$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
A. Microfabricação de 3 camadas dispositivo perifusion microfluídicos
Bem fundo Mestre Protocol (150 mM poços profundos)
- Limpe o wafer usando uma lâmina de barbear, se necessário. Limpe com acetona, metanol, e IPA. Realizar o tratamento de plasma de 50 Watts por 30 s.
- Spin-SU8-100 @ 2000 rpm. [Passo 1: 500 rpm, 10 s, 100 Passo rpm / s, 2: 2000 rpm, 30 s, a 300 rpm / s].
[NOTA: Não segure o wafer com uma pinça, após girar SU8] - Bake mole do wafer a 65 ° C por 20 min e aos 95 ° C por 50 min.
- O wafer é exposto à luz UV através de uma máscara desejada. Dose para 150 M de altura é de 650 mJ / cm 2.
- Pós-exposição assar o wafer de 65 ° C por 1 min e em 95 ° C por 12 min.
- Desenvolver o wafer em SU8 desenvolvedor por 15 min.
Microcanais Mestre Protocol (500 mm poços profundos)
- Limpe o wafer usando uma lâmina de barbear, se necessário. Limpe com acetona, metanol, e IPA. Realizar o tratamento de plasma de 50 Watts por 30 s.
- Spin-SU8-2150 @ 1000 rpm. [Passo 1: 500 rpm, 10 s, 100 Passo rpm / s, 2: 1000 rpm, 30 s, a 300 rpm / s].
- Bake mole do wafer a 65 ° C por 15 min e aos 95 ° C durante 2 horas e 30 min.
- O wafer é exposto à luz UV através de uma máscara desejada. Dose de exposição para 650 M de altura é de 685 mJ / cm 2.
- Pós-exposição assar o wafer de 65 ° C por 5 min e em 95 ° C por 35 min.
- Desenvolver o wafer em SU8 desenvolvedor por 20-30 min.
PDMS preparação da solução
- Polidimetilsiloxano solução (PDMS) é preparado através de uma profunda mistura de 10 partes de elastômero de silicone com 1 parte de agente de cura de um kit Sylgard padrão 184.
- As bolhas geradas na solução PDMS durante o processo de mistura são removidas usando um exsicador de vácuo.
- A bolha sem solução PDMS é lentamente dispensada na SU8 mestres e uma placa de Petri vazia para a terceira camada.
- A temperatura da placa quente é definido como 75 ° C ea PDMS é curado a esta temperatura durante 2 horas
- Entradas, saídas e poços de câmbio são socou para fora usando o furador de tamanho apropriado.
- As camadas são unidas em uma lâmina de vidro (mm tamanho 0.1) usando um dispositivo handheld plasma.
B. configuração Experimental
- Fluxo de etanol 70% através do dispositivo de micro-para esterilizar. DI fluxo de água para lavar o etanol. Perfundir 50 ml de BSA 0,5% através do dispositivo para evitar adsorção não específica de insulina para as paredes de microcanais.
- O gradiente de rampa de glicose e outros relacionados com gradientes gerados pelo software LabView que se comunica com a seringa bombas são testadas para garantir que a gradientes são estáveis.
- 25-30 ilhotas ratos foram incubados com 5 Fura-2/AM M (um indicador de cálcio, sondas moleculares, CA) e 2,5 mM Rodamina 123 (Rh123, um indicador de potencial mitocondrial, Sigma, MO) por 30 min a 37 ° C em Krebs-Ringer buffer (KRB) contendo 2 mM de glicose
- As ilhotas ratos são cuidadosamente pipetados dispositivo perifusion microfluídicos através da porta de entrada.
- A rede de microfluídica é, então, configuração, ligando à entrada das bombas de seringa usando tubos Tygon e um conector Y ea saída para coletor de fração. O dispositivo fica em um estágio de aquecimento (37 ° C) no microscópio e do tubo de admissão é aquecida numa placa de aquecimento para manter a temperatura da câmara e uma solução a 37 ° C.
- Imediatamente após a instalação, as ilhotas ratos são perifused com KRB contendo 2 mM de glicose por 10 min e, em seguida uma rampa de glicose (2mM 25mM) por 25 min.
- Lapso de tempo imagens são coletadas e analisadas a cada 15 s por software SimplePCI. O perifusate também é coletado a cada minuto através de um coletor de frações para analisar a secreção de insulina utilizando ELISA kit.
Resultados representante
Ilhotas de rato foram perifused com um gradiente linear de 2-25 mM de glicose. Conforme mostrado na Figura 1, o influxo de cálcio e secreção de insulina são desencadeados após cerca de 13 minutos de perifusion, correspondendo a 6 mM de glicose. Mudanças no potencial mitocondrial são vistos anteriormente como esperado, em cerca de 11 minutos. Estes dados demonstram a vantagem de usar esta rede microfluídicos para caracterizar ilhota fisiologia.
Figura 1. Respostas fisiológicas de estimulação das células da ilhota.