önceden belirlenmiş kabul edilebilir bir seviyeye ayarlayın. Monitör beyazlatma test sırasında belirlenen beyazlatma kesim üzerinde 200 mW veya çamaşır suyu gücünü ayarlayın. Bu güçler PC kristal boyunca farklı gerilim olarak ayarlanır, her ikisi de.
- Mikroskop Seal, ışıkları kapatmak PMT açmak, mikroskop yazılımı üzerinde bir nokta tarama başlamak, sonra darbe jeneratörü ve ölçekleyici başlar.
- 1) ön-bleach floresan, 2) floresan hemen post-çamaşır suyu, ve 3) veri setinin sonunda floresan: eğrisinin çizilmesi ve üç önemli nokta işaretleme çıkan kurtarma eğrisi analiz edin. Floresans değerleri öncesi ve hemen sonrası yarı-iyileşme süresi daha iyi tahmin etmek için çamaşır suyu. Kullanın.
- Yarı-iyileşme süresi, bu tahmin, önceden çamaşır suyu, çamaşır suyu için yeni değerlerini belirlemek için daha önce belirtilen başparmak kuralları ve bin genişliği süreleri kullanın. Ayrıca, tam iyileşme elde etmek için gerekli süreyi daha iyi tahmin etmek için veri kümesinin sonunda öncesi ağartıcı floresan ve floresan kullanın. Genel bir kural olarak, veri, verilerin ikinci yarısı için rapor edilmesi tam iyileşme sağlar bir süre için alınmalıdır.
- Eğrisi güçlü bir çamaşır suyu ve pürüzsüz bir iyileşme sergiliyor kadar darbe jeneratörü ve ölçekleyici parametrelerini ayarlayın, yeni bir eğri parametreleri almak ve ince ayar devam. Mümkünse, çamaşır suyu süresi göz önünde bulundurun ve başparmak kural altına düşürülmelidir. Çok sığ, ya da çok derin, çamaşır suyu elde edilir, çamaşır suyu gücü de ayarlanabilir.
4. Test uyarım doygunluk.
- Önceden belirlenmiş uygun monitör ve çamaşır suyu güçler, MP-sıkı bağlamak eğrilerini kullanarak, bir dizi alır. Uygun matematiksel formu ve doğrusal olmayan en küçük kareler uydurma algoritması (bkz. aşağıdaki "Veri Analizi") kullanarak, ön ağartıcı floresan normalize her kurtarma, analiz edin. Çamaşır suyu derinliği parametre monte değeri kaydedin.
- MP-sıkı bağlamak eğrileri birbirini izleyen seriler alma ve analiz çamaşır suyu güç değerlerini artırarak devam edin.
- Arsa log (güç) bir fonksiyonu olarak log (çamaşır suyu derinliği parametresi). Herhangi bir sapma, bir yamaç iki uyarma doygunluk gösterir. Güçlü bir çamaşır suyu verimi çamaşır suyu güç seçin, ancak doygunluk neden olmaz.
5. MP-sıkı bağlamak eğrileri çekmeye devam edin.
- Yukarıdaki gibi, bütün parametreler düzgün koyacaktır, eğriler çekmeye devam edin.
6. Veri Analizi.
- Floresan veri öncesi, çamaşır suyu ve ağartıcı veri, bu veri seti ve ayarlamak kaldırın t = 0 hemen sonrası-ağartıcı floresan değeri ile karşılık gelir.
- -Bleach öncesi ortalama floresan açısından ortaya çıkan floresan kurtarma Normale.
- Uygun bir matematiksel model ve MATLAB lsqcurvefit fonksiyonu olarak doğrusal olmayan, en küçük kareler uydurma algoritması kullanılarak normalize eğrisi sığdır. Burada sunulan model, difüzyon ve konvektif akışı hem de etkilemiş floresan kurtarma hesapları:
F o ön ağartıcı ortalama floresan nerede çamaşır suyu derinliği parametresi, β, τ D karakteristik uzadıya iyileşme süresi, R eksenel radyal (w r) genişlikleri karesine oranı (w z) iki foton odak hacmi, τ vx = w r / v x, τ Vy = w r / v y τ vz = w, z / v z ve v 2 = v x 2 + v y 2 + v, z 2- konvektif akış hızı. Görüntü düzlemi ile sınırlı akışı için, τ vz → ∞ ve 1 / τ vx + 1 / τ Vy 1 / τ vr ile değiştirilebilir. Konvektif akışının olmaması, pay hem de üsteller 1 gidip ifade sadece iki uydurma parametreleri, β ve τ D büyük ölçüde azaltılmış oluyor . Difüzyon katsayısı D = w r 2 / 8τ D olarak kolayca hesaplanır.
7. Temsilcisi Sonuçlar.
Şekil 1 Temsilcisi çamaşır suyu ve FITC-BSA için kurtarma eğrisi. Iyi bir iyileşme eğrisi verilerin ikinci yarısında tam bir iyileşme floresan ile, güçlü bir çamaşır suyu ve pürüzsüz bir iyileşme sergiliyor.
Şekil 2 FITC-BSA Normalize kurtarma eğrisi (kırmızı) ve en küçük kareler ilgili uyum (siyah). Bu uyum, literatür ile tutarlı, difüzyon katsayısı, 52.9 um2 / s verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Photobleaching sonra çok foton floresan kurtarma gücü 3D çözünürlük ile kalın örnekleri prob yeteneği yatıyor. 1990 yılında gelişme bu yana, MP-sıkı bağlamak hücre gövdeleri, ex vivo kalın bir doku dilimleri ve in vivo doku ve interstisyumda difüzyon katsayısı (ya da analog ulaşım parametreleri) belirlemek için kullanılır olmuştur. Bu makalede, biz, deneysel parametreler ayar verileri alma ve kurtarma eğrileri analiz, MP-sıkı bağlamak gibi deney, ışın yolu hizalamak için uygun bir prosedür çalıştırmak için gerekli ekipman sundu.
Uygun bir dalgaboyu ve emisyon filtresi seçimler iki foton kesitler ve emisyon spektrumları tarafından yönlendirilmelidir. Bu bilgiler genellikle, çeşitli boyalar için teknik veriler ile birlikte. Ayrıca, lazer ışınının hizalayarak, bu amaç arka lens uygun doldurulmasını elde edilmesi önemlidir. Bu genellikle bir ışın optik sistem genişletici ekleyerek gerçekleştirilir. Uygun doldurulmasını eksenel ve radyal yönlerde hem de alt çözünürlüklü sabit floresan boncuk tarama ve sonra komplo ve literatür değerleri ile karşılaştırılması için 1 / e 2 farklı genişlik bulmak için Gauss için floresan profilleri montajı tarafından kontrol edilebilir.
Uygun izleme ve ağartma güçler seçmek için de önemlidir. Güç izlemek için kullanılan floresan öncesi ve sonrası çamaşır suyu iyi bir sinyal-gürültü oranı için izin yeterince yüksek ağartma kayda değer yol açmayacak kadar düşük olması, ama. Ağartma güç uyarma doygunluk kaçınmak gerekir. MP-sıkı bağlamak deneyde örnek güç olay karesi ile orantılı olan floresan uyarma oranı, bir üst limit vardır. Bu sınır, ikaz doygunluğu rejiminin başlangıç işaretleri. Uyarma doygunluk rejimi faaliyet ağartıcı yetkilerini kullanarak üretilen Floresan kurtarma eğrileri yanlışlıkla düşük difüzyon katsayıları verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Umut Scholar Ödülü Savunma Era Bölümü (No W81XWH-05-0396) ve Edward B. Brown III Biyomedikal Bilimler Ödülü Pew Scholar tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
