Protocolo de Lise automatizado microfluídicos de sangue para Enriquecimento de células nucleadas circulantes

Resumo

Um dispositivo automático microfluídicos foi desenvolvido para a circulação de enriquecimento de células nucleadas do sangue periférico, através de lise de eritrócitos que garante o isolamento de amostras de alta qualidade sem perda de células.

Resumo

Neste relatório, o protocolo para um dispositivo de lise microfluídicos sangue automatizado é detalhado. Circulantes de células nucleadas (CNCs), incluindo leucócitos e células endoteliais, fornecem a plataforma ideal para um status atualizado sobre o estado imunológico de um indivíduo. O protocolo permite microfluídicos para o enriquecimento de CNCs sem perda seletiva de células e preparação de amostras a variabilidade devido ao usuário mediada por etapas. Resumidamente, o protocolo inclui a fabricação de dispositivos, coleta de amostras, a configuração de dispositivos e executando o sangue através da câmara microfluídicos. Dentro do dispositivo de sangue total é rapidamente misturada com água deionizada por cerca de 10 segundos em um x 50 150 micron micron canais microfluídicos. Neste tempo eritrócitos são lisados ​​período devido às condições hipotônica. Estruturas de espinha de peixe na parte inferior do canal de garantir a mistura completa e exposição de células a um ambiente constante. Células restantes são devolvidos às condições isotônicas na saída do dispositivo, fixa usando paraformaldeído 2%, centrifugado para separar fragmentos de eritrócitos de CNCs, e suspenso em tampão de fluxo para a coloração e análise por citometria de fluxo. Os resultados mostram limpa fluxo parcelas citometria de dispersão com populações CNC salvo. Importância deste dispositivo e protocolo vem no estudo e compreensão da patogênese da doença através da análise de populações CNC. Por isso, a automação, a eficácia ea simplicidade do protocolo microfluídicos são demonstradas.

Protocolo

Parte 1. Fabricação de dispositivos microfluídicos

Um molde mestre de silício do dispositivo lise microfluídicos foi criado usando técnicas de fotolitografia com o equipamento na Universidade de Louisville salas limpas [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) foi utilizado para gerar uma máscara de transparência (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) para criar réplicas negativas dos canais. O dispositivo foi fabricado lise microfluídica do molde mestre de silício usando técnicas litográficas suaves com o elastômero poli (dimetilsiloxano) (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). O elastômero com os canais replicado foi lançado, e orifícios de acesso do canal foi perfurado com uma agulha de calibre 20 (peças pequenas, Miramar, FL.). O wafer PDMS foi irreversivelmente ligado a uma lâmina de vidro por meio de plasma de oxigênio e testado para a experimentação.

Parte 2. Protocolo para a execução de dispositivo de lise

Após o dispositivo micro foi fabricado e testado, experimentos com a lise de eritrócitos está pronto para começar. A seção seguinte detalha o protocolo para o dispositivo microfluídicos.

2,1 de Coleta de Amostras

1. Coletar quatro mililitros de amostra de sangue da veia cubital mediana, na veia do antebraço anterior do paciente com heparina como anticoagulante em dois 2 ml verde vaccutainers topo.
2. Descartar tubo ml 2 primeiros, pois contém desalojado madura células endoteliais (falsos positivos).
3. Ressuspender o segundo tubo para misturar heparina com sangue girando para cima e para baixo; salvar imediatamente em gelo.
4. Transferir 1 ml de sangue para um tubo Eppendorf 1,5 ml. Processo a amostra de sangue imediatamente (dentro de uma hora da coleta).

2,2 dispositivo Prime microfluídicos com PBS

1. Obter um dispositivo micro ligado ao vidro. Pressione-fit tubo de acesso (peças pequenas, Miramar, FL) de diâmetro ligeiramente maior nas entradas e saída (Figura 1).
2. Coloque uma agulha de seringa de calibre 30 (peças pequenas, Miramar, FL) para o tubo em cada uma das entradas, proporcionando a macro para fazer a interface micro.
3. Encha uma seringa de 1 ml com PBS 1X e certifique-se de se livrar de bolhas sacudindo a agulha da seringa. Conecte o PBS-carregados seringa de 1 ml para uma entrada no dispositivo microfluídicos. Empurre a seringa contendo o PBS 1X suavemente com a mão até que a solução sai de entrada 2, e logo em seguida braçadeira de entrada 2, com um clipe de padrão Office Binder
4. Continue empurrando o PBS 1X até que o fluido alcança a porta de saída do dispositivo de microfluídica. Uma vez que a solução flui para fora da tomada, apertar o tubo de saída com outro clipe de ligante.
5. Continue empurrando a seringa de 1 ml até o PBS 1X fluxos de entrada de três, e prenda a porta de entrada 3 com outro clipe Office Binder. O dispositivo microfluídica está agora completamente ferrado.

Figura 1. Esquemática do dispositivo mostrando as entradas para suas respectivas soluções e tomada.

2,3 Preparação de bombas de seringa e solução

1. Para calibrar as bombas siga estes passos:
   1. Para a bomba de seringa grande Harvard (Harvard, PHD Parte 22/2000 # 702000): Define a configuração de diâmetro para 22,5 mm, taxa de fluxo de 600 mL / min.
   2. Para a bomba de seringa pequena Harvard (Harvard, Pico Mais Part # 702213): Define a configuração de diâmetro para 4,61 mm, vazão 20 l / min.
2. Preencher uma seringa 30 ml com água deionizada estéril. Isso pode ser feito retirando a solução diretamente do tubo de 50 ml. (Label a seringa)
3. Encher uma seringa ml segundo 30 com 2X tampão fosfato-salina (PBS) paraformaldeído a 2% (PFA), utilizando o procedimento descrito no passo 9. (Label a seringa)
4. Encha uma seringa com 1 ml de 1X PBS a partir do alíquotas armazenadas na 15 ml tubos cônicos, utilizando o procedimento descrito no passo 9.
5. Conecte o 30 ml seringa água deionizada para entrada de 2 e os 30 ml PBS 2X seringa para entrada de 3 (certifique-se de don t armadilha bolhas na tubulação ou outro dispositivo de microfluídica). Retire o grampo de entradas 2 e 3 ea tubulação de saída. Conecte o 1X PBS ml 1 seringa na entrada da 1. Evitar a introdução de bolhas, preenchendo a agulha da seringa com líquido, que liga a seringa, e sacudindo a agulha da seringa para livrar de bolhas.

2,4 lise eritrocitária

1. Conjunto de todas as seringas nas bombas adequada Harvard, conforme descrito abaixo:
   1. Definir as duas seringas 30 ml (uma contendo estéreis, a água de-ionizada e outro com PBS 2X, PFA 2%) juntos na bomba de seringa grande Harvard.
   2. Coloque a seringa de 1 ml (contendo 1X PBS) na bomba pequena seringa Harvard.
   3. Coloque a tubulação de saída em um coletor de resíduos (50 ml tubo cônico que é rotulado waste).
2. Ligue a bomba de seringa grande Harvard (com 30 seringas ml) e deixá-lo correr durante um minuto. (Certifique-se que não há bolhas e nenhum vazamento no aparelho ou na tubulação).
3. Ligue a bomba pequena seringa Harvard e deixá-lo correr por mais um minuto. (Certifique-se que não há bolhas e nenhum vazamento no aparelho ou na tubulação). Parar as bombas. O dispositivo microfluídica está agora pronto para ser usado.
4. Remova a seringa de 1 ml contendo 1X PBS a partir da pequena bomba de seringa Harvard.
5. Depois de obter uma amostra de sangue, preencher a seringa de 1 ml com 0,05 ml de 1X PBS estéril, sem quaisquer bolhas de interceptação. Em seguida, encha a seringa com 0,5 ml de sangue obtidas do tubo Eppendorf. (A seringa de 1 ml conterá agora um volume final de 0,55 ml do sangue e tampão 1X PBS.) Nota: Manter a seringa vertical enquanto enchimento para evitar a mistura de 0,05 ml de PBS com o sangue.
6. Conectar a seringa contendo o sangue para uma entrada e montar a seringa com cuidado (não empurrar o sangue através do tubo para dentro do dispositivo) na bomba pequena seringa Harvard (a seringa é montado verticais na bomba).
7. Remova o tubo de saída do tubo de descarga e colocar um tubo de centrífuga de 50 ml limpa em seu lugar e defini-lo em um balde de gelo.
8. Ligue a bomba de seringa grande Harvard em primeiro lugar e deixá-lo correr por 1 minuto. Começar a recolher a amostra da saída para o tubo de centrifugação de 50 ml.
9. Ligue a bomba pequena seringa Harvard.
10. Uma vez que a amostra de sangue na seringa de 1 ml foi completamente percorrido através do dispositivo, pare de ambas as bombas. Isso deve demorar aproximadamente 20 minutos.
11. Centrifugar a amostra coletada durante 5 minutos a 350 xg à temperatura ambiente com o off freio.
12. Remover o sobrenadante, colocando a ponteira no lado oposto do pellet branco. Remover o máximo possível sobrenadante restos celulares, especialmente vermelho, sem perturbar o sedimento branco.
13. Ressuspender a amostra em 1 ml de tampão de fluxo (1X PBS, 1% BSA [soro albumina bovina], 2% PFA) pipetando cima e para baixo. Transferência de amostra para um tubo Eppendorf 1,5 ml.
14. Microcentrífuga a amostra coletada durante 5 minutos a 4 xg à temperatura ambiente. Use mesma precisão de antes de remover o sobrenadante.
15. Ressuspender a amostra em 1 ml de tampão de fluxo em vórtice.

2.5 Preparação para a análise de citometria de fluxo

1. Para análise de amostras por citometria de fluxo, adicione 100 ml de amostra para um tubo de citometria de fluxo.
2. Para o 100 mL de amostra adicionar anticorpo específico (garantir a concentração correta).
3. Deixar a amostra para incubar por 30 minutos a 40 C.
4. Lavar duas vezes com tampão de fluxo antes de citometria de fluxo. Etapa de lavagem inclui a adição de 250 L de tampão de fluxo, vortex, centrifugação por 5 minutos em 350 xg, e remover o sobrenadante com uma volta de fluido do tubo de citometria de fluxo.
5. Ressuspender o sedimento em 250 mL de tampão de fluxo. Amostra está pronta para análise por citometria de fluxo.

Resultados representante

Sangue total foi executada através do dispositivo lise microfluídicos e pós-processamento de protocolo, livrando de eritrócitos circulantes e enriquecendo as células nucleadas (CNCS). Resultados ideais renderá um limpa fluxo gráfico de dispersão com citometria de populações separadas CNC. Exibido abaixo nas figuras 2 e 3 são comparações de dispersão de uma amostra de sangue total sem lise de hemácias e com a lise de eritrócitos pelo protocolo microfluídicos com machados como dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC) da luz. Pode ser visto que o protocolo de enriquecimento microfluídicos é necessário obter uma limpeza fluxo gráfico de dispersão citometria.

Figura 2. Fluxo gráfico de dispersão citometria de amostra de sangue total sem lise de eritrócitos com FSC e SSC eixos.

Figura 3. Fluxo gráfico de dispersão citometria de circulação de células nucleadas com lise de eritrócitos microfluídicos rotulado por populações com FSC e SSC eixos. Região 1 (vermelho) representa linfócitos, Região 2 (verde) representa monócitos, Região 3 (azul) representa granulócitos e Região 4 (roxo) ainda não foi caracterizado.

Remoção de detritos de células vermelhas, com uma pipeta no protocolo também é importante quando for necessário. Abaixo na Figura 4 é um gráfico de dispersão mostrando um excedente de restos de glóbulos vermelhos. Apesar de não nublando o gráfico de dispersão como na Figura 2, deve-se conta para os eventos adicionados devido a restos de hemácias durante a análise de dados.

Figura 4. Fluxo gráfico de dispersão citometria representando restos de glóbulos vermelhos, vistos como um clusterde eventos na Região 5 (cyan).

Células de coloração para os marcadores determinado fenótipo de anticorpos também irá gerar resultados característica. Nas Figuras seguintes são manchas de anticorpos fenótipo por 3 populações de leucócitos distintas: linfócitos, monócitos e granulócitos. Figura 5 representa as populações de linfócitos plotados com machados CD3 e CD4. Monócitos e granulócitos são mostrados nas Figuras 6-7 com eixos como FSC contra CD14 e CD66b, respectivamente.

Figura 5. Fluxo gráfico de dispersão representando citometria de linfócitos com CD3 e CD4 eixos.

Figura 6. Fluxo gráfico de dispersão representando citometria de monócitos com FSC e CD14 eixos.

Figura 7. Fluxo gráfico de dispersão representando citometria de granulócitos com FSC e machados CD66b.

Discussão

Um protocolo de lise automatizado microfluídicos de sangue tem sido relatado. No âmbito do protocolo são passos críticos dignos de nota. Na seção P.2.1, é importante para descartar o frasco de sangue coletadas primeira vez que a amostra contém células endoteliais desalojado madura agindo como falsos positivos. Certifique-se também para executar o amostra de sangue dentro de uma hora da coleta. Priming o dispositivo microfluídicos na seção p.2.2, é importante inicialmente livrar das bolhas. Além disso, deve-se evitar a i...