A Multi-Parametric Sistema Perifusion Islet dentro de um dispositivo Perifusion microfluídicos

Resumo

Um dispositivo perifusion microfluídicos ilhota foi desenvolvido para a avaliação dinâmica da secreção de insulina de ilhotas múltiplo e imagens de fluorescência simultânea de influxo de cálcio e mitocondrial possíveis mudanças.

Resumo

Um dispositivo perifusion microfluídicos ilhota foi desenvolvido para a avaliação dinâmica da secreção de insulina de ilhotas múltiplo e imagens de fluorescência simultânea de influxo de cálcio e mitocondrial possíveis mudanças. O dispositivo consiste de três camadas: a primeira camada contém uma matriz de microescala poços (500 mm e diâmetro de 150 profundidade mm) que ajudam a imobilizar o ilhotas enquanto expostos a fluxo e maximizar a área de superfície exposta das ilhotas, a segunda camada contém uma circular perifusion câmara (3 mm de profundidade, 7 mm de diâmetro), ea terceira camada contém um canal de entrada de mistura que os fãs antes de injeção na câmara perifusion (2 mm de largura, 19 mm de comprimento e 500 mm de altura) para otimizar a eficiência de mistura antes de entrar na câmara de perifusion. A criação de gradientes de glucose diversos, incluindo uma linear forma de sino, e formas quadradas também podem ser criados na rede perifusion microfluídicos e é demonstrada.

Protocolo

A. Microfabricação de 3 camadas dispositivo perifusion microfluídicos

Bem fundo Mestre Protocol (150 mM poços profundos)

1. Limpe o wafer usando uma lâmina de barbear, se necessário. Limpe com acetona, metanol, e IPA. Realizar o tratamento de plasma de 50 Watts por 30 s.
2. Spin-SU8-100 @ 2000 rpm. [Passo 1: 500 rpm, 10 s, 100 Passo rpm / s, 2: 2000 rpm, 30 s, a 300 rpm / s].
   [NOTA: Não segure o wafer com uma pinça, após girar SU8]
3. Bake mole do wafer a 65 ° C por 20 min e aos 95 ° C por 50 min.
4. O wafer é exposto à luz UV através de uma máscara desejada. Dose para 150 M de altura é de 650 mJ / cm ^2.
5. Pós-exposição assar o wafer de 65 ° C por 1 min e em 95 ° C por 12 min.
6. Desenvolver o wafer em SU8 desenvolvedor por 15 min.

Microcanais Mestre Protocol (500 mm poços profundos)

1. Limpe o wafer usando uma lâmina de barbear, se necessário. Limpe com acetona, metanol, e IPA. Realizar o tratamento de plasma de 50 Watts por 30 s.
2. Spin-SU8-2150 @ 1000 rpm. [Passo 1: 500 rpm, 10 s, 100 Passo rpm / s, 2: 1000 rpm, 30 s, a 300 rpm / s].
3. Bake mole do wafer a 65 ° C por 15 min e aos 95 ° C durante 2 horas e 30 min.
4. O wafer é exposto à luz UV através de uma máscara desejada. Dose de exposição para 650 M de altura é de 685 mJ / cm ^2.
5. Pós-exposição assar o wafer de 65 ° C por 5 min e em 95 ° C por 35 min.
6. Desenvolver o wafer em SU8 desenvolvedor por 20-30 min.

PDMS preparação da solução

1. Polidimetilsiloxano solução (PDMS) é preparado através de uma profunda mistura de 10 partes de elastômero de silicone com 1 parte de agente de cura de um kit Sylgard padrão 184.
2. As bolhas geradas na solução PDMS durante o processo de mistura são removidas usando um exsicador de vácuo.
3. A bolha sem solução PDMS é lentamente dispensada na SU8 mestres e uma placa de Petri vazia para a terceira camada.
4. A temperatura da placa quente é definido como 75 ° C ea PDMS é curado a esta temperatura durante 2 horas
5. Entradas, saídas e poços de câmbio são socou para fora usando o furador de tamanho apropriado.
6. As camadas são unidas em uma lâmina de vidro (mm tamanho 0.1) usando um dispositivo handheld plasma.

B. configuração Experimental

1. Fluxo de etanol 70% através do dispositivo de micro-para esterilizar. DI fluxo de água para lavar o etanol. Perfundir 50 ml de BSA 0,5% através do dispositivo para evitar adsorção não específica de insulina para as paredes de microcanais.
2. O gradiente de rampa de glicose e outros relacionados com gradientes gerados pelo software LabView que se comunica com a seringa bombas são testadas para garantir que a gradientes são estáveis.
3. 25-30 ilhotas ratos foram incubados com 5 Fura-2/AM M (um indicador de cálcio, sondas moleculares, CA) e 2,5 mM Rodamina 123 (Rh123, um indicador de potencial mitocondrial, Sigma, MO) por 30 min a 37 ° C em Krebs-Ringer buffer (KRB) contendo 2 mM de glicose
4. As ilhotas ratos são cuidadosamente pipetados dispositivo perifusion microfluídicos através da porta de entrada.
5. A rede de microfluídica é, então, configuração, ligando à entrada das bombas de seringa usando tubos Tygon e um conector Y ea saída para coletor de fração. O dispositivo fica em um estágio de aquecimento (37 ° C) no microscópio e do tubo de admissão é aquecida numa placa de aquecimento para manter a temperatura da câmara e uma solução a 37 ° C.
6. Imediatamente após a instalação, as ilhotas ratos são perifused com KRB contendo 2 mM de glicose por 10 min e, em seguida uma rampa de glicose (2mM 25mM) por 25 min.
7. Lapso de tempo imagens são coletadas e analisadas a cada 15 s por software SimplePCI. O perifusate também é coletado a cada minuto através de um coletor de frações para analisar a secreção de insulina utilizando ELISA kit.

Resultados representante

Ilhotas de rato foram perifused com um gradiente linear de 2-25 mM de glicose. Conforme mostrado na Figura 1, o influxo de cálcio e secreção de insulina são desencadeados após cerca de 13 minutos de perifusion, correspondendo a 6 mM de glicose. Mudanças no potencial mitocondrial são vistos anteriormente como esperado, em cerca de 11 minutos. Estes dados demonstram a vantagem de usar esta rede microfluídicos para caracterizar ilhota fisiologia.

Figura 1. Respostas fisiológicas de estimulação das células da ilhota.

Discussão

Sistemas tradicionais de ilhotas perifusion (macroescala e microescala) tem algumas limitações, incluindo complexo de configuração e design, alta requisitos técnicos, e dificuldade para criar gradientes usuário prescritos química no sistema. O sistema perifusion microfluídicos descritas aqui supera estas limitações com geometria simples de projeto e fabricação. Mais importante, este sistema pode ser integrado com abordagem imagens de fluorescência que fornecem como uma ferramenta única para estudar a fisiologia das ilho...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringas de 60 ml	BD Biosciences
Corante fluorescente Fura-2	Molecular Probes, Life Technologies
Corante fluorescente Rodamina123	Molecular Probes, Life Technologies
Glicose	Sigma-Aldrich
Albumina Sérica Bovina	Sigma-Aldrich
Tubos de silicone de 30"	Cole-Parmer		1/16 x 1/8 pol.
Tubos Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Scientific
Conectores em Y	Cole-Parmer		1/16” & 4 mm
Conectores para seringas	Cole-Parmer		tampão luer fêmea 1/16”
Conectores retos	Cole-Parmer		1/16”
Conector cotovelo	Cole-Parmer		1/16”
Bomba de seringa Havard	Harvard Apparatus
Dispositivo de perifusão
Placa aquecedora	PMC
Termômetro	Omega Engineering, Inc.
Colecionador de frações	Gibson
Pipetador	Fisher Scientific
Microscópio invertido de epifluorescência	Olympus Corporation	IX71
Dispositivo acoplado à carga	QImaging		Retiga-SRV, Fast 1394